末端連接ω-氨基酸的聚乙二醇修飾劑的制備

Vol. 33 No.2華東理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)1812007-04Journal of East China University of Science and Technology (Natural Science Edition)文章編號:1006- 3080(2007)02-0181-05末端連接o-氨基酸的聚乙二醇修飾劑的制備熊玉春'，劉清海'， 何明磊”， 魏東芝'(1.華東理工大學(xué)生物反應器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗室,魯華生物技術(shù)研究所,上海200237;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連116600)摘要:提出了一種新型聚乙二醇(PEG)修飾劑的合成方法。首先以?xún)煞Nw氨基酸和單甲氧基PEG為主要原料,經(jīng)連接、純化和水解等步驟,得到末端以酰胺鍵連接wr氨基酸的PEG酸,再將得到的PEG酸用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)進(jìn)行活化,得到聚乙二醇β丙氨酸-N~羥基琥珀酰亞胺酯(PEG- BPA-NHS)和聚乙二醇r氨基丁酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(PEG-GABA-NHS),總收率為60%。這類(lèi)新的修飾劑經(jīng)驗證具有較長(cháng)的水解半衰期(分別為7.6 min和16. 7 min)和良好的蛋白修飾能力。關(guān)鍵詞:聚乙二醇;w氨基酸;聚乙二醇修飾;活化;制備中圄分類(lèi)號:0633. 11文獻標識碼:APreparation of Two New PEG Reagents with o-Amino Acid TailXIONG Yu-chun'，LIU Qing-hai'，HE Ming-lei'，WEI Dong-zhil(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering , New World Institute of Biotechnology,East China University of Science and Technology , Shanghai 200237, China;2. College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, Liaoning, China)Abstract: A synthesis method of a new type PEG reagent was proposed, in which firstly new polyeth-ylene glycd (PEG) acids with wramino acid tail were prepared, from two wramino acids and mPEG by stepsof acylation, purification and hydrolyzation, subsequently the PEG acids were activated by NHS, which ledto the production of PEG BPA-NHS and PEG-GABA-NHS respectively (total yield 60%). The productswere proved to have a favorable half-life (7. 6 min and 16. 7 min respectively) and PEGylation activities,and belong to the second-generation of PEG derivatives family.Key words: polyethylene glycd; w- amino acid; PEGylation; activation; preparation聚乙二醇(PEG)廣泛應用于生物醫藥修飾領(lǐng).