聚乙二醇在植物滲透脅迫生理研究中的應用

植物生理學(xué)通訊第40卷 第3期，2004年6 月361聚乙二醇在植物滲透脅迫生理研究中的應用張立軍樊金娟'阮燕曄1關(guān)義新2'沈陽(yáng)農業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，沈陽(yáng)110161; 2中國農業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，北京100081Application of Polyethylene Glycol in the Study of Plant Osmotic StressPhysiologyZHANG Li~Jun", FAN Jin~Juan', RUAN Yan-Ye', GUAN Yi-Xin2'ollege of Biological Science and Technology. Shenyang Agriculural Universit, Shenyang 1161:1nstinte of Crop Bredingand Cultivation, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Bejing 100081提要介紹聚二醇(PEG)在調節培養液和固體培養基水勢以及在水分脅迫和鹽脅迫研究中的應用及應注意的問(wèn)題，并介紹PEG溶液水勢的測定方法和水勢計算公式.關(guān)鍵詞聚乙二醇;植物;滲透脅迫;水勢計算.植物在生長(cháng)發(fā)育過(guò)程中，經(jīng)常會(huì )遇到由干旱大分子的質(zhì)量!)，以及促進(jìn)種子萌發(fā)4-61等。和高鹽引起的滲透脅迫。受到滲透脅迫的植物脫2 PEG水分滲透脅迫研究中的應用水，細胞膨壓?jiǎn)适?，對植物產(chǎn)生許多不利效應:在研究植物對干早和高鹽的反應時(shí)需要低水發(fā)育受抑，生產(chǎn)力降低，甚至死亡。長(cháng)期以來(lái)，勢處理。-般的做法是減少土壤或其它固體培養人們一直想通過(guò)揭示滲透脅迫傷害機理，尋找提基的水分供應，但在整個(gè)實(shí)驗期間很難保持水勢高植物抵抗脅迫能力的途徑。但在研究過(guò)程中常的恒定和一致。而且有些試驗，例如要求嚴格控為一些客觀(guān)因素所困擾:-是 土壤的組分非常復制培養基水勢、需要在短時(shí)間內使植物體達到較雜，作為實(shí)驗系統常難以控制:二是有時(shí)難以將低水勢、在實(shí)驗過(guò)程中需要進(jìn)行放射性標記的實(shí)滲透脅迫效應與土壤系統中的其它脅迫效應有效區驗不適合用固體培養基培養植物，而用液體培養分開(kāi)。因此，在植物滲透脅迫生理研究中，實(shí)則較為合適。此外，在觀(guān)察滲透脅迫對植物根系驗能否在一個(gè)穩定而易于控制的模擬系統中進(jìn)行就生長(cháng)和形態(tài)變化的影響時(shí)，溶液培養也有較大的顯得十分重要。聚乙二醇(polyethylene glycol,優(yōu)勢。PEG)溶液培養則是人們在進(jìn)行植物滲透脅迫研究2.1 PEG溶液培養的特點(diǎn)及應用用溶液培養對植中一個(gè)常用而比較理想的系統。物進(jìn)行滲透脅迫時(shí)，需要調節培養液的水勢。如1PEG的性質(zhì).果單從調節水勢的角度考慮，無(wú)機鹽、小分子的PBG是乙醇聚合物，分子式為HOCH2 -[CH-糖、 醇等都可以選用。但對土壤干旱來(lái)說(shuō)，不0- CH2]. - CH2OH，分子量有200~20 000不等。僅要使植物的細胞脫水，而且還要使細胞壁脫常見(jiàn)商品的分子量在200~8 000之間，pH 5~7,溶水。因此，模擬土壤干旱的滲透物質(zhì)，其分子于水，也溶于大多數有機溶劑。隨著(zhù)分子量的增量要足夠大，才能不透過(guò)細胞壁，產(chǎn)生與土壤干大，PEG 的物理性質(zhì)也隨之變化，從無(wú)色無(wú)味的旱相同的脫水效應。如果滲透調節物質(zhì)透過(guò)細胞液體變?yōu)橄灎罟腆w。由于PEG的性質(zhì)特殊，在很壁，甚至透過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞內部，被代謝或產(chǎn)多行業(yè)中都有廣泛的用途。如橡膠、紡織、金生其它效應，將會(huì )使研究的問(wèn)題復雜化。屬等行業(yè)中用作水溶性潤滑劑、軟化劑、不飽和Greenway”對液泡化和非液泡化的玉米組織進(jìn)行滲樹(shù)脂等。