天花粉蛋白的定點(diǎn)突變及聚乙二醇修飾

中國生物制品學(xué)雜志2000年3月第21卷第3期CainJ Boloical March 20080 Vo1.21 No.3中國圖書(shū)分類(lèi)號Q278文獻標識碼A文章編號 04-5505(2008)03-019404[基礎研究]夭花粉蛋白的定點(diǎn)突變及聚乙二醇修飾安群星'雷迎峰2 穆士杰!張獻清' 陳蕤'夏愛(ài)軍|陳晨易靜'吳原茹'徐志凱2[摘要}目的對天花粉蛋 白(Tnichourhin, TCS)進(jìn)行定點(diǎn)突變及聚乙二酶(PBC)修飾并對修飾產(chǎn)物進(jìn)行DNA酶活性分析。方法選擇TCS分子上可能的抗原決定簇位點(diǎn)(7F81-83和KI73-14)進(jìn)行定點(diǎn)突變,將所構建的兩個(gè)突變體(TSre.8B.cs和TCSxu3-40c)在大腸桿菌中表達,并純化表達產(chǎn)物。通過(guò)第82位和173位引人的半胱氨酸殘基,分別對突變體蛋白進(jìn)行PBCG定點(diǎn)修飾。通過(guò)與突變型TCS比較,分析兩個(gè)PEC修飾型TCS的DNA酶活性。結果突變的 Tcs經(jīng)酶切鑒定及測序分析,證明質(zhì)粒構建正確,表達的目的蛋白相對分子質(zhì)量約為3000,經(jīng)PEC修飾后,相對分子質(zhì)量約為4000初步分析顯示,與突變型TCS相比.所構建的兩個(gè)PBG修飾型TCs也顯示出類(lèi)似DNA酶活性。結論成功進(jìn)行了 Tcs的定點(diǎn)突變及PEG修飾,為基因工程及化學(xué)修飾方法改造TCS提供了一條可行的途徑。[關(guān)鍵詞]天花粉蛋白;定點(diǎn)突變;聚乙二醇;修飾Sitedirected Mutation of Trichosanthin and Chemical Modification of Mutant byPolyethylene GlycolAN Qun-xing,LEI Ying feng, MU Shi-ji, et al (Department of Blood Transfision , Xjing Hospital, Fouth Military Meldi-cal University ,Xi’an 710032, China )[Abstract] Objective To induce site dircted mutation o rchosanthin (TCS),modif tbe mutant by plytylene gycol (PEG) andanalyze is DNaelike actvity .Methods Two potential anigenic deleminants of TCS, YFF81-83 and KR173- 174, were selected by computermodeling, based on which the genes encoding two site directed mutants of TCS, TCSrmu.BAss and TS731706,，were amplifed by PCR, insert-ed into pRSET-A vetor and tansfomed to E. coli DHSa. The recombinant plasmid was extracted, denified by retriction analysis and se-quencing and tansfomed to E. coli BL21(DE3) for expesion under induction of IPTC. The expresed product was identif.ed by SDS-PACEand Westem blot and modified by PEG. The DNase like acivitis of the two PEG modified mutants were analyed and compared wih thoee ofunmodifed mutants . Resuts Both rstriction analysis and sequencing result showed that reombinant plesmnids were; constructed crectly.Therelative molecular mases of the expressed products before and afer moificationo were about 30 000 and about 40 000 repetively. like unmod-ified TCS mutant,he two mutants modified by PEC showed DNase -ike aciviy. Conclusion The stedieted mutation of TcS was succefully induced, and the mutants were mdifed by PEC. It provided a feasible appach for reonstueting TCS by gene enineering and chemicalmoification.