聚乙二醇修飾重組人天冬酰胺酶的研究

第15卷第2期:32生物技術(shù)Vol. 15,No.2:322005年4月BIOTECHNOLOGYApr.2005子對酶具有- -定的抑制作用。參考文獻:3結論[1]Bemard P 0 H,Andrew M H, David J B, a al. Crystal structure of gycyl3.1經(jīng)Macro- Pep High s Support離子交換層析得到很多洗endopeptidase frome Carica papayu:a cysteine endopcpidase of unusual sub-脫峰,其中洗脫峰5為木瓜凝乳蛋白酶,經(jīng)SDS- PAGE電泳檢strate peifcit[J]. Biocbeniltry, 1995,34:13190- 13195.[2]Eugene J, Norby M D, Manucher J M D.Cninuing expeience with chy測,其已達到電泳純。3.2該酶在37C保溫 24h后其活力喪失來(lái)只有原來(lái)的7.mulelyi[J]. The Mount Sinai Journal of Medidne, 20067(0):31-15% ,0.2%(m% )的Na*和0.02mol/L的Ca2*對其有明顯的激313.[3][德]B. 施特爾馬赫著(zhù).錢(qián)嘉淵譯.酶的測定方法[M].第1版.中活作用。低濃度的K*、Cu?*對其也有激活作用。國輕工業(yè)出版社, 192.242 - 255.聚乙二醇修飾重組人天冬酰胺酶的研究郭橋' ,姜春懿3 ,張淑子3 ,李文波' ,吳永革2* ,李惟?(1.長(cháng)春生物制品研究所，吉林長(cháng)春130062;2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(cháng)春130012;3.吉林亞泰(集團)股份有限公司藥物研究與開(kāi)發(fā)中心,吉林長(cháng)春130033)摘要:天冬酰胺酶對治療急性淋巴細胞白血病和某些腫瘤疾病有很好的療效,但由于其在人體內所產(chǎn)生的副作用一過(guò)敏反應限制了它的應用。目的:運用化學(xué)修飾劑聚乙二醉對天冬酰胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾,以降低其免疫原性,提高其在體內的半衰期;并使修飾后的天冬酰胺酶的活性保持較高的水平。結果:修飾后的天冬酰胺酶的免疫原性降低為原來(lái)的20- 30% ;用胰酶水解24h沒(méi)有變化;而其比活力為未修飾酶的23%。該結果已經(jīng)具備了很大的臨床應用價(jià)值。關(guān)鍵詞:天冬酰胺酶;化學(xué)修飾;白血病;聚乙二醇...中圖分類(lèi)號:Q812文獻標識碼:A 文 章編號:1004- 31(2005)02 -0032 -04Studies on the Recombinant Human Asparaginase Modified with Polyethylene GlycolCUO Qiao' ,JIANG Chun - yi ,ZHANG Shu- zi ,L Wen- bo' , WU Yong- ge?* ,LI Wei(i. Changchun Istitute of Biologial Products ,Changchun 130062;2. Life Science College of Jjlin University,Changhum 130012;3. R&D Center of Jini Yahai Co. Ltd,Changchumn 10033,.R. Chin)Abstract: Asparaginase shows good curative lfet on acute lymphoblastice leukemia and somne tumor ilneesese. But in vivo the side efet - llegeylinits its clinical aplication. Asparaginse was modified by activated PEG2 in the presence of substrate protection. The inmunogenicity of the mod-ifed enzyme was decreased to 20 - 30% of that of unmodifed enzyme. No proteolysis was found afer trypsin was added.It' S residual enzyme a8C~tivity was 23% . The result shows a very good potential value on clinical application.Key wrdsapagigiasdife;limphoblasti leukenia;PBG2天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺,是-種重要的抗癌藥物。