重組人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子-Ⅰ的聚乙二醇修飾及體外活性

第26卷 第4期重慶理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué))2012年4月Vol.26No.4Jourmal of Chongqing University of Technology( Natural Science)Apr. 2012重組人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子-I的聚乙二醇修飾及體外活性馮一建',陳勇”,張增濤’,黃 程',李紅亮',胡春蘭”,范 開(kāi)',2(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,重慶400054 ;2.重慶富進(jìn)生物醫藥有限公司,重慶400041)摘要:研究大腸桿菌表達的重組人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子-I型N端缺失突變體( ON23KGF-I)的mPEG-馬來(lái)酰亞胺( mPEG-maleimide、mPEG-Mal)修飾 工藝及修飾位點(diǎn)和初步體外生物活性。首先修飾得到聚乙二醇化的ON23KGF-I,然后對ON23KGF-I作還原和非還原質(zhì)量肽圖,確定其各肽段,對ON23KGF-I-m PEG-Mal-20K做還原質(zhì)量肽圖,確定修飾位點(diǎn)。最后,通過(guò)BAF-3細胞對O N23KGF-I國際標準品、ON23KCF-I、ON23KGF-I-m PEG-Mal-20K測活。結果表明,在尿素環(huán)境下,mPEG-MAI被均一修飾在ON23KGF-I的Cys40位。與國際活性標準品相比，ON23KGF-I的活性保留了116%， △N23KGF-I-m PEG-Mal-20K 的活性保留了36%。關(guān)鍵詞:重組人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子;質(zhì)量肽圖;聚乙二醇修飾中圖分類(lèi)號:Q78文獻標識碼:A文章編號:1674 - 8425(2012)04 - 0040 - 05Study on PEGylation of Recombinant Keratinocyte GrowthFactor-I and Activity in vitroFENG Yi-jian' ，CHEN Yong2 ，ZHANG Zeng- tao'，HUANG Cheng'，LI Hong-liang' , HU Chun-lan2, FAN Kail2(1. School of Pharmaceutical and Biological Engineering, Chongqing University of Technology ,Chongqing 400054, China; 2. Chongqing Fagen Biopharmaceutical Co. Ltd. , Chongqing 400041, China)Abstract : The research studied the PEGylation of mPEG -maleimide( mPEC -Mal ) of recombinant ke-ratinocyte growth factor-I mutant deleted on N-terminus( O N23KGF-I) expressed in E. coli, and i-dentified the modified site and preliminary biological activity in vitro. Firstly, get the Pegylated0N23KGF-I; Then, identify all the segments of the peptide by the reduced and non- reduced peptidemass mapping ( PMM). Next, identify the modifed site of △23 KCF-I-mPEG-Mal-20K by the reduced中國煤化工收稿日期:2012-01 -15基金項目:國家科技重大專(zhuān)項資助項目( 2012ZX09103MYHCNMH G科學(xué)基金資助項目(CSTC207BB5412)作者簡(jiǎn)介:馮- -建( 1986- -) ,男,碩士研究生,主要從事微生物與生化藥學(xué)研究;通訊作者范開(kāi)(1963- -) ,男,教授,碩士生導師,主要從事細胞生物學(xué)和腫瘤學(xué)研究。