發(fā)酵工藝放大的優(yōu)化

2003年第26卷第2期發(fā)酵工藝放大的優(yōu)化T46瘸要發(fā)醇工藝的優(yōu)化有多種目的,通過(guò)優(yōu)化以期增加成品的產(chǎn)量,但優(yōu)化過(guò)程必須蓬循藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規范GMP)原則、有效利用現有的設備并符合預期的最終生產(chǎn)規模。經(jīng)基因修飾超量產(chǎn)生重組蛋白的徽生物具有優(yōu)勢,絕大多數工藝僅采用三類(lèi)菌種,即大腸桿菌、釀酒酵母和巴氏畢赤酵母。本文概括了作者為保證生物制藥發(fā)酵工藝放大方法的有效性所設計的一些基本原關(guān)鍵詞優(yōu)化發(fā)酵工藝表達放大在項目可行性策略分析中包括發(fā)酵工藝組成型表達還是誘導型表達。表達產(chǎn)物是在的優(yōu)化,一旦證明所選菌種可用于生產(chǎn),優(yōu)化胞質(zhì)區室還是分泌到外周培養液中。如果菌工作即已開(kāi)始,表明已經(jīng)構建出了表達系統,株是從本實(shí)驗室外獲得的,必須對原始菌株至少從理論上應該將表達系統枧為已優(yōu)化系來(lái)源和克隆步驟的質(zhì)控文件進(jìn)行評估,并需統在進(jìn)行漫長(cháng)而又昂貴的優(yōu)化工作之前,建獲得具有資質(zhì)的質(zhì)量保證部門(mén)批準后才能使立穩定的菌株非常重要,至少需要保持從細用。胞庫建立到大規模發(fā)酵(包括預培養)所需代應優(yōu)化目的基因的密碼子使用以促進(jìn)其次的穩定。以質(zhì)粒為基礎的表達系統有時(shí)不在選定微生物中的表達。必須立即通過(guò)播瓶穩定,有幾個(gè)參數能夠影響質(zhì)粒的分離不穩培養進(jìn)行表達水平篩選,從而發(fā)現能夠高水定性。每種質(zhì)粒的穩定性各不相同,這取決于平表達重組蛋白的克隆宿主菌株,高度的不穩定性與低拷貝數質(zhì)粒培養條件的優(yōu)化有關(guān)。插入的DNA大小影響質(zhì)粒的穩定性:優(yōu)化的主要目的是盡可能地提高產(chǎn)量質(zhì)粒越大越不穩定。培養條件(如溫度、培養該過(guò)程可從實(shí)驗室規模的純化工藝開(kāi)始,采基組成和生長(cháng)速率等)也能改變質(zhì)粒的穩定用最少量的現有質(zhì)控工具來(lái)定量和評估產(chǎn)品性。對數生長(cháng)期后期質(zhì)粒丟失非常明顯,基因質(zhì)量。發(fā)酵程序彩響雜質(zhì)類(lèi)型,進(jìn)而嚴重影響表達期間質(zhì)粒的不穩定性增加,經(jīng)常應用抗下游加工(DSP的功效。同樣,發(fā)酵條件能夠生素來(lái)穩定質(zhì)粒。由質(zhì)粒編碼補償宿主的營(yíng)決定目的蛋白是以可溶性形式還是以不溶性養缺陷比用抗生素調節更為合適,然而營(yíng)養形式存在,這進(jìn)一步影響DSP和純化產(chǎn)品的缺陷型菌株培養基的制備非常繁瑣。插入質(zhì)量和產(chǎn)量。在高產(chǎn)菌株中,超量產(chǎn)生也能遺parB(hok/sok)基因座可以穩定質(zhì)粒,通過(guò)成某些因子耗竭,而這些因子對于維持蛋白質(zhì)粒的分離能殺死丟失質(zhì)粒的細胞。另一種質(zhì)的良好構象是必需的。因此,發(fā)酵條件的優(yōu)情況是將插入的DNA片段整合到宿主染色化必須與提純工藝的優(yōu)化同步進(jìn)行,因為它體中,常見(jiàn)的例子是巴氏畢赤酵母構建體,但們之間彼此相互彩響。發(fā)酵工藝和DSP開(kāi)發(fā)基因整合后會(huì )降低基因表達水平人員之間的交流質(zhì)量是工藝放大成功的關(guān)生產(chǎn)菌株和表達載體的選擇將取決于是鍵。