物天冬酰胺對其進(jìn)行了保護,再用活化的PEC2對天冬酰胺酶20世紀60年代發(fā)現一些白血病細胞缺少天冬酰胺合成酶，因進(jìn)行修飾,然后,對修飾前后的酶的一些性質(zhì)進(jìn)行了測定和比而不能產(chǎn)生一定數量的此種重要的氨基酸以維持細胞的生存較,結果,在降低了其免疫原性和延長(cháng)了其半衰期之前提下，能力,因此,左旋天冬酰胺酶對治療急性淋巴細胞白血病有很使其殘余活力達到23%,大大擴展了該種治癌藥物的應用前重要的幫助"。目前,左旋天冬酰胺酶已經(jīng)與氨甲喋呤、阿糖景胞苷(Cyarbine)一起被用于白血病的治療1口]。但是,限制左材料和方法旋天冬酰胺酶治療作用的主要障礙是強烈的過(guò)敏反應,此外，1.1 材料使用后產(chǎn)生的中和抗體和血液中的蛋白酶的水解大大降低這1.1.1實(shí)驗材料種藥物的半衰期也限制了它的應用。解決上述的問(wèn)題的方法單甲氧基聚乙二醇、氛尿酰氯熒光胺L-谷氨酸草酰乙酰氨之一就是對天冬酰胺酶進(jìn)行適當的化學(xué)修飾?；D移酶(COT)、天冬酰胺酶購于Sigma Co. Lld; Sephacryl S-用高分子化學(xué)修飾劑對蛋白質(zhì)和肽類(lèi)分子進(jìn)行化學(xué)修飾200 high resolution 購于Pharmacia Co. Ld;L-蘋(píng)果酸脫氫酶已經(jīng)成為生物技術(shù)與生物醫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在眾多的高(MDH)購于A(yíng)MRESCO Co. Ld; BCA試劑盒購于Pierce Co. Iud; .分子化學(xué)修飾劑中,以線(xiàn)性的、無(wú)毒的、無(wú)免疫原性的和具有其它試劑均為市售分析試劑;巴比西鼠( Balb/c)購于長(cháng)春生物雙歧性聚合物性質(zhì)的聚乙二醇(PEG)對蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾最制品研究所;羊抗鼠二抗購于.上海生工公司。引人關(guān)注'。PEG可以連接到天冬酰胺酶上與活性位點(diǎn)無(wú)關(guān)的其他位點(diǎn)上，隱蔽了該酶的抗原表位,降低其免疫原性(。,0-(CH2CH2O) -CH;PEC還可以防止網(wǎng)狀內皮系統對天冬酰胺酶的吸收,從而大CH(CHC1H)-OH+Cl大減少了生成的抗體攻擊天冬酰胺酶的可能性,延長(cháng)了這種Cl0-(CH2CH20)-CH,藥物的循環(huán)半衰期°]。另外，它可以使得小分子底物天冬酰胺自由通過(guò),進(jìn)人酶的活性位點(diǎn)進(jìn)行催化反應。0-(CH2CH2O) - CH320世紀70年代，Davis首先對蛋白質(zhì)的PEG化學(xué)修飾進(jìn)Protoin-NH-行了較系統的研究(6。后來(lái)相繼有一些關(guān)于用PEG的衍生物O-(CH2CH2O)n- CH,Pritein-NH2對天冬酰胺酶進(jìn)行化學(xué)修飾的報導,所使用的方法和PEG的團1天冬酰胺酶 PEC2修飾的示意圖銜生物不同,但它們所獲得的結果都不很理想,修飾后的殘余Fig.1 The schematic digum of asparnginse modifed by PEC2.活力較低,一般在 10%左右”。由于酶在結合底物時(shí)的構象1.1.2 試劑比較穩定,因此,本研究在對天冬酰胺酶進(jìn)行修飾前先用其底中國煤化工i B,組成如下:二酸,0.25mg/mL NADH,1UCOT.YHCNM H G Ha緩沖液(pH8.收稿日期:004-09- 16;修回日期:2005 -01 -09作者簡(jiǎn)介:郭橋(1966- ),男，碩士,醫學(xué)生物學(xué)高級工程師,從事細胞45)。因子的研究工作,E- mil: giao1966@ sohu. com; *通訊聯(lián)系人:吳永溶液B:含1.25mg/mL L-天冬酰胺的50mmoI/L Tris- HCl革(1965-),博士,剛教授,從事分子生物學(xué)和研究，E - mail; yongewu緩沖液(pH8.45)。