馮一建,等:重組人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子-I的聚乙二醇修飾及體外活性41PMM. Lastly, measure the activity of AN23KGF- I international standard product, AN23KGF-I,ON23 KGF-I-mPEG-Mal-20K with BAF-3 cell line. And mPEG-Mal-20K is modified uniformly onCys40 when urea exists. In contrast to ON23 KGF-I international standard product, the activity ofAN23KGF-I keeps about 116%，and the AN23 KGF-I-m PEG-Mal-20K keeps about 36%.Key words : keratinocyte growth factor; peptide mass mapping( PPM) ; PEGylation人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子( keratinocyte growth fac-tor, KGF)是具有肝素結合特性的成纖維細胞生長(cháng)1 儀器與材料因子( fibroblast growth factor , FGF)家族中的一員，分為KGF-I(FGF-7)和KGF-II ( FGF-10)2種亞2487型高效液相色譜系統與紫外檢測器型。成熟的KGF-I由163個(gè)氨基酸組成,包括( Waters); ESI-Q-TOF micro 型質(zhì)譜儀及Massl-位于1.15.40、102和106位的5個(gè)半胱氨酸殘基。ynx4. 0液質(zhì)聯(lián)用分析軟件( Waters) ;AKTA Purifier天然的KGF-I不穩定,在溫和的溫度下也容易聚純化系統(GE Health); 色譜柱SC300A C8(4. 6合。已經(jīng)證實(shí)KGF-I的N端23個(gè)氨基酸殘基缺mm x 150 mm,5μm) ;ulimate° XB-C18(4. 6 mm x失后的截短形重組人KGF-I (以下稱(chēng)O N23KGF-250 mm ,5μm) ;半胱氨酸(分析純) ;胱氨酸(分析1)的穩定性得到提高,同時(shí)體內外生物學(xué)作用保純) ; mPEG-Mal-20K(北京鍵凱科技有限公司生產(chǎn)); Trypsin singles ( Sigma,貨號17575); 乙腈持不變[23]。在國外,經(jīng)大腸桿菌表達的△N23KGF-I(商品( Sigma ,色譜純) ;實(shí)驗用水為Milli-Q超純水。名Kepivance)在臨床上用于腫瘤放療、化療后的BAF-3細胞株,齊魯制藥生產(chǎn)?？谇徽衬p傷或粘膜炎的治療和保護。2方法△N23KGF-I的半衰期較短,約為4.5 h,需要在放療或化療前后連續給藥6 d,用藥量為60 μg/( kg2.1 ON23KGF-I 的重組制備●d)。為了實(shí)現延長(cháng)其體內半衰期,進(jìn)--步降低大腸桿菌菌體經(jīng)IPTG誘導表達△N23KGF-I。免疫原性以及達到改6次連續給藥1次的目的,在檸檬酸三納/Tris的緩沖體系中,用常規的化學(xué)可以對ON23KGF-I進(jìn)行聚乙二醇修飾。0N23KGF-I的N末端是KGF發(fā)揮生物學(xué)作破菌法破菌,再用SP Sepharose F. F.純化,然后在用的重要區域,對ON23KGF-I的N末端進(jìn)行PEG△N23KGF-樣品中補加半胱氨酸-胱氨酸,摩爾濃修飾后其體外生物活性降低明顯，所以不能對度分別為10 mmol/L和1mmol/L,在pH值為8.0,30 C下反應0.5 h,之后在含1 mmol/L的Tris透，△N23KGF-I進(jìn)行N末端修飾[4]。而0 N23KGF-I析液中透析復性過(guò)夜。用Heparin Sepharose6 F.