酶工程研究及應用

Sum 120 No. 92005年9月文章編號:1002-1124(2005)09-0029-04綜酶工程研究及應用述陳紅霞(山東濟寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)工程系,山東濟寧272037)摘要酶工程是現代生物技術(shù)的重要組成部分,它作為一項高新技術(shù)將為各工業(yè)的發(fā)展起重要推動(dòng)作用。介紹了酶固定化、基因工程菌(細胞)的固定化、植物細胞培養產(chǎn)酶、酶的化學(xué)修飾、核酸酶、抗體酶、酶標藥物的理論和技術(shù)研究的最新進(jìn)展以及酶工程在各工業(yè)中的應用,對酶工程的發(fā)展前景進(jìn)行了探討關(guān)鍵詞:酶工程;酶的固定化;核酸酶;抗體酶;應用中圖分類(lèi)號:Q814文獻標識碼:ACHEN Hong-xiaDepartment of Biology Chemistry, Jining Vocational and Technological College, Jining 272037, China)Abstract: Enzyme engineering is an important composing part of modem biotechnologies, it will take great effect inindustry as a new technology. The new advance in enzyme engineering research includes such as enzyme immobilizationmodification of enzymes, ribozyme abzyme enzyme labelling drug and the application of enzyme engineering in常用的載體有纖維素、瓊脂、對氨基苯磺酰(ABSE)1酶工程技術(shù)纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、對氨基苯纖維素及苯胺1.1固定化酶和固定化細胞多孔玻璃等;包埋法是將酶(細胞)限制于凝膠網(wǎng)格固定化酶是指將可溶的自然酶束縛在特定的支內或微囊中的技術(shù),如底物及產(chǎn)物為易溶于水的小持物上或固定在局限的空間,并能發(fā)揮催化作用,而分子時(shí),可采用此法制備固定化生物催化劑。載體固定含酶的細胞則形成固定化細胞。我國研制過(guò)的有聚乙烯醇、卡拉膠、海藻膠瓊脂、血纖維、膠原蛋固定化酶或細胞已有50種左右,可分為3種類(lèi)型白、聚丙烯酰胺凝膠、丙烯酸高聚物等;選擇性熱變固定化單酶或含特定酶的細胞;固定化雙酶將兩種性技術(shù)是將酶限制于細胞內,但細胞內酶不變性的酶共固定在一種載體上或分別固定后串聯(lián)在一起使技術(shù)。工業(yè)中包埋法應用較多,其次是吸附法。目用固定化各類(lèi)激酶構成ATP再生系統。固定化的前已用的生物催化劑有酶膜酶片、酶塊、酶纖維酶方法主要有吸附、共價(jià)結合、包埋和選擇性熱變性珠、酶管和酶微囊等形狀。等。固定化過(guò)程必須使用水不溶性固體支持物(載固定化細胞包括微生物細胞、動(dòng)物細胞和植物體)。吸附法是利用吸附劑、表面作用力或離子交換細胞,目前更多地注重活細胞和增殖細胞的固定化劑電性作用將酶(細胞)定位于載體表面的技術(shù),當植物細胞固定化大多采用包埋法,處于靜止生長(cháng)期底物或產(chǎn)物為大分子或水溶性較差的小分子物質(zhì)的植物細胞用瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈣或角又菜膠固時(shí)常采用此法制備固定化生物催化劑。常用載體定,可獲得較高活力的酶制劑。