RNAi功能及應用

中外醫療漂EGN MEDICAL TREATM∈NT基礎醫學(xué)RNAi功能及應用0林健澤李振字(南方醫科大學(xué)附屬深圳市第二人民醫院脊柱外科廣東深圳518035)【摘要】RNA干涉( RNA interference,RNAi)是將雙鏈RNA( dsRNA)導入蛔胞引起特異基因mRNA降解的一種蛔胞反應過(guò)程,它是轉錄后蕙因沉默(PIGS的一種這一過(guò)程已經(jīng)在包括擬南芥線(xiàn)蟲(chóng)和真菌等多種模式生物中得到揭示RNA具有高效性和高度特異性,在維持基因蛆穩定基因表達調控保護基因蛆竟受外源橄酸侵入等方面發(fā)揮重要生物學(xué)作用。RNAi作為基因沉默的一個(gè)工具,RNAi作為基因沉默的一個(gè)工具,已被廣泛用于基因功能研究基因治療和新藥研究與開(kāi)發(fā)等方面【關(guān)鍵詞】RNA干涉小干涉RNA基因沉默【中圖分類(lèi)號】Q421:R338文獻標識碼】A【文章編號】1674-0742(2009)03(c)-0012-03RNAi研究的歷史過(guò)程等用 dsRNA轉染未經(jīng) dsRNA處理過(guò)的果蠅胚胎細胞的提取物,1990年, Jorgensen和Mol領(lǐng)導的研究小組在研究牽?；ê铣扇瘫O測在這一無(wú)細胞體系中以放射標記的 dsRNA和mRNA變色素基因時(shí),偶然發(fā)現在向牽?；ㄞD導色素合成基因時(shí),不僅是化,結果發(fā)現,不論mRNA是否存在, dsRNa都被分解成21轉入的基因未表達,而且自身的色素合成也減弱了。相似的現象23nt的小片斷,而且不論標記 dsRNA的正義鏈或反義鏈,都可檢還發(fā)生在真菌的研究中,當把合成類(lèi)胡蘿卜素的基因轉入到紅色測到這些小分子RNA的存在,說(shuō)明 dsRNA的兩條鏈均發(fā)生斷裂面包霉中時(shí),卻導致大約30%轉染細胞自身基因的失活,研究者當只有在特異性 dsRNA存在的條件下mRNA才被降解,而且斷裂時(shí)把這種現象稱(chēng)為“抑制( cosuppression)”,1995年Guo等在利的位置僅限于 dsRNA的相應的序列,將其分成21~23nt的片斷用反義RNA技術(shù)研究秀麗新小桿線(xiàn)蟲(chóng)( C elegans)的par-1基因提示靶mRNA的斷裂是以 SiRNA作為模板的。更為詳盡的實(shí)驗功能時(shí)發(fā)現,將與目的基因mRNA互補的反義RNA導入線(xiàn)蟲(chóng)細表明,RNA降解過(guò)程涉及兩個(gè)步驟-9,第一步是雙鏈RNA被名胞,能夠阻斷par-1基因的表達,但是奇怪的是,注入正義鏈RNA為 Dicer的核酸內切酶Ⅲ( RNase Ill)樣蛋白加工成21-~25nt長(cháng)度作為對照,也同樣阻斷了基因的表達。這一奇特的現象直到3年的 siRNA。第二步,反義鏈RNA引導核酸內切酶復合體(RSC)去后才被闡明,1998年Fire等發(fā)現這種現象是由于在制備正義/切除單鏈的同源mRNA.RISC在 SiRNA的引導下,切斷序列特反義RNA時(shí)混入了少量的 dsDNA,他們將unc2,feml、hhl、異性的mRNA,切斷部位大約在與反義小干涉RNA配對序列的myo3、gfp等基因的正義RNA、反義RNA、, dsRNA分別注射到中部,而后,mRNA進(jìn)一步降解線(xiàn)蟲(chóng)中,發(fā)現 dsRNA所引起的基因沉默效應要比單個(gè)正義RNA2.2RNA介導同源DNA甲基化(RdDM)RNA或者反義RNA都要強的多,如果將制備的RNA純化,正義RNA目前認為RNAi在細胞內發(fā)揮作用主要包括擴增和催化反應引起的基因沉默就會(huì )消失,反義RNA引起的基因沉默也會(huì )變得兩個(gè)主要步驟。而在植物中,發(fā)現RNAi也能引發(fā)DNA甲基化,很微弱。他們把這種 dsrna介導的轉錄后基因沉默現象稱(chēng)為從而導致轉錄沉默現在證明sRNA可能通過(guò)直接DNA甲基RNAi。后來(lái)的實(shí)驗表明 dsrNA不單可以特異性阻抑靶基因表化和在其他一些基因組中的共價(jià)修飾來(lái)完成轉錄過(guò)程。在植物達,而且還會(huì )導致其第一代子代的同源基因沉默。中,這一活性可能由另外一類(lèi) SiRNA介導完成。