PEG分子有非離子化的長(cháng)鏈，化學(xué)性質(zhì)透脅迫時(shí)，發(fā)現復水后液泡化組織的代謝物外滲不活潑川，對生物的毒性很小，所以也應用于制速率訊迪增士，而非滴泊化的細糾織內含物外滲只藥業(yè)、化妝品業(yè)和醫療中。在生物科學(xué)研究中中國煤化工PEG也有廣泛的應用。例如，PEG用于介導細胞JYHCNMH G,融合、DNA轉移，分離生物大分子42和測定生物B-mail: ljzhang@sya.cdu.cn, Tel: 024-88443713362植物生理學(xué)通訊第40卷 第3期，2004年6月有輕微的增加。因此，溶質(zhì)是否能夠透過(guò)細胞壁些物質(zhì)不適合較長(cháng)時(shí)間的滲透脅迫實(shí)驗119。PEG對植物細胞的效應是不同的8。PEG可作為滲透可以應用于長(cháng)時(shí)間的植物滲透脅迫實(shí)驗，但在配調節物質(zhì)9。實(shí)驗表明，分子量在6 000及6000制培養基的過(guò)程中，如果將PEG直接加入培養基以上的PEG不能透過(guò)細胞壁。當細胞置于低水勢中會(huì )干擾瓊脂糖凝固，從而限制PEG在固體培養溶液中，細胞內水分流出，細胞體積變小，如植物的滲透脅迫生理研究中的應用。Linossier 等201果溶質(zhì)的分子量很小，可以透過(guò)細胞壁，則會(huì )引在研究PEG和脫落酸對橡膠樹(shù)(Hevea brasisliesis)起質(zhì)壁分離(plasmolysis);如果溶質(zhì)的分子量很大，體細胞胚發(fā)育的影響時(shí)， 向培養基中加入75、 140不能透過(guò)細胞壁，水分的移出則會(huì )使細胞發(fā)生塌和178 g:L'的PEG3350溶液(其水勢分別相當于陷(cyorrhysi)。Carpita 等101用溶質(zhì)分子量不同的58、174 和290 mmol:L"1的蔗糖溶液),在制備培溶液處理活體細胞時(shí)發(fā)現，甘露醇、PEG2000 引養基時(shí)，將上述濃度濃縮1倍，在120C下滅菌起質(zhì)壁分離，PEG6000 引起塌陷，PEG4000 既20min后，再分別與濃縮1倍的不含激素的MH引起質(zhì)壁分離又導致塌陷。所以，高分子量的.(Mueller-Hinton)培養基等體積混合，配制時(shí)先將PEG是模擬土壤干旱理想的水勢調節物質(zhì)。PEG 溶液倒入到培養基中，然后再使培養基凝Rashmi和Agaral"l在實(shí)驗中還發(fā)現，用水勢為固。但應該注意的是，PEG經(jīng)過(guò)高溫滅菌后，水-1.7和-2.1 MPa的PEG6000(0.27和0.3 gg水)和勢會(huì )發(fā)生變化，因此實(shí)驗過(guò)程中應考慮到這種變甘露醇(0.3和0.6 mol:L')處理水稻幼苗時(shí)，脅迫化的影響。van der Weele等建立了一種簡(jiǎn)便的誘導的脯氨酸含量增加，前者明顯大于后者。方法，即將經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的PEG溶液倒在已經(jīng)凝固有人用PEG產(chǎn)生滲透脅迫處理玉米1213]、水的瓊脂培養基上，平衡一夜后倒掉PEG溶液，再稻14)的幼苗時(shí)發(fā)現，各種植物表現出相同的特接種植物材料。此法不僅能夠滿(mǎn)足實(shí)驗對于水勢征:丙二醛含量增加，葉中相對含水量(RWC)下的要求，而且對植物沒(méi)有毒害作用。降，膜透性增高。此外，隨著(zhù)植物抗性生理研3 PEG在研究鹽脅迫中水分脅迫的作用究向細胞水平的深入，需要以離體的器官、組織雖然鹽脅迫的一-個(gè)主要效應是對植物產(chǎn)生滲和細胞為試材進(jìn)行研究。范建民和惠玉琴15以不透脅迫，其對植物的傷害與土壤干旱有共同的機同苗齡的小麥離體葉片為材料，研究PEG對其衰制，但是鹽脅迫還會(huì )產(chǎn)生離子毒害等其它效應。老的影響時(shí)，發(fā)現PEG加速小麥衰老。同樣，在無(wú)機鹽離子分子量小，不僅能透過(guò)細胞壁，而且細胞水平的研究中，PEG也是- -種很好的水勢調可被細胞所吸收，在細胞內積累將會(huì )影響酶和其節物質(zhì)。例如，Bajji 和Chaumontl!6)就曾采用離它蛋白的穩定性。因此，在研究鹽脅迫機理時(shí)應體組織研究滲透脅迫對細胞膜離子通道、水孔蛋將鹽脅迫的滲透脅迫效應與其它效應區分開(kāi)。白和其它轉運蛋白的影響。