作為藥物緩釋介質(zhì)的能力。域。PEG修飾的酶分子可溶于有機溶劑,均相中更PEG是- -種兩端以羥基為末端的線(xiàn)型聚合物。有利于有機相酶反應的進(jìn)行;PEG修飾的蛋白質(zhì)可由于兩端均具有可反應的活性基團，易導致被修飾減少蛋白的免疫原性、降低腎臟排除速率,并可促使分子之間的交聯(lián)。除了一些有特殊需要的場(chǎng)合之結合物在血液循環(huán)中的半衰期增加;PEG結合到脂外,更多用于多肽和蛋白，質(zhì)修飾的是單甲氧基聚乙質(zhì)體_上可以使其半衰期有極大增加,并能夠增加其二醇(mPEG) .中國煤化工收稿日期:2006-05-22TMYHCNMHG基金項目:國家863重大專(zhuān)項基金資助(2002AA2Z3451);上海市重點(diǎn)學(xué)科資助項日作者簡(jiǎn)介:熊玉春(1977-),男,何南南陽(yáng)人,博士,現從事創(chuàng )新藥物的開(kāi)發(fā)研究。通訊聯(lián)系人:魏東芝, E-mailidzhwei@ecust. edu. cn182華東理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) .第33卷PEG的末端羥基不能直接與蛋白分子發(fā)生反1實(shí)驗部分應,需經(jīng)活化才能夠與相應的氨基酸殘基基團發(fā)生反應。目前應用最廣,技術(shù)最成熟的修飾方法是對1.1實(shí)驗材料和儀器蛋白分子中氨基的化學(xué)法?；揎?。mPEG5000購自Fluka公司;N-羥基琥珀酰亞修飾劑的反應活性影響其修飾效果。高反應活胺(NHS)購自Sigma公司;丙氨酸、二環(huán)已基碳二性的修飾劑與目標蛋白的反應速度快,修飾劑本身亞胺(DCC) ,分析純,購自國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公對目標蛋白上不同位置的氨基位點(diǎn)缺乏選擇性,從司;r氨基丁酸,分析純,購自上海試劑三廠(chǎng);叔丁醇而導致蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)也被無(wú)差別地修飾而失鉀購自Acros 公司;溴乙酸乙酯,分析純,購自上?；?而反應活性較低的修飾劑則可以在保證修飾反天蓮精細化工有限公司,rhIFNa2b由上海華新生應正常進(jìn)行的前提下,具有較低的修飾速度,從而有物技術(shù)公司提供; QAE Sephadex A50購自Amer-利于獲得較高的修飾選擇性。sham;甲苯、二氯甲烷等均為市售分析純試劑.現有的一些PEG羧基NHS活化酯的水解半1.2實(shí)驗方法衰期一般為20min左右,不同結構的羧基活化酯由1.2.1 末端以酰胺鍵連接w氨基酸的PEG酸的于其PEG主鏈末端的非醚碳鏈不同而有活性上的制備(1)羧甲基化聚乙二醇(CM-PEG)的制備:差異。羧甲基化PEG-N-羥基琥珀酰亞胺酯(SCM-將10 g(2 mmol)mPEG5000溶于300 mL甲苯中，PEG , PEG-CH2COONHS)和N-羥基琥珀酰亞胺蒸餾出約70mL溶劑以共沸除水,然后加入0.34g酯基碳酰PEG酯(SC-PEG,PEG-OCOONHS)制備(3 mmol)叔丁醇鉀回流反應1.5 h,緩慢加人335較為簡(jiǎn)單,前者可以先用mPEG-OH通過(guò)William-μL(3 mmol)溴乙酸乙酯回流反應3 h,室溫下反應son法制得CM-PEG,再用NHS進(jìn)行活化而得10h,過(guò)濾除去沉淀,減壓蒸去溶劑，殘留物加少量到”,由于其反應活性太強,在典型條件下的水解半二氯甲烷溶解,用干燥乙醚沉淀,將沉淀物溶于去離衰期只有0.75 min,故此貯存和使用都不方便;后子水中,加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH者則是用mPEG-OH直接用三光氣活化得到[2 ,雖為10,然后用w=0.01的草酸溶液調節溶液的pH然合成簡(jiǎn)便，而且反應活性也較為適中,但其在對蛋為3,將此溶液用等體積的氯仿萃取3次,合并有機白進(jìn)行修飾后,修飾產(chǎn)物中仍有一個(gè)酯鍵存在,會(huì )使相后,無(wú)水硫酸鈉干燥,濃縮后用乙醚沉淀得到9. 