參考文款3 Lusso P et al. Virology 2000, 273, 228-2401 Lusso p et a]. Vaccine,2002:20(15);1964-1967(2002-10-25收稿)2 Nardese V et al. Nat Struct Biol. 20011 81611-615中國煤化工CNMHG《國外醫學(xué)》預防診斷治療用生物制品分冊發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究可通過(guò)每次改變如可能應盡量避免使用動(dòng)物來(lái)源的原個(gè)因素、或同時(shí)改變幾個(gè)參數來(lái)進(jìn)行,并運用料,如必須使用,所用原料必須是在無(wú)傳染性統計學(xué)分析尋找它們之間的相互作用。按統海綿狀腦病(TSE)的國家生產(chǎn)的。計學(xué)要求設計實(shí)驗是一種有組織的方法這培養液pH的優(yōu)化是關(guān)鍵性因素,特別樣每次實(shí)驗獲得的可靠資料要多于無(wú)計劃研是對于酵母分泌蛋白,因為酵母可在很寬的究。統計資料分析可使不同實(shí)驗變量之間的pH范圍內生長(cháng)。PH的選擇取決于重組蛋白相互作用更為具體化,并可預測實(shí)驗未直接表達的穩定性,在低pH培養巴氏畢赤酵母涉及的其他方面的反應數據。對工藝開(kāi)發(fā)人可避免蛋白水解酶的降解作用,這種酵母在員來(lái)說(shuō),最重要的研究?jì)热葜皇谴_定能夠pH低至2.2時(shí)不能生長(cháng)影響產(chǎn)品產(chǎn)量或質(zhì)量的可變因素溫度對所表達蛋白的溶解性以及產(chǎn)量具發(fā)酵可以采用分批、補料-分批和連續培有重要作用,在甲醇誘導階段,溫度從30℃養三種方式進(jìn)行。連續培養在制藥工業(yè)領(lǐng)域降至25℃,將使克隆在巴氏畢赤酵母中的半不常用,因為采用這種方式發(fā)生突變和污染乳糖氧化酶的產(chǎn)量增加4倍的可能性較高,且每批的規模界限不清分批對于補料分批發(fā)酵過(guò)程,以指數形式補培養過(guò)程簡(jiǎn)單但費力;補料分批培養模式是料將使細胞以恒定生長(cháng)速率生長(cháng),這對重組唯一可達到高細胞密度的培養方法,它比較蛋白的表達十分有利。如果達到高生長(cháng)速率復雜,但可對菌株的代謝進(jìn)行控制。對于釀酒溶解氧經(jīng)常是一個(gè)限制性因素。對于甲醇營(yíng)酵母,高葡萄糖濃度能誘導 Crabtree效應:養型酵母,維持細胞在呼吸代謝階段避免培即使在不限制氧的情況下,酵母還是能進(jìn)入養液中甲醇的過(guò)度積累是關(guān)鍵,否則會(huì )引起發(fā)酵代謝階段。通過(guò)采用補料分批培養方式快速中毒?？諝馀c氧氣混合供給是有益的。加可以控制酵母代謝。在肉湯培養基中,限制補壓可提高培養液中溶解氧的濃度,但也相應料葡萄糖的濃度,可以使釀酒酵母在呼吸代增加了溶解的二氧化碳濃度,因此或許并不謝階段呈高密度生長(cháng),同時(shí)避免大腸桿菌產(chǎn)合適限制溶解氧有時(shí)對表達有益,克隆到大生乙酸鹽。常通過(guò)比較每天重組蛋白的產(chǎn)量腸桿菌中的酶在L阿拉伯糖可誘導載體中來(lái)選擇最經(jīng)濟的工藝過(guò)程的表達即為這種情況。當氧攝取速度最大而培養基既可以是完全確定成分培養基,溶解氧濃度為零時(shí),立即進(jìn)行重組蛋白表達也可以是含蛋白胨的綜合培養基。綜合培養的誘導是最合適的時(shí)機?；苽淙菀?、廉價(jià),并可使工程菌快速生長(cháng),影響發(fā)酵工藝放大的因素包括傳代次但分析困難,且每批間易產(chǎn)生差異對于微生數、突變的可能性、培養液的滅菌溫度和pH物的繁殖生長(cháng)及上清液中分泌性蛋白的純調節的質(zhì)量、振蕩通氣量和壓力。進(jìn)行工藝度,確定成分培養基優(yōu)于綜合培養基。兩種培放大的最好方法是首先將要達到的最終生產(chǎn)養基中碳源的選擇至關(guān)重要,對于大腸杄菌,規模的培養條件縮小至中試規模。當擴大規高濃度葡萄糖將造成乙酸鹽積累降低生物模后,培養液將變得越來(lái)越不均勻。對于大型量產(chǎn)量和表達水平。