@ sohu. cm, Tel:0431 - 5531798,發(fā)表論文10余篇、著(zhù)作2部。1.1.3 儀器2005年4月聚乙二醇修飾重組人天冬酰胺酶的研究33UV- 2501PC紫外分光光度計為日本島津公司產(chǎn)品;熒光or分光光度計為日本島津公司產(chǎn)品;超濾器為美國AMICON公8ml66m!司產(chǎn)品;凍干機為德國CHRIST公司產(chǎn)品。1.2 方法1.2.1修飾劑的合成與活化天冬酰胺酶的PEG修飾的原理見(jiàn)圖1,PEG首先需用氰尿酰氯進(jìn)行活化,經(jīng)過(guò)活化的PEG可以與天冬酰胺酶中游離的- NH2反應,通過(guò)共價(jià)鍵結合到酶上,其中，如果在氚脲酰氯上結合一個(gè)PEC分子,稱(chēng)之為PEC1,結合二個(gè)PEC分子,稱(chēng)之為V(m)PEC2。具體方法如下:團3非修飾天冬酰胺酶的層析圄譜將下列物質(zhì)裝人500ml圓底燒瓶:20g單甲氧基聚乙二醇，.Fig.3 The gel fltration chromatogmuphy of unnxdied sparaginase100ml無(wú)水苯(除水處理) ,5g分子篩3A(加熱烘干), 10g無(wú)水D碳酸鈉(加熱烘干) ,365mg氰尿酰氯。80°回流44h。將反應63ml70ml液慢饅傾出,離心。向上清液中加人200ml無(wú)水石油醚,沉淀，抽濾,將沉淀分離出。用800ml無(wú)水石油醚分6次洗滌沉淀。在37C的條件下干燥過(guò)夜,稱(chēng)重。1.2.2天冬酰胺酶的化學(xué)修飾將下列物質(zhì)裝入 100ml小燒杯: 10ng天冬酰胺酶, 2ml硼酸緩沖液,88pI(0.4mol/L)天冬酰胺。37C搖床振蕩30min。向上述反應混合物中加入990mg活化載體(PEG:NH2 = 15:1)。V(ml)37C搖床振蕩1ho加人80ml預冷的0.1mol/L(pHl0)磷酸緩沖圈4修飾天冬酰胺酶的層析圖譜液。超濾,將超濾截留液凍干,稱(chēng)重。Fig.4 The gel flration chonatogoaply of modified apraginge1.2.3修飾后的天冬酰胺酶的層 析分析和分離將50mng修飾后的天冬酰胺酶溶于1ml 15mmol/L(pH7.0)activated PEG 1、的磷酸鹽緩沖液中,上樣于Sephacryl S- 200 high resolution柱,(ms50000流速為10m/h。將修飾酶層析后收集產(chǎn)物凍干,將凍干后的產(chǎn)物溶于少量的蒸餾水中,用PD-10除鹽柱對溶解液進(jìn)行除鹽,真空凍干。1.2.4修飾天冬酰胺酶的生化性質(zhì)研究St1.2.4.1修飾酶的蛋白質(zhì)濃度測定采用BCA法,具體方法見(jiàn)文獻[8]。1.2.4.2修飾酶的修飾度測定熒光胺可以與- -級胺 反應生成熒光化合物,而熒光化合20hM物所產(chǎn)生的熒光與一級胺的含量成正比,這種熒光的產(chǎn)生可以穩定幾個(gè)小時(shí),而過(guò)量的熒光胺在1 min內就會(huì )被水解掉而activated PEG 2、I不影響熒光的測定。因此,通過(guò)測定體系中的熒光強度就可(mw.10.000)以測得該酶中-級胺的數量,因此,就可計算出被PEG結合的- -級胺的數量,從而計算修飾度。60h取4支5ml印管,依次分別加人0pg/ml、1p/ml.2rg/ml、4yg/ml 的天冬酰胺酶(或修飾酶)溶液1. 5ml,并依次加入0.2035ml熒光胺試劑。室溫下放置10min后,分別測熒光強度(激Retention time(min)發(fā)波長(cháng)為390nm,發(fā)射波長(cháng)為475nm)。圖5 PEC的活化程度與時(shí)間的關(guān)系比較1.2.4.3修飾酶的酶活性測定圖中曲線(xiàn)為PEG在活化不同時(shí)間后的凝膠過(guò)濾HPLC圖譜天冬酰胺可以被天冬酰胺酶水解為天冬氨酸和氨,水解Fig.5 Relation betwen ativied degree and time of PEG后的產(chǎn)物天冬氨酸在谷氨酸草酰乙酰氨基轉移酶(GOT)的作The curves are chronatography of gel flration HPLC of which PEC is activitied用下與a-酮戊二酸反應生成草酰乙酰胺和谷氨酸，而生成的草酰乙酰胺在蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的作用下與NADH反應生將800pl的溶液A和200pJ的溶液B加到石英比色杯中，成蘋(píng)果酸和NAD* (見(jiàn)圖2),NADH在340nm處有特征的光吸放人UV- 2501PC紫外分光光度計中, 37C保溫1min,加入天收,隨著(zhù)反應的進(jìn)行,吸光度隨著(zhù)會(huì )減少,吸光度減少的速率冬酰胺酶液,測反應速率。