聚乙二醇介導細胞融合的優(yōu)化條件探究

第34卷湖北師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol. 34第1期Journal of Hubei Normal University ( Natural Science )No. 1 ,2014聚乙二醇介導細胞融合的優(yōu)化條件探究嚴鎮鈞',張小兵2(1. 湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃石435002;2.湖北省黃石市第十八中學(xué),湖北黃石435001 )摘要;細胞融合技術(shù)是細胞工程中的一項核心基礎技術(shù)，聚乙二醇(PEG)是最常用的促融劑,廣泛地被應用于農業(yè)、醫藥環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域。探討更符合細胞工程要求的、融合后的細胞更大限度地保持生理活性的.快速、有效的細胞融合條件。以牛紅細胞為實(shí)驗材料，PEG作促融劑介導牛紅細胞融合,研究不同的融合溫度、PEG作用時(shí)間、PEG的相對分子質(zhì)量和PEG的質(zhì)量分數等因素對細胞融合率的影響。實(shí)驗結果表明,選擇融合溫度為39C,時(shí)間為15min,選用相對分子質(zhì)量為2000、質(zhì)量分數為45%的PEG,可以在細胞受毒害較小的同時(shí)得到最佳的融合效果,融合率能達到21.26%.關(guān)鍵詞:細胞工程;聚乙二醇;使用條件優(yōu)化研究中圖分類(lèi)號:Q813.2文獻標識碼:A文章編號:1009-2714( 2014)01-0014-06doi:10. 3969/j. issn. 1009 - 2714. 2014. 01. 004細胞工程是四大生物工程之- - - ,其核心基礎技術(shù)之一是細胞融合 技術(shù)。細胞與組織不同,不排斥異類(lèi).異種細胞，因此細胞融合不受種屬的局限,可實(shí)現種間生物體細胞的融合，使遠緣雜交成為可能,因而是改造細胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴(lài)有性雜交重組基因創(chuàng )造新種的界限和生殖壁壘,極大地擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍;細胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作,在技術(shù)和儀器設備上的要求不象基因工程那樣復雜,投資少,有利于廣泛開(kāi)展研究和推廣,有著(zhù)重大的實(shí)踐意義。人工細胞融合開(kāi)始于20世紀50年代,60年代到70年代作為一門(mén)新興的技術(shù)發(fā)展很快,有力地推動(dòng)了生物科學(xué)各領(lǐng)域的發(fā)展,目前,細胞融合技術(shù)已成為研究細胞遺傳細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段,其應用范圍極廣,已在農業(yè)醫藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開(kāi)創(chuàng )性的研究成果,而且應用領(lǐng)域不斷擴大,其發(fā)展前景及產(chǎn)生的影響日益顯著(zhù)。目前有許多促使細胞融合的技術(shù),但有些技術(shù)還處于剛剛起步階段，尚不成熟,或者存在某種生產(chǎn)應用方面的缺陷,例如利用滅活的仙臺病毒介導細胞融合盡管可以得到較高的融合率,對各種動(dòng)物細胞都適宜,并且仙臺病毒能在牛胚中大量繁殖,但其缺點(diǎn)是操作復雜、不穩定,在保存過(guò)程中促融合活性會(huì )降低，并且制備過(guò)程比較煩瑣,而且病毒引進(jìn)細胞后,可能會(huì )對細胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾,正是由于這些缺點(diǎn)，目前滅活的仙臺病毒已逐漸被聚乙二醇( Polyethyleneglycol , PEG)取代;利用激光融合技術(shù)雖然易于實(shí)現特異性細胞融合，參數易于控制,操作方便,而且實(shí)驗重復性好,但它只能逐一-處理細胞,不能像PEG-樣同時(shí)處理大量細胞”自從20世紀70年代Kao和Michayluk用PEG成A5十南石笊蚌物原生質(zhì)體融合后2],PEG法介導細胞融合以其容易制備活性穩定、不需要中國煤化工便等優(yōu)點(diǎn)，被普遍地YHCNMHG應用于生物、遺傳、醫藥等研究領(lǐng)域,并且是目前應用取)以的細胞融口時(shí)促融劑。2009年,HuynhNT收稿日期:2013-10-23作者簡(jiǎn)介:嚴鎮均(1976- ),男 ,湖北武漢人,講師,研究方向為遺傳學(xué).●14.等利用聚乙二醇介導細胞融合技術(shù)發(fā)展了納米醫學(xué)中的一個(gè)新領(lǐng)域-脂質(zhì)毫超微囊劑技術(shù)”。Oga-waF等用PEG介導經(jīng)紫外線(xiàn)照射形成的腫瘤細胞和轉人了IL-2基因或LacZ基因的樹(shù)狀細胞融合，融合細胞表達出了組織相容性復合體( Major Histocompatibility Complex , MHC ) classI、MHCclassll、CD86、CD11c和CD8alpha+。