因此,對于大腸桿菌,選發(fā)酵罐,在反應器的某些局部區域內氧處于用甘油作為碳源比用葡萄糖好。甘油可抑制耗竭狀態(tài)。巴氏畢赤酵母乙醇氧化酶啟動(dòng)子,Mut菌株形成的工藝必須通過(guò)某些質(zhì)控部門(mén)的檢誘導期間最好避免使用甘油,對于Mu菌定和驗證以證明該工藝的穩定性、可靠性和株可用山梨醇代替甘油,并用混有甲醇的補可重復性所有的儀器設備必須按GMP要料-分批培養基替代求進(jìn)行驗證,包括安裝確認、在位清洗CIP):罐:遂中國煤化工CNMHG鋪》2003年第26卷第2期驗證、在位滅菌(SIP)驗證維護和校準方案特性的研究提示,對更多的特殊參數進(jìn)行試的驗證等,發(fā)酵工藝直到Ⅱ期臨床階段都可驗。例如,添加輔因子或底物能夠穩定酶進(jìn)以改進(jìn),但必須按最終生產(chǎn)規模進(jìn)行。而增加終產(chǎn)量。在這一研究領(lǐng)域,科學(xué)家的想異源蛋白生產(chǎn)的優(yōu)化始于設計良好的重象力和創(chuàng )造力可獲得超出最佳多因素實(shí)驗設組菌株的構建,發(fā)酵工藝的改進(jìn)策略涉及菌計所能達到的杰出成果株特性和重組蛋白性質(zhì)方面的知識。發(fā)酵工(張振龍編譯李津校)藝的完善要考慮來(lái)自DSP改進(jìn)、最終生產(chǎn)規參考文獻模和GMP要求的反饋信息。即使發(fā)酵工藝1 Thiry M et al. Trends Biotechnol,2002120(3):10已經(jīng)盡可能地趨于標準化,但仍有研究表明即便是微小的改進(jìn)也可能大大提高生產(chǎn)率。2 Enfors S et al. J Biotechnol, 2001: 85: 175-1853 Doig SD et al. Enzyme Microb Technol, 2001:282265-發(fā)酵工藝的最優(yōu)化應該采用兩個(gè)層次的方式進(jìn)行,首先以本文描述的和其他合理科學(xué)的(2002-09-09收穡優(yōu)化方法進(jìn)行,在第二種方式中對表達蛋白免疫佐劑作用機理研究進(jìn)展R31_ A中國藥品生物制品檢定所(100050)徐苗綜述王國治審校摘要人們對佐劑的期望不僅是提高抗體的量,還在于優(yōu)化抗體的質(zhì)及特異性誘導有效的細胞免疫應答。隨著(zhù)對佐劑作用機理研究的逐漸深入,人們提出了模式織別理論等新觀(guān)點(diǎn)。本文試對佐劑機理的研究作一概述關(guān)鑣詞佐劑作用機理模式識別理論髙度純化的新型疫苗雖具良好的抗原特因子,促使Th前體細胞向Thl或Th2不同異性和低毒性,但免疫原性低,需要配合高效的亞型分化。Th1細胞可分泌干擾素的佐劑使用。經(jīng)典的鋁佐劑在提高抗體水平(IFN-)、白細胞介素2(IL-2)、a腫瘤壞死因和安全方面已獲長(cháng)期的實(shí)踐證實(shí),但其本身子(TNF-a)等介導細胞免疫,輔助特異性的一些缺陷加上對其作用機理了解較少,使IgG2a類(lèi)抗體的產(chǎn)生;Th2細胞則分泌IL-4之很難滿(mǎn)足新型疫苗發(fā)展的需要。因此,5、10、13,輔助1亞類(lèi)和1gE的產(chǎn)生。對新佐劑的開(kāi)發(fā)及對其作用機理的深入研究1.2抗原提呈作用勢在必行。指佐劑保持抗原構象完整并提呈給適當1佐劑作用方式的初步探討免疫效應細胞的能力。佐劑可影響APC攝取研究佐劑作用方式,有助于人們利用佐抗原和分泌L-1、誘導Thl/Th2轉換、協(xié)助劑增強免疫應答、誘導機體選擇性地產(chǎn)生特B細胞記憶和抗體親和力成熟等異性免疫應答和減少副反應。佐劑作用方式1.3誘導CD8+細胞毒性T細胞(CTL)應可概括為以下五種:答1.1免疫調節作用通過(guò)與細胞膜融合或保護抗原肽,佐劑調節細胞因子網(wǎng)絡(luò )的能力。不同的佐可促進(jìn)相應肽摻入MHCI類(lèi)分子并維持二劑誘導抗原提呈細胞(APC)分泌不同的細胞者結合同時(shí)期望通過(guò)誘導IFNy和TNFait. F. 43sci-,'tmyH中國煤化工翔CNMHG