6PEG鏈因水解而脫落。由于存在這些缺點(diǎn),研究者g白色粉末(得率96%),即為CM-PEG,分子式為將這兩種修飾劑以及有同樣缺點(diǎn)的其他一些修飾劑CH,O- (CH2CH2O),- CH2COOH。定義為第1代修飾劑。而將符合水解半衰期較長(cháng)，(2) w氨基酸乙酯鹽酸鹽的制備:將0.2 mol β結構中不含酯鍵結構等特點(diǎn)的修飾劑定義為第2代丙氨酸(17.8g)或r氨基丁酸(20.6 g)加人到300修飾劑”。目前第2代修飾劑正在成為研究和應用mL無(wú)水乙醇中,在攪拌下通入干燥的氯化氫氣體的重點(diǎn)。直到飽和，繼續攪拌2 h后加入無(wú)水乙醇,減壓蒸第2代修飾劑的代表丙酸PEG-N-羥基琥珀酰餾,除掉多余的氯化氬,將溶液濃縮至約70mL,用亞胺酯(SPA-PEG, PEG-O-(CH2 )2COONHS)系列無(wú)水乙醚沉淀得到粉末29.2 g(F-丙氨酸乙酯鹽酸修飾劑雖然半衰期較長(cháng),但是它們的合成都要首先鹽 ,得率95%)或31.4 g(r氨基J酸乙酯鹽酸鹽，由mPEG-OH通過(guò)烷基化反應得到相應的羧酸,這得率94%)。-過(guò)程中要利用強堿和強酸在水相中進(jìn)行[4,容易(3)末端連接w氨基酸乙酯的PEG的制備:取導致PEG主鏈的斷裂。因此,開(kāi)發(fā)- -種新型的、合6 g(1. 2 mmol)CM-PEG溶于20 mL干燥的三氯甲成條件溫和的、半衰期較長(cháng)的羧基型第2代PEG修烷中,然后依次加人0. 41 g(2 mmol)DCC,0. 31 g(2飾劑十分必要。mmol)f丙氨酸乙酯鹽酸鹽,或0. 33 g(2 mmol)r本研究提出以w氨基酸為原料對羧甲基化氨基丁酸乙酯鹽酸鹽,然后向反應體系內加入280PEG進(jìn)行活化的思路,合成了兩種新型羧基PEGμL(2 mmol)三乙胺,密閉攪拌反應12 h,過(guò)濾除去修飾劑,其PEG末端帶有一定長(cháng)度的非醚碳鏈,且沉中國煤化工得到白色粉末5.7分子中不含額外的酯鍵結構,有利于修飾后仍能保g(wr氦基酸乙酯的持修飾劑與蛋白之間良好的穩定結合，這些都符合PEGfYHCNMHG第2代修飾劑的要求。(4)末端連接wr氨基酸乙酯的PEG的純化:將QAE Sephadex A50 (Amersham Biosciences, Swe-第2期熊玉春，等:末端連接r氨基酸的聚乙二醇修飾劑的制備183den)溶脹后裝人4 cmX60 cm的層析柱(上海華美其終態(tài)吸光值(Ao)為原料全部水解后產(chǎn)生的生物工程公司)中,用10 mmol/L,pH 8. 9的硼酸緩吸光值,所以沖液充分平衡后,將.上步中所得的反應混合物1.0gAo=k'co+b用2 mL平衡緩沖液溶解,上樣后用0.5 mL/min的根據一級反應動(dòng)力學(xué)方程速度洗脫,用碘顯色反應指示PEG,直到有PEG流dc1/dt= kc1出即開(kāi)始接收,待流出液中無(wú)PEG時(shí),合并接收的結合上述的濃度以及吸光值的關(guān)系式可將動(dòng)力溶液。將此溶液用等體積的氯仿萃取3次,合并萃學(xué)方程變換為.取液,并用無(wú)水硫酸鈉干燥后,經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮,過(guò)ln(1- A/Ao) =-kt +ln(1- b/Ao)量的無(wú)水乙醚沉淀,得到白色粉末0. 82 g(得率令a=ln(1- b/Ao),則得82%) ,為純化后的末端連接r氨基酸乙酯的PEGln(1- A/Ao) =-kt +a (a 為常數)未反應完全的CM-PEG可經(jīng)由500mmol/LNaCl本實(shí)驗利用紫外分光光度計跟蹤檢測所制備的溶液洗脫。PEG活性酯在260 nm下生成NHS的情況。