則體現了天冬酰胺酶的活性。1.2.4.4抗水解能力測定將一定量的非修飾酶和修飾酶溶于50mmoVLTris-HCl(pH8.8)(含1mmol/LCaCl, ).然后加入5mg胰酶,37C保溫5、L-AaparagineA-apaegDL-Aepargne . NH,12.24h,中國煤化工進(jìn)行柱層析分析。L-Aaparagine + a-Ketoglutarate-Oxaloacetate + L-Glutamate1.2.4.5MDH尾利CNMHGOxaloacetate + NADH -0at340m Mlate + NAD*三種注射液: (1)非修飾酶(2m/mL);(2)修飾酶(20mg/mL);(3)生理鹽水。每組2只，10J/只,每周注射一次。尾靜團2測定天冬酰胺酶活性的反應式脈取血,離心,取血清,凍存。然后用EISA法檢測。Fig.2 Reaction o measurenent of asparaginase activity34生物技術(shù)第15卷第2期2結果與討論75%。2.1天冬酰胺酶的修飾經(jīng)過(guò)活化的PEC可以與天冬酰胺酶中游離的- NH反應,通過(guò)共價(jià)鍵結合到酶上。修飾后,天冬酰胺酶的免疫原性應該隨被修飾程度的升高而減小，在修飾時(shí)采取了修飾劑與酶中的一NH2的摩爾比為15:1的加量關(guān)系。修飾后,采用分子篩層析法對修飾情況進(jìn)行初步鑒定。結果見(jiàn)圖3和圖4。由于層析柱的柱料屬于分子篩材料,故先流出柱的是分V(m)子量大的物質(zhì),在上述的層析圖譜中出現了兩個(gè)峰，而層析的圉6修飾天冬酰胺酶經(jīng)胰酶水解后層析曲線(xiàn)樣品是純的天冬酰胺酶，所以推測前面的峰所代表的物質(zhì)可曲線(xiàn) I為消化24h;曲線(xiàn)2為消化12h:曲線(xiàn)3為消化Sh能為天冬酰胺酶分子的聚集體，而后面的峰則可能為天門(mén)冬Fig.6 The el flmion droanlopt d madd spengee dgrsedby .酰酶的單體。tpein. The curve 1:digsted for 24h;The cure 2:digsted for 12h;The caurve在修飾酶的層析記錄圖中,出現了兩個(gè)峰,對于出現的兩3:digeted for Sh.個(gè)峰有幾種解釋:(1)在非修飾酶層析圖譜中就有兩個(gè)峰,在2.3.3修飾酶的酶活性測定修飾的過(guò)程中兩個(gè)峰對應的物質(zhì)分別被活化的PEG修飾了，酶活力定義:1U為在最適反應條件下,每分鐘轉化1ymol但其修飾的程度不同,導致了修飾后產(chǎn)物的分子量出現了差天冬酰胺所需的酶量。異,從而在修飾酶的層析圖譜中出現了兩個(gè)峰重疊現象;(2)結果,修飾后天冬酰胺酶的活力降 為修飾前的23%。修飾時(shí)所用的活化載體是用單加氧基聚乙二醇和氰脲酰氯經(jīng)2.3.4 抗水解能力結果與分析過(guò)回流制海的，單加氧基聚乙二醇和氰尿酰氯的化合程度與采用胰蛋白酶 消化修飾或非修飾的天冬酰胺酶作為其抗反應時(shí)的pH值、兩種物質(zhì)的量的比例及反應時(shí)間等因素有酶水解能力的指標,然后,用分子篩層析法鑒定胰蛋白酶消化關(guān),在實(shí)驗中給定的物質(zhì)的量的關(guān)系下,化合的程度主要與反的程度。 結果見(jiàn)圖6。非修飾的天冬酰胺酶的胰酶水解液在層析圖中沒(méi)有峰，從上圖可以發(fā)現隨反應時(shí)間的延長(cháng)氰睬酰氯與單加氧基可見(jiàn)完全或大部分被水解,而修飾酶的峰幾乎沒(méi)有變化,表明聚乙二醇的化合程度是增長(cháng)的,所以在修飾酶層析圖譜上出在被 PECr修飾后天冬酰胺酶的抗水解能力顯著(zhù)增強,同時(shí)也現的兩個(gè)峰可能是由于活化載體為混合物造成的,另外，如果從另 -一個(gè)方面顯示出修飾的成功?；罨d體是PBG和PEC2的混合物，由于PECG和PEG,與非表2修飾和非修飾天冬酰酶的活力測定修飾的天冬酰胺酶的結合力的不同也可以造成非修飾酶的修Table2 Activity d modifed anummodsparngnse飾度的不同從而導致兩個(gè)峰的出現。