也可用聚氨酯尼龍有活性炭、氧化鋁、皂土、白土、高嶺土、多孔玻璃、硅或聚丙烯酰胺在有細胞存在時(shí)聚合成膠。至今已報膠、石英砂、 Amberlite IRA、 AmberliteIR、DEAE-纖維道了固定化南洋金花煙草胡蘿卜等十多種細胞的素、CMC、DEAE- Sephadex等;共價(jià)結合法是將酶研中國煤化工行中藥有效成分的(細胞)與載體之間通過(guò)共價(jià)健結合而固定的技術(shù)CNMHG動(dòng)物細胞固定化只有王付用日前動(dòng)物細胞微囊化法用得最多的是聚賴(lài)氨酸/海藻酸( PLL/ALG)法,細胞收稿日期:2005-05-17作者簡(jiǎn)介陳紅(192),女,山東濟寧人,副教授,主要研究方生長(cháng)密度可達108-100未來(lái)將有一大批具有生物酶工程及應用?；钚缘牡鞍踪|(zhì)可依賴(lài)固定化細胞在生物體外大規模陳紅霞:酶工程研究及應用2005年第9期的合成。醇法、聚順丁烯二酸酐法等。酶與高分子化合物結1.2基因工程菌(細胞)的固定化合后,可以增加酶的穩定性和活力。例如抗白血病生物細胞合成的酶量由于機體生命活動(dòng)平衡調藥物天冬酰的游離氨作用、?；磻M(jìn)行修飾后,該節的需要,一般不會(huì )表達出很高的濃度,從而限制了酶在血漿中的穩定性有很大提高;胰凝乳蛋白酶與直接利用天然酶來(lái)解決更多化學(xué)反應的可能性,應水溶性大分子化合物右旋糖酐結合后,其催化活力用基因重組技術(shù)將生物細胞中存在的極少的催化某提高4倍6。常用修飾劑主要有乙酸酐、氮芥類(lèi)、磷生化反應的酶通過(guò)基因擴增和增強表達,建立高氧酰氯、環(huán)氧丙烷重氮鹽類(lèi)羥胺等效表達特定酶制劑的基因工程菌或基因工程細胞,1.5核酸酶和抗體酶從而進(jìn)一步構建成固定化工程菌或固定化工程細胞核酸類(lèi)酶是一類(lèi)由核糖核酸(RNA)組成的酶,的新一代催化劑。如德國B(niǎo)M公司應用蛋白質(zhì)工程進(jìn)一步的研究發(fā)現核酸酶不僅可以作用RNA和技術(shù)對表達青霉素?；幕蜻M(jìn)行點(diǎn)突變改造,重DNA,而且還作用于多糖、氨基酸酯等底物。核酸酶建了青霉素?；腹こ叹?從而大大延長(cháng)了固定化還同時(shí)具有信使編碼功能和催化功能,實(shí)現遺傳信青霉素?；傅氖褂冒胨テ?其酶柱可連續使用息的復制、轉錄和翻譯;核酸酶具有核酸序列的高度700d以上山。應用DAN重組技術(shù)建立了絲氨酸和特異性,從而使核酸酶具有很大的應用價(jià)值,只要知色氨酸合成酶工程菌21。道某種核酸酶的核苷酸序列,就可以設計合成催化1.3植物細胞培養產(chǎn)酶其自我切割和斷裂的核酸組成,根據這些基因組的是20世紀80年代發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。首先選全部序列,就可以設計并合成出防治有這些病毒引擇適宜的植物外植體,經(jīng)誘導、選育得到優(yōu)良的植物起的人、畜和植物病毒病的核酸酶,如能夠防治流細胞,再在人工控制條件的生物反應器中培養植物感、肝炎、艾滋病和煙草花葉病等。核酸酶也可以治細胞,以生產(chǎn)色素、香精和藥物等次級代謝物。植物療某些遺傳病和癌癥,還可以用作研究核酸圖譜和細胞培養不受地理環(huán)境和氣候條件等的影響,具有基因表達的工具6。生產(chǎn)周期短、產(chǎn)率高等顯著(zhù)特點(diǎn),已經(jīng)發(fā)展成為生物抗體酶( Abzyme)又稱(chēng)為催化性抗體,一類(lèi)具有工程研究和開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域。郭勇等人2先后進(jìn)行生物催化功能的抗體分子?？贵w酶可以采用誘導法了植物細胞培養生產(chǎn)次級代謝物的研究,選育出了和修飾法獲得。