含有17個(gè)賴(lài)氨酸殘基,對其定點(diǎn)修飾不能保證其F.含鹽洗脫復性樣品,再通過(guò)SDS-PAGE和RP-修飾的均一性,純化難度極大,因此也排除。HPLC對樣品進(jìn)行純度分析和定量分析?！鱊23KGF-I只含有3個(gè)半胱氨酸殘基( Cys40,2.2△ N23KGF-I質(zhì)量肽圖分析102 ,106) ,其中Cys102-106已經(jīng)形成一-對二硫鍵,參考文獻[5-6]的方法對O N23KGF-I做還原只有Cys40一個(gè)半胱氨酸殘基處于游離狀態(tài),因和非還原質(zhì)中國煤化工此,可以選用常用的mPEG-馬來(lái)酰亞胺(mPEG-2.3△ N23=修飾CNMH Gmaleimide、mPEC-Mal)對Cys40進(jìn)行修飾。本文參考文獻[7」,改變具修飾pH值(6.5、7.0、的主要目的是對O N23KGF-I的mPEG-Mal修飾工7.5),蛋白與mPEC-Mal-20K的摩爾比為1比4,藝進(jìn)行研究,初步確認修飾位點(diǎn)和體外活性。反應時(shí)間為3 h,對蛋白進(jìn)行飽和修飾。42重慶理工大學(xué)學(xué)報研究發(fā)現，mPEG-Mal-20K 不能修飾到94.0kDa-△N23KGF-I.上,因此,考慮在變性劑尿索的環(huán)境45.0kDa-33.0kDa-下修飾目的蛋白。在尿素濃度為1、2、3、4 molL,20.0kDa一023KGF-I蛋白與mPEG-Mal-20K的摩爾比為1比4,pH值14.4kDa- +為6.5的條件下修飾3 h。再通過(guò)SDS-PAGE和RP-HPLC對樣品進(jìn)行純度分析和定量分析。2.4 O N23KGF-I-mPEG-Mal-20K的純化12345△N23KGF-I-mPEG-Mal-20K樣品稀釋5倍,1 ~3:0.4、0.5.0.6 M NaCl SP elution;經(jīng)SP Sepharose F. F.純化,方法同本文2.1節。4~5:0.5 、0.6 M NaCl Heparin elution2.5△ N23 KGF -I-mPEG-Mal-20K質(zhì)量肽圖分析圖1樣品凝膠 電泳參考文獻[5-6]的方法對△N23KGF-I-mPEG-50000Mal-20K做還原質(zhì)量肽圖。4002.6△ N23KGF-I及O N23KGF-I-mPEG-Mal-20K300體外活性測定2502.6.1 供試品溶液的制備150100樣品( ON23KGF-I國際標準品、△N23KGF-1、_兒△N23 KGF-I-mPEG-Mal-20K)用無(wú)菌超純水稀釋,2468101214161820222426當稀釋至4μg/mL時(shí)用0.25%FBS+培養液稀釋t/min20倍,得200 ng/'mL, 以此為起始濃度,做4倍系圖2△N23KGF-I Sepharose F. F.純化列稀釋,共10個(gè)稀釋度,每個(gè)濃度做2個(gè)孔。3.2△ N23KGF-I質(zhì)量肽圖分析2.6.2活性測 定參考文獻[5],由圖3、4可以得出結論:BAF-3細胞株(轉染了KGF-2受體)用常規方△N23KGF-I的Cys102和Cys106形成了二硫鍵。法培養,使1 mL溶液含2.0x10* ~4.0x10'個(gè)細胞。離心收集細胞,用0.25%FBS+培養液洗細胞3次,用0.25% FBS +培養液配成每1 mL含2.0x10°~4.0x 10個(gè)細胞的細胞懸液,37C備用。在96孔細胞培養板中加人供試品溶液50μL/孔,并設立陰性孔2孔,再加入細胞懸液50 μ[/孔。置37C、5%二氧化碳培養48 h。每孔加入MTS溶液20 μL,于379C .5%二氧化碳培養0.5 h。250/min混勻后在酶標儀上,波長(cháng)490nm處測定吸光度,圖3 O N23KGF-I還原質(zhì)量肽圖記錄并分析處理結果。3.3 ON23KCF-I 的Cys40聚乙二醇修飾3實(shí)驗結果與討論實(shí)驗發(fā)現,在沒(méi)有變性劑的情況下,mPEG-Mal中國煤化工GF-I.上。在pH值為3.1 △N23 KGF-I的重組制備:YHCNMHG時(shí),修飾率只有50%;通過(guò)洗脫條件的優(yōu)化，得到高純度樣品(圖1、當尿素濃度達到3 mol/L時(shí),修飾率達到85%左2),純度達到98%。右;當尿素濃度達到4 mol/L時(shí),修飾率達到95%馮一建，等:重組人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子-I的聚乙二醇修飾及體外活性43(圖5 ~6)?！