非修飾酶活力比活力 修飾酶活力 表觀(guān)比活力 實(shí)際比活力2.2修飾劑的選擇與合成(U/m)(U/mg)(U/ng)(Umg)由于天冬酰胺酶在動(dòng)物體內所體現的免疫原性與它的分93932.6子構象和分子中其它酶活性,如谷氨酰胺酶活性有關(guān)，所以可注:表觀(guān)比活為以修飾酶的質(zhì) 量作為蛋白質(zhì)的質(zhì)量計算的比活以用某些試劑對其進(jìn)行修飾從而改變其構象或屏蔽其內部的力 :實(shí)際比活力為以測得的修飾酶中的蛋白含量計算的比活力。某些活性位點(diǎn)以消除或降低其免疫原性,許多化學(xué)修飾劑，如:2.4 修飾后天冬酰胺酶免疫原性的測定氨基酸聚合物、多糖類(lèi)物質(zhì),脂類(lèi)物質(zhì)已被用于酶的修飾，但是分別以非修飾酶和修飾酶免疫鼠,免疫4次以上(每周1只有為數不多的試劑被證明為適合的,酶經(jīng)-些化學(xué)修飾劑修次)之后,取靜脈血(抗血清),通過(guò)EILISA法測定血清中產(chǎn)生飾后,雖然其免疫原性降低,但同時(shí)其活性也大大降低?？贵w的相對濃度,結果修飾酶的血清抗體濃度明顯低于非修為了獲得低免疫原性而又保留很高酶活性的天冬酰胺飾酶,約為非修飾酶的20- -30% ,表明修飾酶的免疫原性明顯酶,本實(shí)驗采用了氰脲酰氯活化的PEG作為修飾劑，被修飾的降低。另外,在免疫鼠的過(guò)程中,發(fā)現修飾酶組的死亡率明顯天冬酰膠酶中的某些基團帶有兩條聚乙二醇鏈(EG2),用它低于非修飾酶組,這很可能是由于免疫 原性的降低所至。作為修飾劑比只有一-條聚乙二醇鏈的PEG,更有效率。3結論2.3修飾酶的性質(zhì)研究本研究用PEC對天冬酰胺酶進(jìn)行了化學(xué)修飾，其目的是2.3.1修飾酶的蛋白質(zhì)濃度測定在盡可能保持其活性的前提下降低其免疫原性，以更適于臨由于天冬酰膠酶經(jīng)化學(xué)修飾后,一些測定蛋白含量的方床的應用。法受到干擾,所以不能使用。本研究使用BCA法測定非修飾本研究采取了先用天冬酰胺酶的底物天冬酰胺進(jìn)行保酶和修飾酶的蛋白濃度，發(fā)現其線(xiàn)性關(guān)系比較好適用于修飾護,同時(shí)使用大劑量的修飾劑，使其免疫原性降為原來(lái)的20-酶蛋白依度的測定結果測得的修飾天冬酰胺酶的蛋白含量30% ,并大大提高了其抗胰酶水解的能力，從而使其半衰期更約為29%(W/W)。長(cháng)。經(jīng)修飾后相同濃度下修飾酶的活性降為原來(lái)的23%。雖2.3.2修飾酶的修飾 程度測定然活性有一定程度的降低，但其更長(cháng)的半衰期可以彌補這種修飾度(%) =(-1ng/ntom)x 10%0降低。有文獻報導.修飾酶活性是與免疫原性成-定的相關(guān)Intu. = Intgm /修飾酶的蛋白質(zhì)含量性,即免疫原性降得越低,其活性也越低。因為，在用修飾劑Imga為修飾酶的熒光強度，Ine為非修飾酶的熒光強度封閉抗原表位的同時(shí),必然影響酶的活性部位的構象及與底(注:Intg ,Intem為同濃度下測定的熒光強度)。物的中國煤化工表l PEC修飾天冬酰胺酶的修飾度測定底物YHCNMH(C酶進(jìn)行前，選將該酶用其Table ! Miciein degrce d umangnge modied by PEGC的結果。具有可以進(jìn)行:ln中國修飾酶的蛋白質(zhì)含量(WV) 國修飾度(先)臨床應用的價(jià)值。4459829%15參考文獻:由表1可知,采用該方法修飾的天冬酰胺酶的修飾度為[1]Ana I Fenande,Creory Gregriadis. Poyilylaledl apapginepepeetiomn, ativity end pamamckinetie[J]. Biochimica t Bioplbysica Acta, 1997,7第15卷第2期:35生物技術(shù)Vol. 15,No.2:352005年4月BIOTECHNOLOCYApr.2005131(1):26-34.[6]Sares Alexndre Leuth, Guimanaes Clodson Manso, Polakiewicz Brorislaw,[2 ]Bushman Jannifer , Palmieni Diane, Whima Herbert C, et al . Insight into thee al. ffects of palyethylene gdycol atachment on physicochemical and biologi-mechanism of aparginase - induced dqleion of anihonbin四in treatmentcal sability of E. coli L- aspanginse[J]. Intermational Jourmal of Pharma-of childhood acute lymphoblastice leukemia[J]. Leukemia Research, 2000, 24cutis,2003,237(1-2):163 - 170.