[Key words] Ticoanhin;Site dieeted mutin;olyethylene eycol; Mifcetion天花粉蛋白(Tichoanthin , TCS)是中草藥天花粉基(TC8.8BAcs的82位和TSK13170c的173位),對的有效成分,屬于I型核糖體失活蛋白(Ribosome-inac-其進(jìn)行聚乙二醇定點(diǎn)修飾(Site-directed PECylation)。tivating proteins, RIPs) ,具有抗病毒、抗腫瘤引產(chǎn)及免經(jīng)初步檢測，修飾產(chǎn)物仍具有類(lèi)似DNA酶活性。該疫調:節等多種藥理活性,特別是其抗人類(lèi)免疫缺陷病研究為基因工程及化學(xué)修飾方法改造TCS提供了- -毒(Humen immunodeficiency vins, HV)活性更引起世條可行的途徑,值得進(jìn)-步探索研究。界關(guān)注。然而,TCS強烈的免疫原性和較為短暫的血漿半衰期阻礙了其進(jìn)- -步 的臨床應用。本研究針對1.材料與方法.TCS分子上可能的抗原決定簇位點(diǎn)(YFF81-83和1.1菌株及質(zhì)粒KR173-174)進(jìn)行定點(diǎn)突變,并通過(guò)引人的半胱氨酸殘E. coli DH5a和BL21 (DE3)為第四軍醫大學(xué)微基金項目:陜西省科技計劃項目(2003K10C9);西京醫院學(xué)科助生物學(xué)教研室保存;質(zhì)粒pRSET-A和pUC19由該室推計劃項目(XIZT07M09).張海博I中國煤化工作者單位:1第四軍醫大學(xué)西京醫院輸血科(西安710032);2第1.2四軍醫大學(xué)微生物學(xué)教研室(西安70033)."THCNMH G植w空四出延取試間益則日北京鼎國生物技術(shù)通訊作者:徐志凱, E mail: zikaixu@ fmm. edu.cn中國生物制品學(xué)雜志2008年3月第21卷第3期Chin J Biogcals March 2008, Vval.21 No.3公司;膠回收試劑盒購自寶信公司;質(zhì)?？焖偬崛≡?.結果劑盒購自Promega公司;Ni-NTA純化試劑盒購自In-2.1 TCS 的定點(diǎn)突變、克隆與鑒定vitrogen公司;Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶以及借助計算機預測, YFF81-83和KR173-174被確限制性?xún)惹忻窧amHI和EcoR I均購自TaKaRa公定為T(mén)CS分子上可能的抗原決定簇位點(diǎn)。以栝樓司;PEG- maleimide (mPECsk)購自FLUKA公司?；蚪MDNA為模板,利用重組PCR技術(shù)擴增,得到.3 TCS的定點(diǎn)突變、克隆與鑒定突變體TS81.8ACs和TSK173170C0基因,大小約為按照文獻[1,2]方法，以栝樓基因組DNA為模750 bp(圖略)。隨后將其克隆至pRSET-A載體,轉板,分別采用超長(cháng)引物PCR和重疊引物延伸PCR法化感受態(tài)E. coli DHSa, 提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,結擴增TCS突變體(TSr:B5和TRS173170)基果與預期相符,見(jiàn)圖1。將篩選的陽(yáng)性克隆測序,在因。隨后將其克隆至pRSET-A載體,轉化感受態(tài)人為突變位點(diǎn)以外均未見(jiàn)其他突變發(fā)生。E.coliDH5a,用堿裂解法提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定及測序。bu1.4 TCS 突變體的表達與鑒定將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉化E.coli BI212000(DE3) ,挑取陽(yáng)性克隆,接種于IB培養液中(含Amp100100 prg/ml) ,37C振搖培養過(guò)夜。次日按1%比例轉500250接后,37C振搖培養2.5 h,當A0達到0.5-0.6時(shí)，加入IPTC至終濃度為0.1 mmol/L, 37C誘導培養5~6 h,離心收集菌體并進(jìn)行12% SDS-PAGE鑒定。隨后將蛋白轉移至NC膜上,以抗天然TCS兔血清1:DNA marker D202:TSms-ms;3:TCSsers.noc.(第四軍醫大學(xué)微生物學(xué)教研室制備)為一抗, 鼠抗圖1重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fg 1. Restriction map of recombinant plasmids兔IgG-HRP(購自寶信公司)為二抗,進(jìn)行Westem2.2 TCS 突變體的表達與鑒定blot鑒定,用ECL顯色后觀(guān)察結果。