修飾法是采用分子修飾技術(shù),將抗優(yōu)良的木瓜細胞、大蒜細胞、鼠尾草細胞、玫瑰茄細體結合部位的結構改變成為酶分子的活性中心,從胞、黃花蒿細胞胡蘿卜細胞、巴戟天細胞和銀杏細而產(chǎn)生有催化活性的抗體。誘導法可以采用某種酶胞等,分別用于生產(chǎn)木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、為抗原誘導生成該酶的抗體,再以該酶的抗體為抗過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等藥用酶以及色素、藥原誘導抗體的產(chǎn)生。這樣,抗體的結合部位與作為物等次級代謝物?？乖拿傅幕钚灾行木哂邢嗤臉嬒?就有可能篩1.4酶的化學(xué)修飾選得到抗體酶。也可以采用某種化合物為半抗原,酶的化學(xué)修飾是指利用化學(xué)手段將某些化學(xué)物將它與蛋白質(zhì)相結合后作為抗原誘導抗體酶的產(chǎn)質(zhì)或基團結合到酶分子上,或將酶分子的某部分刪生2?？贵w酶已經(jīng)用于酶作用機理的研究、手性藥除或置換,改變酶的理化性質(zhì),最終達到改變酶的催物的合成和拆分抗癌藥物的制備6化性質(zhì)的目的。目前修飾劑的選用和修飾方法上有1.6酶標藥物較大進(jìn)展:(1)修飾酶的功能基團,如氨基、羥基、咪近來(lái),人們可以根據藥物在生物體內可能的作唑基等可離解基團;有?；?、烷基化法、丹磺酰氯用目標,如酶或受體來(lái)設計藥物,由此獲得的藥物被法等,如抗白血病藥物天冬酰胺酶4,經(jīng)修飾后可使稱(chēng)為酶標藥物。目前這種設計方法已成為藥物設計其在血漿中的穩定性提高數倍。(2)進(jìn)行酶分子內的主流,在新藥設計中發(fā)揮了巨大作用。血管緊張或分子間交聯(lián),應用某些雙功能試劑分子兩端的功素能基團如醛基等可使酶分子內或分子間肽鏈的兩個(gè)實(shí)游離氨基分別發(fā)生交聯(lián),主要有右旋糖苷溴化氰法、青YHa中國煤化工藥物的一個(gè)成功的CNMHG降壓藥物。細菌對足扌L素的誘導下大量合羰二亞胺法、戊二醛法等。例如交聯(lián)后的人a-半成青霉素酰胺酶,從而大大加快青霉素的水解造成糖苷酶A,其熱穩定性和抗蛋白酶的性能都有明顯的。人們已經(jīng)能夠利用青霉素酰胺酶除去青霉素分增加5。(3)酶與高分子化合物結合,主要有聚乙烯子中的芐基,代之以其他基團而獲得能夠抗青霉素2005年第9期陳紅霞:酶工程研究及應用酰胺酶的新青霉素。近來(lái)的研究發(fā)現,對人類(lèi)健康由于外原性酶在體內易產(chǎn)生免疫反應,且穩定構成巨大威脅的艾滋病的感染和傳播,主要是由艾性差,又難達到特定部位,因此,固定化酶、人工細滋病病毒顆粒表面的蛋白酶引起的。因此,艾滋病胞脂質(zhì)體及紅細胞膜包埋酶工程技術(shù)在臨床治療病毒蛋白酶的研究成為一個(gè)熱點(diǎn),人們希望通過(guò)對中的應用日趨活躍。將固定化酶應用于體內作為治艾滋病病毒蛋白酶抑制劑的研究,尋找出防止艾滋療藥物;將固定化酶組裝成體外生物反應器,通過(guò)體病病毒感染和治療艾滋病的方法8,9外循環(huán)作為臨床治療劑。從植物中克隆苯丙氨酸脫氨酶基因,導入腸道有益菌乳酸乳球菌中表達,用以2酶工程技術(shù)的應用治療引起兒童智力障礙的苯丙酮尿癥,已在動(dòng)物試現代酶工程具有技術(shù)先進(jìn)廠(chǎng)房設備投資小、工驗中獲得成功。酶傳感器已廣泛用于工業(yè)發(fā)酵藝簡(jiǎn)單能耗糧耗低產(chǎn)品收率高效率高、效益大和臨床監測及監護,如安放于靜脈或動(dòng)脈中的葡萄糖污染小等優(yōu)點(diǎn),正日益成為食品、化工醫藥工業(yè)應用傳感器能持續不斷地監測血糖含量,并將指令傳給方面的主力軍。