Dan K等用PEC介導細胞融合的技術(shù)證明了能高效抑制單純皰疹病毒(HSV)復制的多金屬氧酸鹽PM-19并非是在病毒感染的融合階段起作用”。另外,單克隆抗體技術(shù)就是通過(guò)細胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的,對生命科學(xué)的研究及醫學(xué)方面的應用產(chǎn)生了重大影響,其中，PEG作為促融劑發(fā)揮了不可替代的作用,比如, Bhanuprakash V等用激活的淋巴細胞和骨髓瘤細胞通過(guò)PEG介導融合制造了藍舌病病毒的單克隆抗體[°]。ChangheeYoo等用PEG(Mr=1500)介導經(jīng)熱處理后的前列腺癌細胞(DU145cells)和成熟的抗原呈遞細胞樹(shù)狀細胞(Dendriticcells,DCs)進(jìn)行雜交,制備前列腺癌細胞系疫苗。GuoCH等用50%PEG介導食管癌細胞系( esophageal carcinoma cell line 109 , EC109 )和樹(shù)狀細胞( Dendritic cells , DCs)融合產(chǎn)生抗腫瘤的雜交疫苗8。HommaS等用自體樹(shù)狀細胞和自體胃癌細胞通過(guò)PEG介導融合,使細胞產(chǎn)生抗體,再將融合后的細胞每?jì)芍?-次地注射到嚴重胃癌的患者皮下,取得了有效的臨床治療效果9?？傊?利用PEG作促融劑的細胞融合技術(shù),已經(jīng)得到了廣泛應用,而在這些應用中，學(xué)者們采用的實(shí)驗條件是不一樣的目前，人們有時(shí)采用PEG介導融合技術(shù)和一些物理手段如激光融合技術(shù)相結合的方法，以進(jìn)一步提高融合率。但是,影響PEG作用效果的因素較多,加大了獲得理想細胞融合率的難度5。本文從融合溫度、時(shí)間、PEG質(zhì)量分數和相對分子質(zhì)量等幾個(gè)方面,對PEG應用于細胞工程中的最適條件做了探討。1材料和方 法1.1材料Alsver液(pH7.4)、0. 85%生理鹽水、GKN液、PEG(Mr = 600)、PEG(Mr= 1000)、PEG(Mr =2000). PEG( Mr =4000)、PEG( Mr = 6000)、健康牛靜脈血。1.2方法1.2.1牛紅細胞的獲得取健康牛靜脈血10mL至盛有40mLAlsver溶液的瓶中,混勻后置于4C冰箱,可保存一周。實(shí)驗時(shí)取牛血1mL,移人10mL離心管,加入4mL0.85%生理鹽水混勻,1200r/min離心5min;棄上清液,加0.85%生理鹽水5mL,用指彈法將細胞團塊彈散,混勻后1000r/min離心.5min,重復上述條件,再離心洗滌1次。收集最后1次離心沉淀的紅細胞。1.2.2細胞融合溫度的選擇用血細胞計數法計數,將紅細胞以預熱的GKN液稀釋成細胞密度為2x107/mL的牛紅細胞懸液;分別取懸液1mL到5個(gè)試管中,每個(gè)試管加入0.5mL預熱的質(zhì)量分數為50%的PEG( Mr = 4000)混勻,將試管分別置于33C、35°C 、37C、39C、419C水浴中溫浴15min;取融合后的細胞觀(guān)察并統計融合率。1.2.3 細胞融合時(shí)間的選擇 在最適融合溫度下,分別溫浴5min. 8min、13min、15min、17min,取融合后的細胞統計融合率。1.2.4 PEG質(zhì)量分數的選擇 在最適溫度下，分別用質(zhì)量分數為35%. .40% 、45%、50% .55%、60%、65%的PEG作為促融劑進(jìn)行細胞融合,在最適融合時(shí)間取融合后的細胞統計融合率。1.2.5對PEG的選擇在最適溫度下,分別用最適質(zhì)量分數的PFC(Mr=600)、PEG(Mr=1000)、PEG( Mr = 2000)、PEG( Mr =4000). PEG( Mr =6000)1中國煤化工,在最適融合時(shí)間取融YHCNM HG1.2.6細胞融合率的計算每一-次計算融合率時(shí)觀(guān)察統計5個(gè)視野。在顯微鏡視野內,計數觀(guān)察到的所有細胞核數以及其中已經(jīng)發(fā)生融合的細胞的細胞核數,計算已經(jīng)發(fā)生融合的細胞的細胞核數占細胞核總數之百分比即為融合率。2結果與分析2.1 PEG 介導細胞融合條件的選擇2.1.1細胞融合溫度溫度是影響細胞融合的重要因素。從實(shí)驗數據可以看出，當溫度不超過(guò)399C時(shí),細胞的融合率隨著(zhù)溫度的升高而增加,溫度在39C時(shí)融合率達到最大值,為23.24%，繼續升高融合溫度,融合率呈迅速的下降趨勢,當溫度升至419C僅為17.75%(圖1)。因此,融合溫度選擇在35°C ~ 399C.2.1.2細胞融合時(shí)間將細胞融合溫度控制在39C,融合時(shí)間為15min時(shí),融合率達到最大值25.45%，當繼續延長(cháng)融合時(shí)間時(shí),融合率并沒(méi)有隨著(zhù)時(shí)間的增加而增加,至17min時(shí),融合率為25.34%(圖2),并且隨著(zhù)時(shí)間的增加,視野中出現了越來(lái)越多的細胞破碎現象,表現為觀(guān)察到的完整細胞越來(lái)越少(表1)。因此,融合時(shí)間選擇在8 ~ 15 min.0↑大20。103335341131溫度/C時(shí)間/ min圖1溫度對牛紅細胞融合率的影響圖2PEG作用時(shí)間對牛紅細胞融合率的影響2.1.3 PEG 質(zhì)量分數分別用不同質(zhì) 量分數的PEG作為細胞融合的促融劑，結果表明,融合溫度在39C ,融合時(shí)間為15min時(shí),細胞融合的效率隨著(zhù)PEG質(zhì)量分數的增加而升高(圖3)。