胸腺五肽及其聚乙二醇衍生物的固相合成

承德醫學(xué)院學(xué)報JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL COLLEGEVol.28 No.4 2011基礎醫學(xué)胸腺五肽及其聚乙二醇衍生物的固相合成韓月,王良友,尹志峰,高 楊,趙紅玲,呂逄春.(承德醫學(xué)院中藥研究所,河北承德067000)[摘要]目的Fomc法固相優(yōu)化合成胸腺五肽(TP5)并對其進(jìn)行聚乙二醇(PEG)修飾,以延長(cháng)TP5在體內的半衰期。方法:采用固相合成技術(shù)合成PEG化TP5,高效液相色譜進(jìn)行分析和純化,氨基酸測序儀測序。結果:經(jīng)鑒定,合成的TP5和PEG化TP5與理論值--致。結論:該方法操作簡(jiǎn)單、成本低,得到的產(chǎn)品純度較高、易于純化。[關(guān)鍵詞]胸腺五肽;聚乙二醇化;固相合成[中圖分類(lèi)號]Q78[文獻標識碼]A[文章編號]1004- -6879<2011)04- 0351-03SOLID PHASE SYNTHESIS OFTHYMOPENTIN PENTAPEPTIDE AND PEGYLATEDTHYMOPETIDUMHAN Yue, WANG Liang you, YIN Zhi-feng, etal(Institute of Chinese Mateia Medica, Chengde Meidical College, Hebei Chengde 067000, China)[ABSTRACT] Objetive: Io optimize the solid phase synthesis method of thymopentin pentapeptide (TP5) andsynthesize pegylated TPS, so lengthen the half life period ofTP5.Methods:Solid phase synthesis was used to synthesizeTP5, high performance liquid chromatography to analyze and purify, protein sequencer to detect the sequence of aminoacid.Results:The TP5 and pegylation TPS was in conformity with theoretical value.Conclusions: This craft is convenientand low cost, the purity of products is fairly high and the product is easy to be purified.[KEY WORDS] Thymopentin pentapeptide; Pegylation; Solid phase synthesis胸腺五肽(thymopoentin pentapeptide,TPS) 的氨基時(shí)以原型分子自腎臟排出,高于30000Da自糞便排泄。為酸序列為H-Ang -L.ys -Asp-Val-Tyr OH,是- -種免疫避免在修飾過(guò)程中發(fā)生交聯(lián)和團聚,通常采用甲氧基聚調節劑,具有促進(jìn)胸腺細胞和外周T細胞、B細胞的分化乙二醇(mPEG)作為修飾劑的合成原料,其化學(xué)通式為和發(fā)育,調節機體免疫功能等生物活性"。臨床上TP5主CHzO(CH2CH2O)nCH2CH20H。多肽和蛋白質(zhì)經(jīng)PEG要用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷癥及各種惡性腫瘤前期修飾后不僅能較好地保留生物活性,還可增加穩定性、延及化疔、放疔的輔助用藥,也是最有療效的治療慢性乙型長(cháng)體內半衰期。本研究在合成IP5的基礎上對其進(jìn)行PEG肝炎和艾滋病的胸腺激素之一.TP5 構效關(guān)系的研究表結構修飾,在TP5的N端或C端引入半胱氨酸,偶聯(lián)馬來(lái)明,Ang和Asp對保持TP5的生物活性極為重要。TPS的酰胺基聚乙二醇,修飾后的產(chǎn)物具備生物活性,可用于4-5位.1-2位及2- -3 位肽鍵是對酶敏感的部位,被酶解制備各種免疫疾病藥物'。