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉化E.coli BL211.5 TCS 突變體蛋自的純化所構建的工程菌經(jīng)培養和IPTG誘導,離心收集(DE3),經(jīng)IPTG誘導培養后收集菌體,進(jìn)行SDS-菌體,加入裂解緩沖液,并進(jìn)行超聲碎菌,收集上清PAGE分析。結果在相對分子質(zhì)量約30000處出現進(jìn)行純化。具體純化操作參照Invitrogen公司的Ni-明顯條帶,見(jiàn)圖2,與預期的6His-TCS融合蛋白大小.一致。經(jīng)Westemblot鑒定,結果在相應位置出現了NTA純化試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。表達蛋白的特異性條帶,見(jiàn)圖3。1.6 TCS 突變體蛋白的PEG定點(diǎn)修飾將純化后的突變體蛋白與mPECsk在PBS緩沖Mr 12液中按1:10摩爾比混合,于25C反應8h。用20倍97 000體積的Buffer A(含20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmo/L66000EDTA,pH7.5)稀釋反應混合物,終止反應。將反應53000產(chǎn)物上樣于預先用Buffer A平衡的CM-Sepharose36000 -CL-6B( Pharmnacia)柱內,以含0~0.2 mol/L NaCl的BuferA線(xiàn)性梯度洗脫,收集樣品,進(jìn)行12% SDS-24 000PAGE鑒定。.1.7 DNA酶活性測定1:protein mark在20 μ反應體系內(包含50 mmol/L Tis-HCl,6:negative10 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L CaC2, 100 mmol/L NaCl,圖2表達產(chǎn)物的SDSPAGE分析Fg 2. SDS-PAGE profile of expressed productpH 8.0) ,分別加人不同類(lèi)型的TCS 2 ug,然后加入中國煤化工1隅超螺旋質(zhì)粒pUC19,室溫反應1 h。將各反應產(chǎn)物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,觀(guān)察超螺旋質(zhì)粒是否:MHCNMHG析,結果在相對被切割為開(kāi)環(huán)及線(xiàn)性DNA。.分子質(zhì)量約30 000處出現單一蛋白條帶,見(jiàn)圖4。中國生物制品學(xué)雜志2008年3月第21卷第3期Chin J Bioloicals March 2008, Vol.21 No.2.4 TCS 突變體的PEG定點(diǎn)修飾3.討論兩個(gè)突變體經(jīng)PEG修飾后,相對分子質(zhì)量明顯TCS是中草藥天花粉的有效成分,人藥已有增大,約40 000,高于PEGs與TCS之和,見(jiàn)圖4。推2000多年歷史,傳統中醫主要將其應用于中期妊娠測可能是由于線(xiàn)狀PEC分子伸展在蛋白表面,使其引產(chǎn)以及胎物殘留、異位妊娠和葡萄胎等婦科疾病泳動(dòng)速率降低;另-方面可能是由于PEG的水化程的治療。近年來(lái),隨著(zhù)人們對TCS結構和功能的深度非常高,使得PEC化蛋白的泳動(dòng)行為反常。人研究,發(fā)現它屬于I型RIPs,具有多種生物活性和藥理特性。其生物活性主要包括:具有RNA N-糖苷酶活性,可以裂解核糖體28S rRNA上第4 324位腺嘌呤堿基與核糖之間的N-糖苷鍵,從而使真核細胞1.2:TS8183ACs;3,4:TCS17-14Cc.核糖體失活[3];具有類(lèi)似DNA酶活性,可以切割超圖3表達產(chǎn)物的Westem blot分析螺旋DNA,產(chǎn)生開(kāi)環(huán)和線(xiàn)性DNA[4);新近研究表明,Fig 3. Western bottig of expressed productTCS還可誘導細胞凋亡、增強趨化因子作用等[5.6。MIr_7當然,最被人們看好的還是其藥理活性。它可抑制97 400某些腫瘤的生長(cháng),對乙型肝炎病毒、麻疹病毒以及單66 20043 000純皰疹病毒等均有顯著(zhù)抑制作用,其較強的抗-HIV活性更引起人們廣泛關(guān)注。1989 年, McGrath等[7]31 000首次報道了TCS(商品名為GLQ223)在體外能選擇性地抑制急性感染的淋巴細胞和慢性感染的巨噬細胞內HIV-1的復制,有些方面甚至優(yōu)于美國FDA批14 400準的第一個(gè)AIDS臨床用藥AZT,引起世界關(guān)注。因此,TCS在臨床特別是AIDS治療方面具有潛在的應1:protein marker;2,3: TCSrmu . sas;4, 5: TCSuours- moc;用價(jià)值。6:PDG-TCSmx- acs;7:PEG-TCSr3- noc.