以往采用化學(xué)合成、微生物發(fā)酵及植入人體的胰島素泵,控制胰島素釋放量,而使糖尿生物材料提取等傳統技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)品,皆可通過(guò)現病人獲救代酶工程生產(chǎn)甚至可獲得傳統技術(shù)不可能得到的2.3酶工程技術(shù)在食品工業(yè)的應用昂貴產(chǎn)品,如昂貴藥品人胰島素、MAb、IN、6-應用酶工程技術(shù)生產(chǎn)食品添加劑,如海藻酸鈣APA、7-ACA及7-ADCA等。固定化基因工程菌包埋乳酸菌生產(chǎn)乳酸,采用從豆類(lèi)提取的脂肪氧合工程細胞以及固定化技術(shù)與連續生物反應器的巧妙酶或均質(zhì)的植物組織,如萵苣葉可將亞油酸轉化成結合,將導致整個(gè)發(fā)酵工業(yè)和化學(xué)合成工業(yè)的根本具有新鮮、青香氣息的順-3-已烯醇和反-2-己性變革。烯醇,采用玉米麩質(zhì)粉為主要原料,經(jīng)a-淀粉酶液2.1酶工程技術(shù)在醫藥工業(yè)中的應用化、水解、脫色脫臭及干燥制得新型食品添加劑玉米應用固定化細胞可大量生產(chǎn)各種初級或中間產(chǎn)蛋白發(fā)泡粉;應用酶工程技術(shù)進(jìn)行功能食品成分的物,產(chǎn)品有D-葡萄糖、D-果糖、甘油、1,6-二磷酸開(kāi)發(fā),可生產(chǎn)活性多糖低聚糖活性肽及氨基酸、核果糖、檸檬酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、乳酸、右旋糖酐、賴(lài)氨苷酸和糖醇等,如動(dòng)物軟骨經(jīng)木瓜蛋白酶處理提取酸、6-APA、7-ACA及7-ADCA、麥角生物堿、羥化硫酸軟骨素,殼聚糖經(jīng)殼聚糖酶處理制得低聚殼聚孕酮、可的松和肉瘤堿等;應用酶工程技術(shù)進(jìn)一步綜糖卵蛋白經(jīng)自身酶法脫糖后,加入蛋白酶進(jìn)行酶解合應用了酶抑制劑,生化阻斷突變株和細胞通透性制成卵白肽;酶工程技術(shù)在食品加工中有廣泛應用,的改變等從而制得了雄甾-1,4二烯-3,17二酮如以玉米淀粉為原料,在糊化時(shí)加入耐熱a-淀粉(ADD),雄甾-4-烯-3,17二酮(4AD)和3氧聯(lián)降酶,采用酶脫支反應等手段改變淀粉原有的分子結膽甾1,4二烯-20酸(BDA)等關(guān)鍵中間體,使復雜構并重新結晶,可以提高產(chǎn)品中抗性淀粉的含量,果的天然資源經(jīng)過(guò)幾步反應就合成了各種性激素和皮膠酶可以提高果汁澄清度葡萄糖氧化酶用于果汁質(zhì)激素,如應用固定化微生物細胞技術(shù)可生產(chǎn)強的脫氧化超氧化物酶用于乳清脫色等。松、11-去氧強的松、氫化可的松、△-膽甾烯酮、△24酶工程在環(huán)保中的應用雄二烯-3,17-二酮等甾體化合物;應用酶工程微生物在環(huán)境治理方面發(fā)揮了巨大的作用,各可以制造6-氨基青霉烷酸(6-APA),7-烷基頭孢種微生物酶能夠分解糖類(lèi)、脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素、木烷酸(7-ACA),頭孢菌素Ⅳ,7-氨基脫乙酰氧頭孢質(zhì)素、環(huán)烴、芳香烴、有機磷農藥、氰化物、某些人工烷酸(7-ADCA),脫乙酰頭孢菌素等抗生素,青霉素合成的聚合物。人們研究的用于環(huán)境治理的酶包括和頭孢菌素前體物的合成的最新工藝也采用酶工程如下幾類(lèi):處理食品工業(yè)廢水,如淀粉酶、糖化酶、蛋的方法;應用酶工程生產(chǎn)氨基酸,制造2-酮基-白酶、脂肪酶、乳糖酶、果膠酶、幾丁質(zhì)酶等;處理造L-古龍糖酸,肌醇,L肉毒堿,CoA等維生素,由山紙中國煤化工奏酶漆酶等處理芳梨醇和葡萄糖生產(chǎn)維生素及丙烯酰胺的生產(chǎn)也采用香方酪氨酸酶、萘雙氧酶工程的方法{;應用酶工程生產(chǎn)核苷酸類(lèi)藥物,合醇,CNMH0、以、腈水解酶氰化物水如ATP和AMP分別由氨甲酰磷酸激酶和激酶加乙合酶等;處理有機磷農藥,如對硫磷水解酶、甲胺磷酸激酶制得等。