鱊23KGF-I-mPEC-Mal-20K的RP-是圖8中黑框的肽段,即含有Cys40的肽段,證明HPLC出峰時(shí)間和△N23KGF-I的出峰時(shí)間相同，mPEG-Mal-20K修飾到了△N23KGF-I的Cys40。不能用其進(jìn)行RP-HPLC分析。t/min山業(yè)圖7 ON23KGF-I -mPEC-Mal-20K質(zhì)量肽圖.1230503353圖4 ON23KGF-I 非還原質(zhì)量肽圖SYDYMEGCDI RVRELFCRTQ WYLRIDKRGK VKGTQEMKNN YNIMEIRTVA VANAIKGVE103 1132 123 133 143SEFYLAMNKE GKLYAKCN EDCNKEUIL ENHYNTYASA KWTHNGCEMF VALNQKGIPV16315394.0kDaRCEETKKEQK TAHFLPMAIT66.2kDa45.0kDa日8 ON23KGF-I氨基酸序列33.0kDa26.0 kDa3.6 ON23KGF-I 及ON23KGF-I-mPEG-Mal-20K20.0kDa體外活性測定港14.4kDa△N23KGF-I有促進(jìn)表皮細胞增生的生物學(xué)1~3:pH值為6.0.6.5.7.0時(shí)的修飾情況;活性的作用。蛋白活性越高,細胞生長(cháng)越好,顯色4: AN23KCF-I .越深。通過(guò)對實(shí)驗結果的分析和處理(見(jiàn)表1)可圖5不同pH值的mPEG-Mal修飾ON23KGF-I情況以看出,本實(shí)驗純化的蛋白活性良好。表1 蛋白活性66.2 kDaSamplesActivity/(IU●mg"')%0N23KGF-II. s. P1.0x 10°10026.0kDa△N23KGF-I1.16x 10°116O N23KGF-I-mPEG-Mal-20K3.6x 10°14.4kDa 141~4:尿素為1.2.3 .4 mol/L時(shí)修飾情況;4結束語(yǔ)a: 0 N23KGF-I mPEC-Mal-20K圖6 不同尿素濃度的mPEG-Mal修飾△N23KGF-I情況通過(guò)對△N23KGF-1做還原、非還原質(zhì)量肽圖3.4△N23KGF-I-mPEG-Mal-20K 的純化以及對△N2KCHPFE角慌化華牧還原質(zhì)量肽當修飾后的樣品經(jīng)過(guò)SP Sepharose F.F.后,圖,可以確iY片CNMHGPH值為6.5能夠得到純度達到95%的修飾蛋白。時(shí), mPEC-Mal-20K硼實(shí)均一修飾到了O N23KGF-I3.5△ N23KGF-I-mPEG-Mal-20K質(zhì)量肽圖分析的Cys40.上, 而不是修飾在Cys102或Cys106上。由圖7可見(jiàn)只有位置C的肽段消失,而這正在沒(méi)有尿素的情況下，蛋白不能被修飾，可能是44重慶理工大學(xué)學(xué)報Cys40處于ON23KGF-I空間結構的內部,缺少與PEG的接觸機會(huì )的緣故。在體外活性初步測定參考文獻:中,對比O0 N23KGF-I國際活性標準品,△N23KGF-[1] Jffrey S R,Hiroyuki 0. Purification and characterizationI的活性保留了116%，△N23 KGF-I-mPEG-Mal-of a newly identified growth factor specific for epithelial20K的活性保留了36%，說(shuō)明本實(shí)驗純化得到的cells[J]. Biochemistry , 1989 ,86 :802 806.蛋白活性已達到標準品的水平。標準品的活性相[2] Dina Ron ,Donald P B ,Paul W. Finch. Expression of Bio-對低,這可能是標準品存放的時(shí)間相對較長(cháng),活性logically Active Recombinant Keratinocyte Growth Factor[J]. Biological Chemistry , 1993 ,268(4) :2984 -2988.有所下降?！