稱(chēng)取(5)末端以酰胺鍵連接r氨基酸的PEG酸的約10mg的PEG-NHS酯溶于3.0mL的pH8的獲得:將5.0g上一步所得的分離產(chǎn)物干燥后溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液中,對此溶液在260 nm下的去離子水中,加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液調pH吸光值A進(jìn)行跟蹤記錄,并測得終態(tài)吸光值Ao,用至11,攪拌反應2 h,然后用草酸將溶液調節到pHln(1- A/Ao)對時(shí)間t作圖,所擬合直線(xiàn)斜率就是水3,用氯仿萃取3次,合并有機相并用無(wú)水硫酸鈉干解反應的一級速率常數的相反數( -k).燥,溶液濃縮后再用無(wú)水乙醚沉淀得到mPEG-根據~級反應的半衰期計算公式CH2CONH-(CH2),COOH(n=2或3),即以酰胺t/z = (ln2)/k鍵與PEG連接的PEG-f丙氨酸(PEG-BPA)(4.7計算得到PEG活性酯在實(shí)驗條件下的水解半g,得率94%)和PEG-r-氨基丁酸(PEG-GABA)衰期。(4.7 g,得率94%)。1.2.4 PEG-酰~a氨基酸的 NHS酯與蛋白質(zhì)的連1.2.2末端連接 w氨基酸的聚乙二醇活性酯的制接用pH 5. 0的磷酸緩沖液(100 mmol/L)將干擾備取上述制備的PEG-BPA(或PEG-GABA) 5 g素INF-a-2b配制成1 mg/mL 的溶液，按照干擾素(1 mmol),溶于干燥精制的無(wú)水二氯甲烷中,依次與活化酯的質(zhì)量比為1 : 3的量加入活化酯進(jìn)行修加入0. 25 g(1. 2 mmol)的DCC、0. 14 g(1. 2 mmol)飾,于室溫下振蕩反應2 h,用2 mol/L的甘氨酸終的NHS,室溫密閉攪拌反應24h,停止反應過(guò)濾掉止反應,SDS-PAGE分析結果。沉淀,溶液用無(wú)水乙醚沉淀得到白色粉末4.4 g(得率88%),為PEG-酰wr氨基酸的NHS酯。分子式2結果與討論如下:mPEG- CH2CONH-(CH2),COONHS(n=2或3)。2.1 PEG-酰-∞o氨基酸 的合成與活化1.2.3 PEG 活性酯的水解速率羧基型 PEG活以?xún)煞Nwr氨基酸為原料合成了兩種新型的第2性酯在一定條件下的水解速率可以表征該活性酯的代PEG活化酯類(lèi)修飾劑。其分子中不含額外的酯修飾反應PEG-COO- -NHS + OH- →鍵結構,保證了修飾后仍能保持修飾劑與蛋白之間PEG- -CO0O~ + HO- -NHS活性,其水解符合一級.良好的結合,避免了第1代修飾劑SC-PEG修飾后反應動(dòng)力學(xué)模型。此類(lèi)活性酯水解后釋放出NHS易水解的缺陷。分子,在pH8的條件下于260nm有強的紫外吸以β-丙氨酸為原料,經(jīng)連接、純化、水解之后得收5]。到產(chǎn)物PEG-BPA,其' H-NMR (DMSO)8X 10°:記PEG- -CO0O- NHS 的濃度為c,初始濃度2.43(t, 4H,- -CH2-CO- -);3. 21 (s,- -OCH),為co,水解過(guò)程中HO- -NHS的濃度為c2,則3. 50(s,- OCH2CH2O- -),7. 18(t, 1H, CONH)。co=c+c;IR/cm=1. 1 629CONH).1 740(COOH)。在線(xiàn)性范圍內,可以用吸光值A的大小表示生中國煤化工步驟所得的產(chǎn)物成的HO- -NHS的濃度,即PEG-YHCN M H G(CONH),1 740A=k'cz+b(COOH).其中b為空白吸光值,k'為常數。光譜分析表明，中間產(chǎn)物PEG-BPA和PEG-華東理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第3卷GABA分子中均含有酰胺鍵結構,表明已將wr氨基素rhIFNa-2b進(jìn)行了修飾,得到的修飾產(chǎn)物電泳結酸部分成功地接人到PEG鏈上。此兩者分別用果如圖2所示。從圖可以看出,新合成的修飾劑能NHS進(jìn)行活化后,即得到了可直接用于蛋白質(zhì)修飾夠較好地對蛋白進(jìn)行修飾,修飾后產(chǎn)物的蛋白電泳的新型PEG活性酯。