但是,PEG具有一定的毒性,且其質(zhì)量分數越大對細胞的毒性越大,極大地影響了融合率和融合后細胞的存活率16),因此, PEG的質(zhì)量分數選擇在45% ~55%.2. 1.4 PEG的相對分子質(zhì)量分別用Mr為600、1000、2000、4000、6000的五種PEG來(lái)進(jìn)行比較研究,結果表明，在這幾種PEG中,相對分子質(zhì)量為600的PEG介導細胞融合的效率最低，只有14.55%，隨著(zhù)相對分子質(zhì)量的增加,融合率也增加,到相對分子質(zhì)量為4000時(shí),融合率高達25.73%,當PEG的相對分子質(zhì)量為6000時(shí),融合率略微升至25.87%(圖4)?？紤]到PEG的相對分子質(zhì)量越大,對細胞的毒性也越大,因此，PEG的相對分子質(zhì)量選擇在1000~4000.25p一◆+◆s福15f時(shí)15-5t55565300100020004006000PEG質(zhì)量分數/%不同Mr的PEG圖3不同的PEG質(zhì)量分數對牛血細胞融合率的影響圖4不同Mr的PEG對牛紅血細胞融合率的影響2.2PEG介導細胞融合條件參數的優(yōu)化和選擇以融合溫度、融合時(shí)間、PEG質(zhì)量分數和相對分子質(zhì)量分別為實(shí)驗因子,每因子分別取3水平作正交實(shí)驗。正交因素水平表見(jiàn)表1 ,結果見(jiàn)表2.水平A表1正交實(shí)驗中國煤化工DPEG質(zhì)量分數/% .PEG相對THCNMHG間/min458503740003916.表2 I9 (3" )正交實(shí)驗結果AD融合率/%110.05.23. 57324. 19424. 425217. 47623. 93722.51823. 21920. 16K119. 2718. 9916. 9115. 89<221.9421.4222. 2223.34<321. 9622. 7623. 5423. 94R2. 693.' 776. 638.05最優(yōu)水平A3B3C3D3從表2可以看出:對細胞融合率的影響最大的因素是時(shí)間,其次是溫度,然后依次是PEG的相對分子質(zhì)量和PEG的質(zhì)量分數;所以,融合條件的最優(yōu)水平組合是A3B;C3D3.最佳條件重復性實(shí)驗結果見(jiàn)表3.表3最佳條件的重 復性實(shí)驗平均值觀(guān)察細胞數584545613570578融合數14913915814825. 5125.5025.7725. 9625. 69由表3知,最佳條件的重復性較好,故可確定最佳融合條件:溫度為39C、時(shí)間為15minPEG的相對分子質(zhì)量為4000、質(zhì)量分數為55%,融合率為25.69%.但是，PEG的相對分子質(zhì)量越大、質(zhì)量分數越高,對細胞的毒性也就越大，而這兩個(gè)因素相對而言并不是影響融合率的主要因素,所以,在實(shí)際應用中,可以在保證融合效果的前提下,嘗試使用對細胞毒性較小的條件。由于PEG的質(zhì)量分數相對于其他因素而言,對融合率影響最小，PEG的相對分子質(zhì)量對融合率的影響也比較小，所以分別用A、A2代替A; B; Cs D3中的As,用B，、B2代替A; B3C3 D3中的B3,將所得融合率值與表3中理論最佳條件的融合率值進(jìn)行卡方分析，結果見(jiàn)表4.表4選擇條件的優(yōu)化實(shí)驗xA B,C3 D3融合率/%18. 7519. 2220.1418. 9319. 261. 609A2B3C;D3融合率/%.25.1024. 76中國煤化工:920. 023A; B, C; D3融合率/%17.0715. 17TYHC NMH G164. 316A3 B2C3 D3融合率/% .23. 5926. 2624.8825.2725.000.019由表4可知,P(A2 B,C3 D3) P(A B3 C3 D3)均大于0.05 ,故在實(shí)踐中可用A2或A,代替A3.如果用A2代替,則可以獲得較多的融合細胞;如果用A代替,則可以更大程度地減少對細胞的毒害,從●17.減少對細胞的毒害這一思想出發(fā),用 At代替As更好。P(A3 B2 C3 D3)大于0.05,P(A; BI C3 D3)小于0.05 ,故在實(shí)踐中如用BI代替B;則得到的融合率太低,而可用B2代替B3.所以,在實(shí)踐上,細胞融合條件的一-種較理想水平組合宜為A B2 C, D3 ,重復性實(shí)驗結果見(jiàn)表5.表5理想選擇條件的重復性實(shí)驗24平均值觀(guān)察細胞數594545663551融合數131111143115125融合率/%22. 0520.3721.5720. 8721.26由表5可看到,該理想選擇條件的重復性較好,故可確定在實(shí)踐中的--種理想融合條件為溫度為39C、時(shí)間為15min、PEG的相對分子質(zhì)量為2000、質(zhì)量分數為45%， 融合率為21.26%.3討論融合率在一定范圍內隨溫度的升高而增大,在39 C時(shí)最大,繼續升高溫度時(shí)不僅融合率下降,而且細胞狀態(tài)不良。細胞融合的最適時(shí)間為15 min,但是隨著(zhù)融合時(shí)間的延長(cháng),融合率反而有所下降,這可能是因為PEG作用時(shí)間過(guò)長(cháng)，對細胞毒害太大,導致了更多融合細胞變形甚至破裂所致。