降解酶等,處理重金屬,如汞還原酶、磷酸酶等;還有2.2酶工程技術(shù)在醫療中的應用能夠完全降解烷基硫酸酯和烷基乙基硫酸酯或部分陳紅霞:酶工程研究及應用2005年第9期降解芳基磺酸酯的烷基硫酸酯酶等。隨著(zhù)人們研究參考文獻的深人,酶工程技術(shù)必將在各種工業(yè)廢水和生活污[1]吳梧桐酶工程技術(shù)的研究及其在醫藥領(lǐng)域的應用[J藥學(xué)進(jìn)水的治理中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。展,1994,18(3):129-134.[2]郭勇酶工程研究進(jìn)展與發(fā)展前景[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(自3酶工程技術(shù)研究應用前景然科學(xué)版),200,30(11):130-133[3」曾慶平,郭勇植物細胞對環(huán)境脅迫的適應性應答[J應用與酶工程的發(fā)展在生物工程學(xué)科的發(fā)展中占有重環(huán)境生物學(xué)報,199,5(2):152-159要位置。2世紀,生物科學(xué)與生物工程的發(fā)展將進(jìn)4王正樣,劉吉泉,諸葛健,[1]生物工程學(xué)報,x0016(3步揭示生命的奧秘,在世界科技和經(jīng)濟發(fā)展中起[5]甄朱.[J].生物工程學(xué)報,2001,17(5):491-493主導和支柱作用。作為生物工程重要組成部分的酶6鄭成酶工程的研究進(jìn)展簡(jiǎn)述[].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)工程亦將飛速發(fā)展,前景廣闊。21世紀酶工程的發(fā)版),2001,22(6):39-44.展主題是31:新酶的研究與開(kāi)發(fā),酶的優(yōu)化生產(chǎn),酶7]居乃琥21世紀工程研究的新動(dòng)向[】,工業(yè)微生物,200,31的高效應用。除采用常用技術(shù)外,借助基因組學(xué)和(1):37-4蛋白質(zhì)組學(xué)的最新知識,借助DNA重排和細胞、噬[8]Kozarich, ]. W. And Rich, D H [JI. Current Opinion ChemBiol997,(1):149-150.菌體表面展示技術(shù)進(jìn)行新酶的研究與開(kāi)發(fā),目前最o]馬曉建白凈任珂,等,酶工程研究的新進(jìn)展[]化工進(jìn)展令人矚目的新酶有核酸類(lèi)酶、抗體酶和端粒酶等2003,22(8);813-817充分發(fā)揮酶的催化功能、擴大酶的應用范圍、提高酶101 Yair Aharonowit.etl, J]. Biotechnology,99,(1m):807-810的應用效率是酶工程應用研究的主要目標,要采用1穆小民,吳顯菜,酶的開(kāi)發(fā)利用與工程[,世界生物技術(shù),固定化分子修飾和非水相催化等技術(shù)實(shí)現酶的高(21)潘仁莉、酯工程研究開(kāi)發(fā)的進(jìn)展和建議(1.生物學(xué)雜志效應用,將固定化技術(shù)廣泛用于生物芯片、生物傳感1998,15(6):21-23器、生物反應器、臨床診斷藥物設計、親和層析以及13]來(lái)蕓.酶工程的發(fā)展熱點(diǎn)—生物傳感器].科技前沿蛋白質(zhì)結構和功能的研究,使酶工程技術(shù)在各工業(yè)2001,(10):44.中發(fā)揮更大的作用。(上接第25頁(yè))J]重慶工業(yè)高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報,2004,19(1):1-6但仍然存在許多制約其廣泛應用的問(wèn)題值得深入地許振良膜法水處理技術(shù)M.