然而,TCS在臨床觀(guān)察及應用中也存在一些問(wèn)圖4修飾后TCS的SDS-PAGE分析題,其中最主要的就是其強烈的免疫原性和短暫的Fig 4. SDS.PAGE profile of mdifed TCS血漿半衰期,這也是TCS至今未能成為治療AIDS臨2.5 DNA 酶活性測定.床用藥的根本原因。作為人體的一種異己蛋白，將超螺旋質(zhì)粒pUC19分別與各型TCS在一定TCS具有很強的免疫原性,在臨床觀(guān)察中會(huì )產(chǎn)生一條件下孵育后,行瓊脂糖凝膠電泳,結果與突變型些如過(guò)敏反應、神經(jīng)和腎臟毒性等副作用。據報道，TCS--樣,兩個(gè)PEG修飾型TCS也顯示出類(lèi)似DNA體內注射TCS會(huì )產(chǎn)生破壞性IgG和IgE抗體,反復酶活性,見(jiàn)圖5。注射可導致嚴重的過(guò)敏反應甚至死亡(8。此外,在Tcs的動(dòng)物試驗及人體觀(guān)察中,也遇到過(guò)如肌痛、發(fā)燒、腎毒性及神經(jīng)毒性等副反應。TCS作為一種相對分子質(zhì)量不到27 000的蛋白質(zhì),在體內的半衰期..二相對短暫,注人機體后,會(huì )很快被腎小球過(guò)濾,丟失s在尿液中。加之反復注射會(huì )產(chǎn)生抗體的破壞作用以及血液內蛋白酶的降解作用,其在體內半衰期只有8.4~ 12.7 min。要達到其在體內的有效治療濃度,必須大劑量反復注射。1:pUC19 control;2: pUC19 + TCSr1- BACs;3: pUC19 +只有設法降低TCS可能引起的毒副反應，延長(cháng)TCSxau73- 140c;4: pUC19 + PEGTSr81- BAcs; 5: pUC19 +其在體內的半衰期,同時(shí)保持其活性不受或少受影PEG-TCSxu73- I740G;Ne:nicked dircular DNA;L: linear DNA; .響,T中國煤化王價(jià)值的AIDS臨床S:superoiled DNA.圖5 TCS突變體及PEG修飾體的DNA酶活性分析用藥潑展給改造蛋白多Fg 5. DNase like activities of TCS mutant betore and at-肽類(lèi)TH.CNMH .生物學(xué)軟件分析，ter modifncation(下轉第203頁(yè))中國生物制品學(xué)雜志2008年3月第21卷第3期Chin J Biolgcale March 2008, Vol.21 No.3203泛使用。工程菌全細胞乳糖誘導培養物抗原對攻毒g聲gangrene. Vocie, 193,11 (12):1253-1258.小鼠的保護率有所提高。[4]Hunter sE, Bromn JE,0yston PC,et al.Cand BE. Molecular ganetic anal-yais of bete loxin of Cloridiun perfringers reveals sequence homoloey本實(shí)驗結果表明,含C型產(chǎn)氣莢膜梭菌a-Br-Bwith alpha-loxin, gum me-toxin, and leukocidin of Stpbhyoou sureu .融合蛋白的重組工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能Infct Inmumn, 193,61(9):3958-3965.夠有效刺激免疫ICR小鼠產(chǎn)生特異性抗體,從而達[S]Sakurai J, Fuyli Y. Puification and dancteizaion d Cotridiun prn-到保護的目的,具有較強的免疫原性,可以作為研制fringens beta-loxin. Toricon, 1987 ,25(12):1301-1310.預防產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起疾病的理想基因工程候選[6]seinhonodotir VFidrikeloti V . Site directed nutagenesis o costidiumpernfringens betatoxin epression of wild-ype and mulan toxins in bacil-菌株。lusulriti, 198, I5(8):17-23.[7]Cibet M,olive- Reynad CPoput MR,et al. Beta2 loxin, a novel toxin參考文獻produced by Closridiun prfingan .Gene, 1997 ,20(3) :65-73.[1] Tball R, Feam AM, Wllianmon ED. Biochemnical and inmunloial[8]韓學(xué)波。許崇波，曾瑾,等.產(chǎn)氣莢膜校菌aR-B融合基因的構建propertienof the C-ler minal domain o the alpha toxind Clotridum pr-及表達.中國生物制品學(xué)雜志,200,0 19(5):454-456.fringeus. . FEMS Micobiol Let, 1993,1(10)45-50.