后可導致TP5活性降低或喪失.TP5注射于人體后很快1材料與方法由蛋白酶和氨肽酶降解為氨基酸,藥物原型的半衰期僅1.1 主要儀器高效液相色譜儀,美國Alltech公司;分為30s,TP5穩定性差的弱點(diǎn)嚴重妨礙了它的藥效,使在析柱Accurasil C18反相硅膠柱(4.6X250mm) ,大連依利臨床用藥時(shí)不得不增加劑量,導致治療成本增加”。特分析儀器有限公司;制備柱Accurasil CIg 反相硅膠柱聚乙二醇(polyethylene glyol,PEG) 是具有不同相(19X250mm) ,大連依利特分析儀器有限公司,CHRIST對分子質(zhì)量.重復乙二醇單元的直鏈或支鏈聚合物,無(wú)冷干機,北京博勵行儀器有限公司;高速大容量離心機,免疫原性,水溶性強,巳被FDA批準用作藥物修飾劑。上海安亭科學(xué)度計,上海光譜儀中國煤化工PEG分子量大于1000Da時(shí)無(wú)毒性,分子量低于30000Da器有限公司。YHCNMH G●351●承德醫學(xué)院學(xué)報JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL COLLEGEVol. 28 No.4 20111.2主要試劑Wang Resin,天津南開(kāi)合成科技有限公mg)。取平均值測得Fmoc-Ty(Bu)- Wang Resin的替代度司,替代度為1.17mmol/g;各種氨基酸:Fmoc-Ty(tBu)為0.8mmol/g.OH、Fmoc-ValOH,Fmoc-Asp(OtBu)OH.Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.3 TP5 的制備稱(chēng)取1gFnmo-TytBu) WangResin(0.8mmoD)Fmoc-Cys(Tt)-OH,蘇州中科天馬肽工程中心有限公司;加入多肽反應柱中,然后加入10ml 20%哌啶/DMF(V/V)縮合試劑:二異丙基碳二亞胺(DIC)苯并三氮唑-N,N,溶液,15min脫除Fmoc保護基,加入l0ml DMF洗兩次,然N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU).1-羥基苯并三氮后再加入10ml 20%哌啶/DMF(V/V)溶液再次反應15min唑(HOBT).催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP),蘇州中科全部脫除Fmoc保護基,反應結束后，分別加入10mlDMF、天馬肽工程中心有限公司;裂解試劑:三氟乙酸(IFA)、DCM洗滌樹(shù)脂三次,然后對Fmoc-Val-0H進(jìn)行偶聯(lián)。稱(chēng)量苯甲醚(anisole).苯甲硫醚(thioanisole).乙二硫醇(EDT),0.814g Fmoc-VaL_OH(24mmo).036mlDIC(2.4mmol)和0.406g均為分析純阿拉丁試劑;TP5標準品,蘇州中科天馬肽工HOBt(2 4mmol),用適量的DMF溶解,然后加入到樹(shù)脂中,程中心有限公司;單甲氧基聚乙二醇修飾劑(mPEG5000-反應時(shí)采用茚三酮顯色法定性檢測反應進(jìn)程,反應完全MAL),北京凱正生物有限公司;乙醚和二氯甲烷均為分后,抽濾掉反應液。然后按照IPS的氨基酸順序從N端到析純。C端循環(huán)偶聯(lián)Fmoc-Asp(OBu)-OH.Fmoc-ys(Bc)OH.Fmo>2方法與結果Arypb)OH用茚三酮顯色法定性檢測反應進(jìn)程,2h反應完2.1 氨基酸樹(shù)脂Fmo~Ty(tBu)- WangResin的制備把全,抽干溶劑,20%哌啶/DMF(V/N)溶液脫Fmoc半小時(shí)，0.851g Wang Resin(lmmo)投入到多肽反應柱中, 10ml DMF分別用DMF洗滌樹(shù)脂四次、二氯甲烷洗滌三次,再用甲醇洗滌--次，抽干;10mlDMF常溫溶漲,溶劑的體積控制洗滌三次,每次5min(以收縮樹(shù)脂),得HAg(Pb)-LysBoc)Asp在5-10ml/g樹(shù)脂,N2吹拂攪拌30min至樹(shù)脂充分泡漲，(OBu)Val-Ty(Bu)Wang Resin。最后，用N2吹干溶劑,真空抽干液體;5mlDMF洗滌一次,抽千,10mlDMF洗滌干燥至恒重,得1.40g。一次,抽干。將1.378g Frmoc-Tyr(tBu)OH (4mmo).0.508g稱(chēng)取H-Arg(Pb)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Vl-Tyr(tBu)-HOBt(4mmo).0.6ml DIC(4mmol)溶解在5ml DMF中,加Wang Resin 0.7g置于50ml燒瓶中,然后加入10ml裂解液到反應柱中,反應5min后,加入DMAP,反應3h。