許多學(xué)者用PEG進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現植物體在近年來(lái)，隨著(zhù)分子生物學(xué)的發(fā)展，PEG 滲透遭遇鹽脅迫和滲透脅迫時(shí)，在許多反應上有差脅迫也用來(lái)研究基因的表達和調節7”問(wèn)題。在許異。Skrecky22)用-1.0 MPa的非透過(guò)性溶質(zhì)多植物中，蔗糖合成酶基因的表達受蔗糖所制PEG8000和透過(guò)性溶質(zhì)氯化鈉處理假單胞菌約。Dejardin 等[181研究表明，擬南芥的蔗糖合成(Pseudomonas putda)后置于透射電鏡下觀(guān)察，發(fā)酶基因(Sus1)表達由蔗糖所誘導外，還可以由透過(guò)現經(jīng)PEG處理的細胞外膜出現斷裂或皺褶，而用性溶質(zhì)(山梨醇、甘露醇)和非透過(guò)性溶質(zhì)氯化鈉處理和未經(jīng)處理的細胞中則沒(méi)有。Bajji 和PEG8000所誘導。因而推斷Sus1基因可能受滲透Chaumont!l用29% PEG6000和300 mmolL'氯化勢調節，而不是受蔗糖代謝物的調節。鈉(約-1.5 MPa)脅迫玉米幼苗時(shí)發(fā)現幼苗鮮重顯2.2 PEG固體培養的特點(diǎn)及應用在某些植物滲透著(zhù)降低，PEG處理的降低程度大于氯化鈉處理脅迫研究中需要在瓊脂培養基上培養幼苗或離體組的，而且PEG處理的葉中相對含水量降低，幼苗織，并進(jìn)行滲透脅迫處理。通常的方法是在培養中國煤化工相對含水量恢復正基中加入小分子的糖類(lèi)、醇類(lèi)物質(zhì)或無(wú)機鹽，如YHCN MH G水量不降低，但在蔗糖、甘露醇、山梨醇等進(jìn)行滲透脅迫。但這轉矽到止吊水勞浴液中后，相對含水量則降低。植物生理學(xué)通訊第40卷 第3期，2004年6月363假單胞菌的反式不飽和脂肪酸與順式不飽和脂肪酸中不遵循van' t Hoff定律，對于給定的PEG水的比值對PEG8000、PEG200和氯化鈉滲透脅迫勢與摩爾濃度有關(guān)，但不成線(xiàn)性關(guān)系。在相同摩呈不同的反應:在-0.25 MPa水勢下，PEG200爾濃度下，水勢隨著(zhù)分子量的增大而降低。PEG和氯化鈉處理的反式不飽和脂肪酸與順式不飽和脂的水勢可能主要受乙醇亞單位的襯質(zhì)勢控制。肪酸的比值高于PEG8000處理的;水勢進(jìn)-步下雖然PEG溶液的水勢與摩爾濃度不呈線(xiàn)性關(guān)降時(shí)，PEG8000才誘導產(chǎn)生大量的反式飽和脂肪 系。但Michel和Kaufmannl281發(fā)現在一 定范圍內，酸，導致其與順式不飽和脂肪酸的比值上升122]。PEG 溶液水勢隨濃度和溫度的變化，可用方程馬煥成和王沙生23用等滲透勢的氯化鈉和PEG溶4=aq[PEG]2 T+b(PEG] +c[PEG]T+d([PEG]描述，式液處理胡楊時(shí)發(fā)現，胡楊對滲透脅迫和鹽脅迫有中a、b、c、d為常數。Michel 等1291983年又不同的響應:處理1 d后，受-0.24 MPa的氯化推導出如下經(jīng)驗公式，對PEG溶液的水勢進(jìn)行計鈉脅迫的胡楊根中ABA含量比未經(jīng)氯化鈉脅迫的算或預測: YpEo=1.29[PEG]' T- 140[PEG]2-處理增加2.7倍;而用相同水勢的PEG處理沒(méi)有4[PEG]。式中，YpEG 為PEG溶液的水勢，單位影響。李海云等1241研究鹽生植物濱藜(Atriplex為 bar; [PEG]為PEG濃度，單位為g:g'(水); T為isatidea)、堿蓬(Suaeda salsa)、海蓬子(Salicomia溫度(攝氏度)。此公式在PEG濃度0~0.8 g:g"'(水)、eucopca)、 補血草(Limonium bicolor)種子萌發(fā)的抑溫度5~40C的范圍內可得到很好的預測結果，誤制因子時(shí)發(fā)現，雖然氯化鈉和等水勢的PEG6000差在5%以?xún)?但在預測高濃度PEG溶液的水勢都對種子萌發(fā)有抑制作用，但PEG6000的抑制作時(shí)，誤差增大。用大于氯化鈉。這都說(shuō)明非透過(guò)性的PEG脅迫和甘露糖和葡聚糖的水勢計算可參見(jiàn)文獻29。鹽脅迫有不同的機制。應該注意的是，PEG 與低分子量溶質(zhì)混合時(shí)總之，用PEG產(chǎn)生滲透脅迫是鹽脅迫生理研對水勢的影響具有加成效應。例如將PEG與究中的一個(gè)重要手段。