化學(xué)工業(yè)出版社,201盡管陶瓷膜的研究與應用已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,(101]王懷林,王憶川,姜建勝,等陶瓷微濾膜用于油田采出水處理研究[J].膜科學(xué)技術(shù),研究和探討主要是如何降低陶瓷膜的生產(chǎn)成本;如(12)徐南平,邢衛紅,王沛,無(wú)機膜在工業(yè)廢水處理中的應用與展何提高膜的分離效果及長(cháng)時(shí)間維持膜通量的穩定望[].膜科學(xué)與技術(shù),2000,20(3):23-28.性;如何擴展無(wú)機陶瓷膜的應用范圍和應用深度等。[131mnA.,s.C. Using membrane to recycle two nonionic alkaline metal這些都應是今后陶瓷膜的制備和應用方面應重點(diǎn)突cleaning solution [J]. Memb Sci., 1999, 162: 219-234破的方向。[14 R. J. Lahiere, K P Goodboy Ceramic membrane treatment ofpetrochemical wastewater J]. Envir. Prog., 1993, 12(2): 86-89參考文獻[15] Sang H Hyun, Gye T Kim. Sythesis of ceramic microfiltration1]劉茉娥,等膜分離技術(shù)應用手冊[M].化學(xué)工業(yè)出版社,2001membranes for oil/water separation[J1.SepSce.Tech,1997, 322]李旭祥分離膜制備與應用[M].化學(xué)工業(yè)出版社,2004(18):2927-29433]顏秀茹趙宗艾,微孔TO2陶瓷膜的制備和性能的初步研究16] Hanna m. Huotan, Ingmar H. Huisman,Cum. Trager.Ee[J].水處理技術(shù),1998,24(3):125-129enhanced cmss- flow membrane filtration of oily wastewater t[4]陶洪亮余桂,楊南如溶膠-凝膠法工藝制備無(wú)支撐yAl2O3分離膜[J].硅酸鹽通報,1994,(1):26-29[ 17] C.Soma, M. Rumeau, C sergent, Use of mineral membranes in the[5] XHuan, G L Meng. [J]. Membr. Sci., 1997,133: 145-150treatment o texile effluents[ R]. Proc. Ist Intl Conf on Inorg.Membr[6]袁文輝,葉振華氧化鋁無(wú)機膜的制備[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1997,10(25):10中國煤化工7]馬衛文,丁子上.無(wú)機膜分離的發(fā)展與應用[門(mén)].材料科學(xué)與工CN MH Intenational Conference程,1996,14(1):1-4Inorganic Membranes. Montpellier,例列l,l-l628]侯相林,高蔭本陳涌英微孔無(wú)機膜的制備與改性[J].膜科學(xué)[19]J.M.Bur,J, Yassin,G.Mxsg,ea與技術(shù),1996,16(4):7-11pplications of carton membranes[R]. Proc. 2d IntlConfon9]陳如海,方振東,無(wú)機陶瓷膜在水處理中的應用現狀及展望Membr. Montpellier, 1991,207-212.