(7)559 -565.[7]Davis F F. The onign of pegnogy[J].Advanced Drug Delivery Reriews,[3]Ayako Matsushima, Yoh Koden, Misao Hiroto, at al . 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Bichem, 1989, 189<(1):nogrmicity and nigricit d eparnginese: iplicatioin in is pemerananico[J]..136- 139.Intermational Jourmal of Parmeutics,2001,217(1 -2):215 - 24.樹(shù)狀多節孢誘變株與出發(fā)株間同工酶差異初探解玉紅' ,張鵬3 ,付博',于森3 ,張海英3 ,周東坡*(1.天津理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院,天津3001912;2. 徐州師范大學(xué)生物系微生物教研室,江蘇徐州21116;3.齊齊哈爾大學(xué)生命工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾160161 ;4.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150080)摘要:為了探索紫杉醇產(chǎn)生菌發(fā)酵產(chǎn)生紫杉醇的機理，對紫杉醇產(chǎn)生菌樹(shù)狀多節孢HQD33和經(jīng)LiCl、紫外線(xiàn)誘變產(chǎn)生的紫杉醇產(chǎn)量正突變的HQD33誘變菌株(P50- 2、PI - 6、P5 - 8、130- 2、150- 4)的同工酶和蛋白質(zhì)(如:過(guò)氧化物酶同工酶脂酶同工酶、淀粉酶同工酶、過(guò)氧化氫酶同工酶以及可溶性蛋白和游離組蛋白)的電泳圖譜進(jìn)行了分析,結果顯示:除過(guò)氧化氫酶同工酶以外其它酶和蛋白質(zhì)的電泳圖譜都有不同程度的改變?？沙醪酵茢?，誘變使紫杉醇產(chǎn)生菌的分子生物學(xué)背景發(fā)生了變化，由于遺傳背景的改變導致了產(chǎn)生菌細胞內部蛋白質(zhì)和同工酶的變化，可進(jìn)一一步認為紫杉醇的產(chǎn)生與試驗所選的同工酶和蛋白質(zhì)有一定的相關(guān)性。關(guān)鍵詞:樹(shù)狀多節孢;誘變菌株;紫杉醇;同工酶;差異分析中圖分類(lèi)號:0814;Q55文獻標識碼:A文章編號1000311(2005)020 -0035-03The Preliminary Research on the Difference of Isozyme betweenNoclulisporium sylviforme and Its MutantXIE Yu- hong' ,ZHANG Peng2 ,FU Bo3' ,YU Miao' ,ZHANG Hai - ying ,ZHOU Dong- po'(1.College of Enviromental Science and Safety Fngineering, Tianjin University of Science & Technology ,Tanjin 300191;2. Depertment of Biology ,Xuzhou ormal University, Xuzhou 21116;3.College of Biongineering,Qiqihar University, Qiqihar 100161 ;4. Clle of Life Science, Heilongigng University, Harbin 150080, P. R. China)Abstract:To research the mechanism of taxol production in Noclulisporium syhiforme which productes taxol. This article studied four kinds ofisoymes and two kinds of protains abstracted from Noculisporiun sylniforme (HQD33) and its mutant strains(P50 - 2,P1-6,P5-8,L30-2,L50- 4) which is mutated from HQD33 , and analyzed the diference of the isozymes and proteins . The conclusion is the diference among theisozymesis very evident. It deduces that the mutation variatesthe genetic background of the strains that produces taxol , and that the variation of ge-netic background inducesthe variation of the isoxymes and proteins in strains. It can say that the producing of taxol relevances to the isozymes andproteins selected by us in this study.Key words: Noclulisporium syliforme ; mutant taxol; isozyme research; on the diference紫杉醇是二萜生物堿，具有廣譜抗癌活性,對乳腺癌和卵1.1 材料巢癌等多種癌癥都有特殊療效",是一- 種很有發(fā)展前景的抗1.1.1試驗材料癌藥物。1993 年作者課題組分離得到了產(chǎn)紫杉醇的菌株菌株HQD33:分離自黑龍江省穆棱縣的東北紅豆杉(T.HQD33,經(jīng)鑒定為樹(shù)狀多節孢[21 ,是一種新紀錄菌屬。同時(shí)在cuspidate) ,培養物保存在齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院該菌的基礎上通過(guò)原生質(zhì)體誘變和融合[10)選育出了幾株高產(chǎn)微生物實(shí)驗室(PDA斜面保存,4C)。菌株菌株P(guān)50- 2、P1- 6、P5 - 8:樹(shù)狀多節孢( Noduisporiun syuo-近年來(lái),很多研究者致力于微生物發(fā)酵紫杉醇的研究,但ifomma)HQD33 經(jīng)紫外線(xiàn)誘變后得到的誘變株。結果寥寥。究其原因是關(guān)于紫杉醇微生物發(fā)酵的產(chǎn)生機理沒(méi)菌株L30-2、L50- 4:樹(shù)狀多節孢(Noulisorium sytiforma)有得到充分的研究和探討。本文對紫杉醇產(chǎn)生菌HQD33和經(jīng)HQD33經(jīng)紫外線(xiàn)和氯化鋰復合誘變后得到的誘變株。誘變篩選的誘變高產(chǎn)菌株的同工酶和胞內蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較1.1.2 試劑分析,應用常規的研究技術(shù)對出發(fā)菌株和誘變高產(chǎn)菌株進(jìn)行0.5%的溴酚蘭,0. lmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0) ,0. 15molV生物分子水平和生化水平變化差異的比較研究,從而間接推L醋酸緩沖液。斷高產(chǎn)誘變菌株提高產(chǎn)量的機理,本試驗是對研究微生物發(fā)1.1.3培養基酵產(chǎn)生紫杉醇機理的一個(gè)嘗試,到目前為止,還沒(méi)有見(jiàn)到與本PDA液體培養基、PDA固體培養基、s7液體發(fā)酵培養試驗研究目的和意義相關(guān)的文獻報道,此類(lèi)初步研究也將為基0)1 :配制方法見(jiàn)參考文獻[3]。今后快速選育更高產(chǎn)的菌株的探索奠定理論基礎。1.1.4儀器1材料與方法中國煤化工北京六- -儀器廠(chǎng));電泳儀(三H市六一儀器廠(chǎng)); Beck-收稿日期:2004- 09- 15;修回日期:2005-01-12man超CNMHGg);H計?；痦椖?黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(93-C- 11);黑龍江省.2方法“九五”重大攻關(guān)項目(C98C20- 16- 1)1.2.1菌體的培養 :作者簡(jiǎn)介:解玉紅(1976- ),女,碩士,教授,從事微生物分子生物學(xué)和紫杉醇產(chǎn)生菌HQD33及其高產(chǎn)菌株P(guān)50-2、P1-6、P5 -環(huán)境生物技術(shù)研究，發(fā)表論文數篇;周東坡(1941-),男,教授，博士生8.I30- 2、I50-4在PDA固體斜面培養基上活化3d,后轉接到導師,國務(wù)院特貼專(zhuān)家,從事微生物育種等研究,發(fā)表論文80余篇。