中多了若干條高分子量的條帶,這些條帶按相對分2.2PEG活性酯的水解速率子量由低到高依次為干擾素rhIFNa-2b的單修飾兩種PEG活化酯的半衰期測定結果如圖1和條帶和多修飾條帶。圖中箭頭所示為原料的單修飾圖2所示。條帶(M,=2.9X10*).一般來(lái)說(shuō),PEG的單修飾產(chǎn)物可以較好地保留目標蛋白的原始生物活性,是-0.8rA-NHSPEG修飾產(chǎn)物中值得分離的部分。對照同類(lèi)文獻(@) P0.095-0.42 2-1.2R2=0.099 98中采用商業(yè)化PEG活性酯對干擾素rhIFN ar2b修飾,在優(yōu)化修飾條件后,修飾產(chǎn)物中單修飾帶為約33%1],而圖中的單修飾條帶經(jīng)純度掃描含量均達-2.00 12到30%以上,證明所合成的新型修飾劑具有良好的1/min修飾效果。-1.0r(b) PEG-GABA-NHSMx10-4y=0.041 6x-1.22719.74-2.0-R2-=0.099 99: 6.624.30旨-3.0F3.10-4.0525465t /min: 2.01圖1 PEG BPA、PEG-GABA的NHS酯的水解i 1.44Fig.1 Hydrolysis of NHS ester of PEG-BPA and PEG-GABA圖2w氨基酸衍生化的PEG對干擾素的修飾結果由圖可知,兩種PEG酸活性酯的水解動(dòng)力學(xué)常Fig.2 Results of IFN-ar2b modified by PEG derived from數k(動(dòng)力學(xué)方程為前述的ln(1-A/A。)=-kt+a)oramino acid分別為0.0915和0.0416,根據一級反應動(dòng)力學(xué)中1- -IFN-a-2b modified by PEG-BPA-NHS, 2-IFN-a-2b modified by計算半衰期公式可相應得出兩種PEG酸的NHSPEG-GABA-NHS; 3- - :IFN~a-2b; M -Marker活化酯在實(shí)驗條件下的水解半衰期分別為7.6min( PEG-BPA-NHS)和16. 7 min ( PEG-GABA-3結論NHS)。對比國外試劑手冊(ShearwaterCorpora-本文以?xún)煞Nwr氨基酸和單甲氧基PEG為主要tion Catalog, 2003; Shearwater Corporation Cata-log,2004)中的數據可知,所制備的PEG-GABA-原料,經(jīng)連接、純化和水解等步驟,將w氨基酸通過(guò)NHS的反應活性與國外文獻報道的第2代修飾劑酰胺鍵連接到CM-PEG的末端,中間產(chǎn)物經(jīng)活化SPA-PEG相近(16.5 min)。一般來(lái)說(shuō),PEG活性后,得到了新的具有較長(cháng)水解半衰期的第2代PEG酯的反應活性受PEG末端的非醚碳鏈的長(cháng)度影修飾劑PEG- BPA-NHS和PEG GABA-NHS(合成響0],非醚碳鏈變長(cháng)會(huì )使其相應酯的反應活性降低，反應總得率為60%)。兩種新的修飾劑在pH 8. 0這從鏈長(cháng)較短的PEG-BPA-NHS的水解半衰期比的條件下水解半衰期分別為7.6 min和16. 7 min.PEG-GABA-NHS短可以看出;含有更長(cháng)碳鏈的氨與國外第2代修飾劑中SPA-PEG系列的合成方法基酸為原料,其水解半衰期會(huì )更長(cháng)，從而與SPA-相比中國煤化工免了使用強酸強PEG系列中的其他修飾劑具有可比性。堿,YHCNMHG合成所得的新型修飾劑對干擾素rhIFN a-2b2.3修飾活性檢驗用PEG酰-ar氨基酸的活性酯對目標蛋白干擾的修飾實(shí)驗證實(shí),其修飾效果與文獻中商業(yè)化的第2期熊玉春,等:末端連接r氨基酸的聚乙二醇修飾劑的制備185PEG修飾劑相當,可用于對蛋白質(zhì)或酶的修飾。同tide and protein PEGylation [J]. 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