鱊23KGF-I-mPEG-Mal-20K 的活性偏Eric H, Timothy 0. Enhanced Stability of recombinant低,則可能是因為大分子PEG占據了很大的空間,keratinocyte growth factor by mutagenesis Protein Engi-影響了蛋白與受體的結合,影響了蛋白的生物活neering[ J]. Design & Selection ,2006 , 19(4) :147-153.性發(fā)揮。但是如果其生物學(xué)作用能夠維持到3d[4] 宗憲磊,蔡景龍角質(zhì)細胞生長(cháng)因子研究進(jìn)展{J].中國修復重建外科雜志,2009 ,23(2) :188-192.以上(效果等同于3 d連續給藥△N23KCF-I),雖然單次給藥量增加了,但給藥次數減少了,病人的張增濤,陳清,羅嵐,等.重組人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子1型缺失突變體二硫鍵配對與生物活性[J].重慶理工痛苦減小了,這還是有優(yōu)勢的。3 mol/L尿素的已大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2010,24(5) :44-53.經(jīng)改變了ON23KGF-I原本的空間構象,修飾后的[6] 饒舂明,陶磊,史新昌,等.重組人干擾素d Ib質(zhì)量肽空間結構也可能發(fā)生了改變,因此很可能產(chǎn)生新圖分析及二硫鍵定位[J].藥物分析雜志,2007,27( 10) :1505-1510.的生物學(xué)活性,這需要實(shí)驗來(lái)證明。[7] Antoni Kozlowski. Maleamic acid polymer derivatives and在常規條件下,若蛋白不能被PEG或其他大their bioconjugates [P]. USA patent: US 7329721 B2.分子修飾,可以考慮在其中補加適量的變性劑后2008-02-12.再進(jìn)行修飾。(責任編輯劉舸)(上接第10頁(yè))[8] 吳光強,楊偉斌,秦大同.雙離合器式自動(dòng)變速器控制系統的關(guān)鍵技術(shù)[J].機械工業(yè)學(xué)報,2007 ,43(2):13[1] 胡建軍,李光輝,伍國強,等.汽車(chē)起步過(guò)程離合器傳9] 操劍鋒.濕式DCT仿真技術(shù)研究[D].長(cháng)春:吉林大學(xué),2007.遞轉矩精確計算分析[J].汽車(chē)工程,2008 , 30(12):[10] 張世義,李光輝.雙離合器自動(dòng)變速汽車(chē)起步模糊控1083 - 1086.制研究[J].重慶交通大學(xué)學(xué)報,2009(8) :794 -799.[2] 孫文凱,嚴運兵,劉旺.汽車(chē)離合器起步接合過(guò)程的仿[1]李光輝.雙離合器自動(dòng)變速系統離合器轉矩控制研究真研究[J].武漢科技大學(xué)學(xué)報,2006,29 (4):368[D].重慶:重慶大學(xué),2008.-371[12] 屠海峰.基于DCT結構的動(dòng)力換檔過(guò)程研究[D].重[3]余志生. 汽車(chē)理論[M].北京:機械工業(yè)出版社,2004:慶:重慶理工大學(xué),2010.[13] Manfred Mitschke , Henning Wallentowitz. 汽車(chē)動(dòng)力學(xué)[4] 葛安林.車(chē)輛自動(dòng)變速理論與設計[M].北京:機械工[M].北京;清華大學(xué)出版社,2009.業(yè)出版社, 1991:107 - 108.[14] 吳佐銘,褚超美,黃明禮.雙離合自動(dòng)變速器技術(shù)研究[5] 黃建明,曹長(cháng)修,蘇玉剛.汽車(chē)起步過(guò)程的離合器控制進(jìn)展與應用現狀[J].機械設計與制造,2008(11):241[J].重慶大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2005,28(3):91- 243.-94.[15]中國煤化工于A(yíng)MESIM 的DCT車(chē)輛6] 李瑜婷,趙治國,章桐. DCT變速器雙離合器壓力最優(yōu)“TCH.CNMH G}.重慶理工大學(xué)學(xué)報:自控制方法的仿真研究[J].中國機械工程,2010,21u11/v- 11.(12):1496 - 1501.[7]劉 文卿.實(shí)驗設計[M].北京:清華大學(xué)出版社,2005.(責任編輯陳松)