細胞融合率與PEG的相對分子質(zhì)量及其質(zhì)量分數成正比，但PEG的相對分子質(zhì)量越大、體積分數越高,對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者,在以往實(shí)驗時(shí)常常采用的PEG相對分子質(zhì)量一般為4000和6000,質(zhì)量分數一-般為40%~60%。盡管本實(shí)驗在選擇范圍內所用的PEG當相對分子質(zhì)量為4000,質(zhì)量分數為55%時(shí),融合率最高,但是時(shí)間、溫度是影響融合率的主要因素,PEG的相對分子質(zhì)量和質(zhì)量分數是次要因素，在實(shí)際生產(chǎn)中，對主要因素選取使綜合平均值最好的水平,對次要因素可以選取使綜合平均值最好的水平,也可以選取細胞受毒害較小的水平進(jìn)行最優(yōu)水平組合。用45%的PEG( Mr =2000)取代55%的PEG( Mr =4000),同樣也得到了很高的融合率21.26% ,而且對細胞的毒害更小，所以在生產(chǎn)實(shí)踐中較宜選用45%的PEG( Mr = 2000),而不是55%的PEG(Mr=4000)。PEG介導細胞融合受很多因素的影響,只要控制好作用時(shí)間與溫度,將PEG的質(zhì)量分數、相對分子質(zhì)量等調節到適當的范圍，就能獲得較高的細胞融合率。當然,對于不同種類(lèi)細胞,其最適融合條件之間的差別還有待于進(jìn)一一步研究探討。參考文獻:[1]Steubing R W, ChengS, Numajir I Y, et al. Laser Induced Cell Fusion in Combination With Optical Tweezers [ J]. TheLaser Cell Fusion Trap Cytometry ,1991, 12: 505 ~510.[2]Kao K N，Wetter L R. Advances in techniques of plant protoplasts fusion and culture of heterokaryocytes [A] 。Interma-tional Cell Biology, 1976 - 1977 [C] . Boson, MA, TheRockefeller University Press ,1977 : 216 ~224.[3] Huynh N T, Passirani C, Saulnier P ,et al. Lipid nanocapsules : a new platform for nanomedicine [J]. Int J Pharm, 2009Sep 11 ,379(2):201 ~ 209.[4]Ogawa F, linuma H, Iwasaki K, et al. Fusion vaccine therapy by IL -2 - gene - transduced dendritic cells and tumorcells[J]. Gan To Kagaku Ryoho ,2005 ,32(11):1580 ~ 1582.[5]Dan K, Miyashita K, Seto Y, et al. The menory efeet of hetu中國煤化工pereament on nection lyherpes simplex virus at the penetration stage [J]. PharmacolTHCNMHG[ 6 ] Bhanuprakash V，Hosamani M, Balamurugan V, et al. Producun aunur cnauavucisatin u munoclonal antibodies to blue -tongue virus[J]. Virol Sin,2011 Feb,26(1):8 ~18.[7]YooC, DoH A, JeongIG, et al. Efficacy of dendritic cells matured early with OK - 432 ( Picibanil)，prostaglandinE2, and interferon - alpha as a vaccine for a hormone refractory prostate cancer cell line [J]. J Korean Med Sci ,201018.Sep,25(9):1284 ~ 1290.[8]GuoG H, ChenSZ, YuJ, et al. In vivo anti - tumor efect of hybrid vaccine of dendrtic cells and esophageal carcinomacells on esophageal carcinoma cell line 109 in mice with severe combined immune deficiency [J]. World J Gastroenterol ,2008 ,14(8):1167 ~1174.[9]HommaS, Matai K, Irie M, et al. Immunotherapy using fusions of autologous dendritic cells and tumor cells showed ef -fective clinical response in a patient with advanced gastric careinoma [J]. J Gastroenterol ,2003 ,38( 10) :989 ~ 994.