[9]王玉炯,許崇波,馮書(shū)章，等.C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素基因克隆[2] Tiball RW,Rubidge T. The role o hieidine reidues in the alpha toxin和核苷酸序列分析中國獸醫學(xué)報, 198,1(6):541 ~54s.of Catidiun pefingers .FEMS Micbiod Lit, 190,682):261-266.[3] Wllianmon ED, Ttball RW.A gnticallyy enginered vacine agint the(收藊日期20708-20)apha- toxin of Cotridiumn perfringers prodects mice aginet eperimental(上接第19頁(yè))可預測蛋白多肽類(lèi)分子，上可能的抗原決定簇位點(diǎn)，并可通過(guò)多種方法對其抗原性較強的位點(diǎn)進(jìn)行突變,以降低其免疫原性,減少體內副反應。對于諸如[1]安群星,穆士杰,張獻清,等.天花粉蛋白突變體的構建及其在原體內半衰期短等問(wèn)題,可通過(guò)采用多種藥物傳遞技核系統中的表達.醫學(xué)研究生學(xué)報.2007 ,20(4):357 ~ 359.術(shù)來(lái)提高蛋白多肽類(lèi)藥物的體內療效,這其中最為[2]安群星，穆士杰，張獻清，等.天花粉蛋白突變體Tcs.(KR173-174CG)的構建表達與純化.中國生物制晶學(xué)雜志, 2006,0 19(6);成功的當數PEG修飾技術(shù)。目前已有多種不同的57 ~ ss9.PEG分子可供選擇,也有多種不同的PEG修飾方法[3] Zhang JS,Liu wY. The mecharien of scion of ricoeanhin on eukaryo.可供利用。其中, PEG定點(diǎn)修飾法,特別是巰基修飾ic rbwsomess RNA N-gyomidase acivity of the crtotoxin. Nucleie Acds法最為常用。通過(guò)PEG修飾,蛋白多肽類(lèi)藥物可降Ree, 192,20(6):1271-1275.[4] Li MX, Yeung HW, Pan LP, e al. Tichoenhin,a potent HV-1 in低免疫原性、改善藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)、降低體內毒性以及增hibitor, can cleave speroiled DNA in vitro. Nucleie Aeids Res, 1991,19加藥物穩定性等。(22):6309- 6312.本研究借助計算機預測,定位了TCS分子上可[s] Wang YY,Oyang DY,Huang H. Erhanced eptotice action of richosan能的抗原決定簇位點(diǎn),即YFF81-83和KR173-174;利thin in HIV-1 infed cll. Biochem Bigphys Res Cmnn,2005,331用重組PCR技術(shù),獲得了兩個(gè)突變型TCS基因，即(4):1075-1080.TSr81-8ACs和TCSkI714cc;通過(guò)基因工程技術(shù),實(shí)[6] Li F,Mei Y,Wang,Y.Tichocanhin ihits antigo- peie T cell此pansion through nitic oxide -mdiated apoptosis pauthway. Cell Immunol,現了目的蛋白在原核系統內的可溶性表達,并通過(guò)2005,234(1):23-30.Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行了純化;應用PEG定點(diǎn)修飾技術(shù)，分別在兩個(gè)突變體第82位和173位引人的半mn inmundeliciency virus rpliacion in acutely and choicallyl infeted cells of lympbogpe and mononuclear phagoeyte lineage. Proe Naul A-胱氨酸殘基上共價(jià)連接了一個(gè)PEG,增加了其分子cad Sci USA, 1989 ,86(8):2844-2848.體積;DNA酶活性分析顯示，與突變型TCS一樣,所[8] Cai x, Ya C, Xu C,a al. lenificatin d the anino scid reidue in構建的兩個(gè)PEC修飾型TCS也顯示出類(lèi)似DNA酶Biophys Res Commm,活性。該研究為基因工程及化學(xué)修飾方法改造TCS中國煤化工提供了一條可行的途徑,值得進(jìn)- - 步探索研究。TYHCNMHG(收稿日期200708-.6)