反應結(TFA:EDT:苯甲硫醚:苯甲醚= =90:3:5:2)磁力攪拌2h,束后,抽干反應液,用10ml DMF洗滌三次抽千,隨后將濾出液體,緩慢滴加至裝有乙醚的血清瓶中,待其自然樹(shù)脂轉移到錐形瓶中,加入12ml封閉試劑(AC20/吡啶沉降,30min后撇除上清液,帶有乙醚的TP5粗肽濕品進(jìn)(5:1)) ,磁力攪拌反應過(guò)夜;10ml DMF洗滌兩次,5ml無(wú).行離心處理,棄去上清液,用乙醚研洗粗肽,再次離心，水甲醇洗兩次(10min/次) ,真空減壓千燥至恒重。取少以此循環(huán)上述兩步操作四次。置空氣中靜置l5min后轉許樹(shù)脂進(jìn)行替代度檢測。移至真空干燥器中,進(jìn)行減壓干燥,將粗肽常溫真空干2.2 Fmoc-Tyr(tBu) Wang Resin替代度的測定精 密燥過(guò)夜到恒重得0.28g。稱(chēng)取2份8mg干燥至恒重的Fmoc -Ty(tBu)-Wang Resin,2.4 Cys-TP5 的制備把HAg(b)-LysBoc)Asp(OBu)-分別置于lml離心管中,向離心管中各加入Iml 20%哌Val- TytBu) Wang Resin再次投到反應柱中，用10mlDMF溶啶/DMF(V/V)溶液,室溫振蕩20min,脫卻Fmoc保護脹30min后,脫Fmoc 30min, 加入FmocCys(TIt)-OH.HOBT基。各取離心管中溶液200μl置于10ml比色管中，分和DIC。反應2h后,茚三酮法檢測，反應完全。脫除Fmoc,別用10ml DMF稀釋.搖勻,待測。將200ul 20%哌啶/將樹(shù)脂洗滌收縮.干燥,裂解液(TFA:EDT:苯甲硫醚:苯DMF(V/V)溶液用10mlDMF稀釋.搖勻,作為空白對甲醚= =90:3:5:2)裂解,乙醚析出沉淀,干燥至恒重。照液。于波長(cháng)301nm處,用紫外分光光度計測定各溶液2.5 TP5 和Cys-IP5的分析和純化粗品IP5和Cys-TP5的吸收值(A),并按照公式計算替代度:Sub=[AX5lV進(jìn)行RP-HPLC分析,并與TP5標準品對照，檢測波長(cháng)為[ε xm*。式中,Sub為替代度,定義為每g樹(shù)脂中連接215nm,梯度洗脫A :0.05% TFAH2O、B:0.05% TFA70%的氨基酸的毫摩爾數;A為測得的吸光度值;51為稀釋CHzCNHO,流速為lml/min.TP5保留時(shí)間為19.932min,倍數;ε為Fmoc結構在301nm處的特征吸收值,數值Cys- -TP5保留葉間為21 27min吧HPLC分析純度大為7.8L●(mmolxcm)";m為稱(chēng)取的樹(shù)脂質(zhì)量(單位為于95%。氨基中國煤化I後順序符合。相同TYHCNMH G●352●.承._德醫學(xué)院學(xué)報JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL COLLEGEVol.28 No.4 2011梯度條件下,半制備型RP -HPLC純化,冷凍干燥,得TP5進(jìn)行保護,在EPH=7-8的溶液中可以完成對TP5的修飾。和Cys-TP5白色粉末。RP-HPLC可以隨時(shí)監測反應進(jìn)程,制備液相純化簡(jiǎn)單高2.6 Cys(mE0o-MAL)-TP5的合成將4mgCys-TP5效。因為mPEG-MAL無(wú)紫外吸收,TP5被mPEG-MAL修飾溶于1ml水中,用NaHCO,溶液調pH=7- -8,加入50mg(3后,紫外吸收值明顯降低。倍當量)的mPECo-MAL,室溫反應,RP-HPLC監測反固相合成避免了液相合成過(guò)程中多步驟純化,操作應進(jìn)程Cys(mEG0o-MAL)-TP5保留時(shí)間為27.93min。簡(jiǎn)單的同時(shí)減少了產(chǎn)物損失,合成產(chǎn)物產(chǎn)率高。本研究3討論采取Fomc固相合成Cys-TP5,弱堿性溶液中mPEG003.1氦基酸樹(shù)脂 的制備和樹(shù)脂替代度的測定多肽固相MAL和Cys-TP5結合,實(shí)現了TP5的PEG化修飾，雖然合成的第一一步通常是將第-一個(gè)氨基酸的羧基通過(guò)酯鍵或產(chǎn)率不高,但可延長(cháng)TP5的體內半衰期,仍然不失為一酰胺鍵連接到樹(shù)脂_上,這一步連接效率的高低不但直接種可行的方法。