[ 10]Kao W J, Lee D. In vivo modulation of host response and macrophage behavior by polymer networks grafted with fibronectin - derived biomimetic oligopeptides: the role of RGD and PHSRN domains [ J]. Biomaterials ,2001 Nov ,22(21):2901 ~ 2909.[11]Kao W J, Lee D, Schense J C, et al. Fibronectin modulates macrophage adhesion and FBGC formation : the role ofRGD, PHSRN, and PRRARV domains[J]. J Biomed Mater Res ,2001 Apr ,55(1) :79 ~ 88.[ 12] Archer M, Rodrigues M L, Aurelio M, et al. Crystallization and preliminary x - ray diffraction analysis of beta - einna-monin, an elicitin secreted by the phytopathogenic fungus Phytophthora cinnamomin [J]. Acta CGrytallogr D Biol Crys-tallogr , 2000 Mar. ,56( Pt 3) :363 ~ 365.[ 13]Pontecorvo G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment [J]. Somatic CellGenet, 1975, Oct,1(4) :397 ~ 400.[ 14]Davidson R L, Gerald P s. Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol[J]. Somatic Cell Genet , 1976 Mar,2(2):165~ 176.[ 15] Hopwood D A. Genetic studies with bacterial protoplasts[J] . Ann Rev Microbial , 1981 ,35 : 237 ~259.[16]徐承水,黨本元現代細胞生物學(xué)技術(shù)[ M].青島:青島海洋大學(xué)出版社, 1995.A study on condition optimization ofcell - fusion with PEG as the RevulsantYAN Zhen-jun ,ZHANG Xiao-bing(1. College of Life Sciences ，Hubei Normal University ，Huangshi 435002 ，China;2. Huangshi No. 18 Middle School , Huangshi 435002 ,China)Abstract:The cell - fusion technique is a core basic technology ,as the most frequently revulsant ,PEG is widely used in manyfields such as agriculture 、medicine、environmental protection , and so on. To find a more effective and rapid cell - fusion meth-od that can answer for the cell - engineering needs which need the fused cells to keep more physiological activities betterhere, ox red cells were taken as the material，which were made to fuse induced by PEG , the author studied the effects of fu-sion temperature 、PEG role time、PEG molecular weight and mass fraction on cell fusion . The results showed that when the fu -sion temperature、PEG role time、PEC molecular weight and mass fraction was 39C、15min、2000.45% , respectively, the fu-sion frequency reached to the peak value at the same time that the poison to ellls was much less , and the cell fusion ratereached to 21.26% .Key words: cell engineering ; PEG ;the optimum use condition中國煤化工MHCNMHG19.