在實(shí)驗過(guò)程中，可以針對K2SO、NaCl、 甘露醇混合時(shí)，實(shí)測水勢低于預不同的實(shí)驗目的，用不同分子量的PEG,產(chǎn)生不測水勢(比預測水勢更負， 表1).這為培養液水同性質(zhì)的滲透脅迫來(lái)研究細胞壁外脫水和細胞膜外勢預測帶來(lái)了困難。但這個(gè)公式可應用在對水勢脫水效應。精確度要求不高的實(shí)驗中，也可以在此基礎上對4 PEG溶液水勢的測定和計算水勢進(jìn)行進(jìn)一步 的精確調節。PEG溶液水勢可以用冰點(diǎn)下降法(freezing-5結束語(yǔ)point depression)和水蒸氣壓虧缺法(vapor- pressure雖然PEG廣泛應用于植物滲透脅迫的溶液培養deficit)測定[326。但這兩種測定方法的結果有較中，但還存在著(zhù)-一些問(wèn)題。首先，氧氣供應不大的差異。Williams 和Shaykewich7發(fā)現PEG在足，以致植物缺氧。這與一般溶液培養一樣118]。低濃度[ 50~150 g(1 000 g)"(水)]下，冰點(diǎn)下降法在純水中氧氣的傳遞能力比空氣中低10^倍1,而的測定結果比水蒸氣壓虧缺法高(負的少)26% ~且在進(jìn)行溶液培養時(shí)根系表面還存在著(zhù)影響氧氣擴44%;高濃度[300~400 g*:(1 000 g) "(水)]下比水散的界面層2，層面層的厚度與攪拌程度和溶液蒸氣壓虧缺法低(更負)14%~20%。PEG在水溶液的粘度有關(guān)。溶液的粘度愈大，愈不利于氧氣的表1鹽和甘露醇對PEG溶液水勢的影響0PBC/gg'(水)溶質(zhì)濃度/mol.L:1.20.3實(shí)測水勢Mpa加成效應Mpa 實(shí)測水勢Mpa 加成效應Mpa 實(shí)測水勢Mpa 加成效應Mpa中國煤化工-K,SO,0.355-2.00NaCl0.410-1.99YHCNMHG0.62甘露醇0.731-1.95-2.760.50-3.370.75364植物生理學(xué)通訊第40卷 第3期，2004年6月擴散。PEG溶液的粘度較大，對根系的氧氣供應Biochem, 2002, 110 (5); B1-B42有較大的不利影響，從而增大了根系缺氧的可能17 Stasolla C, van Zyl L, Egersdotter U et al. The efets of poly-ethylene glycol on gene expression of developing white spruce性。其次，對培養植物產(chǎn)生傷害。在培養過(guò)程somatic embryos. Plant Physiol, 2003, 131(1): 49-60中，PEG有時(shí)會(huì )進(jìn)入組織內部，對植物尤其是植18 Dejardin A, Sokolov LN, Kleczkowski LA. An Arabidopsis物的根系產(chǎn)生不同程度的傷害1331。此外，如果stress-responsive sucrose synthase gene is up-regulated by lowPEG本身純度較低，其所含有的雜質(zhì)也會(huì )對植物osmotic potential. Abstract Number769. abstracts.aspb.org/aspb1998/48/0373.shtml產(chǎn)生一定的傷害作用1341。這些都是我們在應用19 Verslues PE, Ober ES, Sharp RE. Root growth and oxygen rela-PEG的實(shí)驗中需要加以注意的。tion at low water potentials impact of oxygen availability in poly-ethylene glycol solution. Plant Physiol, 1998. 116: 1403-1412參考文獻20 Linossier L, Veisseive P, Cailloux F et al. Effect of abscisic acid1 Couper A. Eley D. Surface tension of polyethylene glycoland high concentaions of PEG on Hevea brasiliensis somaticsolutions. J Polymer Sci, 1948.3:354~349embryos development. 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