影響以后合成出目標多肽的得率,而且對下一個(gè)氨基酸[參考文獻]的用量具有重要的指導作用。因此,本合成選擇的樹(shù)脂[1] Liang Yong-tao, Mi Hao-yu, Wang Ming zhe, et al Solid-phase是Wang Resin, 該樹(shù)脂結構較小替代度較高。TP5僅有synthesis of thymopentin derivative and is immune regulatoryactiviyJ.Chem Res Chinese Univasities 2009, 25(2):189-192.五個(gè)氨基酸,不易形成蛋白質(zhì)的螺旋或折疊結構,用高替[2] Onoue s, Liu B, Nemoto Y, et al. Chemical synthesis and代度的樹(shù)脂可以提高原料的利用效率,降低合成成本。本application of C-terminally 5-carboxyfluorescein- labelled研究中使用的Wang Resin原替代度為1.17mmol/g,接第thymopentin as a ftuorescont probe for thymopoictin recepor小Anal Sci, 20060 22(12): 1531- 1535.一個(gè)氨基酸Fmoc-Ty(Bu)-OH時(shí),增加投料,延長(cháng)反應時(shí)[3] 陳艷麗. 多肽片段連接.衍生物及偶合物的化學(xué)合成研究間,加入一種新型的?；呋瘎〥MAP,得到合適替代度[D].山東大學(xué),2009.的樹(shù)脂。本研究制得Fmoc-Ty(Bu) Wang Resin的替代度為[4] 姜忠義,許松偉， 王艷強.蛋白質(zhì)和肽類(lèi)分子的聚乙二醇化化學(xué)[].有機化學(xué),2003,23(12):1340-1347.0.8mmol/g,偶聯(lián)四個(gè)氨基酸時(shí)投料比控制在1:3,最后合[5] 潘和平,王良友,邵寧生,等.胸腺五肽的聚乙二醇化成的產(chǎn)物較純,且充分利用原料,使得合成成本降低,適宜術(shù)生物，含有它們的藥物組合物及用途[P].中國專(zhuān)工業(yè)化生產(chǎn)TP5。利:200310117356,2005- 06-15.3.2 PEG 對TP5的修飾- 般的PBG 修飾物對多肽的游[6] 石衛華, 田素梅,項光亞,等.西曲瑞克固相合成J].中國藥物化學(xué)雜志,2010,20(1):40- 43.離氨基沒(méi)有選擇性,當有多個(gè)氨基時(shí)往往難以實(shí)現定點(diǎn)的[7] 宓鵬程, 朱頤申,張琪,等.固相合成胸腺五肽[].有機化PEG化修飾,分析和確定產(chǎn)物中PDG的修飾位點(diǎn)也較難”。學(xué),2007,27(12):1525-1529.基于這一點(diǎn),本研究在TPS的基礎上引入半胱氨酸,并選[8] 王良友, 劉克良.多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法0.有機化學(xué), 203,1(23); 1320-1323.擇僅與半胱氨酸的巰基反應的mPEG-MAL,無(wú)需對氨基酸(收稿日期:2011-06-13)分光光度法測定山玫膠囊中總黃酮的含量杜義龍,李艷榮,王領(lǐng)弟,潘海峰,張曉峰^(承德醫學(xué)院中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗室,河北承德067000)[摘要]目的:建立山玫膠囊中總黃酮含量的測定方法并測定其含量。方法:以蘆丁為對照品采用分光光度法于510nm處測定御室金丹藥業(yè)山玫膠囊和實(shí)驗室自制山玫膠囊總黃酮的含量。結果:回歸方程為Y=l2.602X-0.0216,蘆丁在0.8X 10 2mg/ml- 4.8X 102mg/ml線(xiàn)性關(guān)系良好(r =0. 996),回收率為98.6%，RSD為1.75%。含量測定結果表明，御室金丹藥業(yè)和實(shí)驗室自制的山玫膠囊總黃酮含量差異不明顯。結論:該方法簡(jiǎn)便、準確、可靠,可用于山玫膠囊中總黃酮的含量測定。[關(guān)鍵詞]山玫膠囊;總黃酮;蘆酊;分光光度法中國煤化工[中圖分類(lèi)號]R917[文獻標識碼]A [文章編號1]1004- 6879(20MYHCNMH GO通訊作者●353●