介導同源DNA2RNAi的作用機制序列中胞嘧啶甲基化作用,需要在PTGS/RNA中引導同源RNA雖然遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法已用于探索RNAi的機制,但真降解的sRNA的產(chǎn)生,只有與引導RNA序列互補的DNA序列才正的機理目前尚未明了,下面是RNAi的一些可能機制能被修飾,表明RNA與DNA直接發(fā)生相互作用。短至30bp的2.1 siRNA介導同源RNA降解DNA序列能夠作為甲基化的目標,胞嘧啶是甲基化位點(diǎn),且在胞1999年, Ham ilton等在植物基因沉默的研究中發(fā)現,21~漿中產(chǎn)生的誘導PTGS的RNA能從細胞質(zhì)進(jìn)入細胞核,產(chǎn)生對細5nt的 dsRNA的出現對轉基因導致基因沉默十分重要,而在轉基胞核的反饋作用,激發(fā)同源DNA的甲基化,這種RNA指導的因正確表達的植物中則未出現。隨后, Hammond5和 Tuschl等6DNA甲基化擴大了原來(lái)有限的甲基化,從而進(jìn)一步加強了基因沉也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗研究證明了這些小分子RNA在RNAi中的作默。研究證實(shí)RdDM可能在啟動(dòng)或維持基因沉默中起作用,DNA用。因此提出了RNAi的模式:即 dsRNA被處理加工產(chǎn)生出21~甲基化缺陷將引起PTGS緩解。RNA觸發(fā)RdDM可能與DNA甲23nt的RNA,后者通過(guò)序列互補介導mRNA的剪切降解。另MYH中國煤化工部分解鏈的DNA以形成實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)了 siRNA在RNAi過(guò)程中的存在和作用。 Zamore RNCNMHGRNA2DNA三分子螺旋①基金項目:深圳市科技計劃項目(200602043)12中外醫療 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENTCHINA FOREIGN MEDICAL T提中外醫療基礎醫學(xué)這些異常結構可能吸引 MTase靠近,經(jīng)過(guò)充分循環(huán),催化同源顯微注射、浸泡或喂養的方法導入線(xiàn)蟲(chóng),然后用解剖顯微鏡或微DNA甲基化1-12l最近有報道,在粟酒裂殖酵母( s Pom be)中分干涉差顯微鏡觀(guān)察RNAi表型變化, ahringer)小組應用喂食RNAi機制在合成和維持高度有序的染色質(zhì)結構與功能中發(fā)揮至的方法完成了預測基因86%的RNAi分析。 Hyman小組根據染色關(guān)重要的作用。缺失RNAi過(guò)程中關(guān)鍵基因導致中心粒DNA和體I的每個(gè)可讀框,用PCR擴增基因組片段,將合成的 dsRNA其他類(lèi)型的異染色質(zhì)的表觀(guān)遺傳沉默現象缺失。這些改變伴隨注射入線(xiàn)蟲(chóng)體內誘導了系統的RNA反應,并記錄了胚胎突變表著(zhù)有這些區域的甲基化狀態(tài)改變進(jìn)而中心黏合作用喪失導致核型。Pano和 Kemphues小組分析了350個(gè)卵細胞cDNA基因,其分裂過(guò)程中染色體的錯誤分離。有研究者據此提出理論解釋了中81個(gè)基因在胚胎生成中有重要作用。在野生型細胞中,中心粒重復序列的表達導致 dsRNA甲基化。也3.2基因治療有報道 SiRNA介導染色體結構跟大的改變,在四膜蟲(chóng)中程序性基RNAi的作用具有高效率和高特異性的特點(diǎn),它能使目標蛋因組重排導致特異性DNA序列的切除白的mRNA發(fā)生特異性的降解。因此,RNAi是基因沉默療法的23RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(RdRP)模型理想工具。目前,人們已經(jīng)證明在培養的哺乳動(dòng)物細胞中,RNAiDNA甲基化能引起轉基因轉錄的提前終止,從而產(chǎn)生異?？捎糜诳共《竞涂鼓[瘤等的基因治療及神經(jīng)系統疾患的治療。RNA,轉基因在細胞核中表達也導致了高水平的異常RNA轉錄。 Novena等發(fā)現,轉染針對CD4受體合成的 SiRNA能使HV-1感當異常RNA的量超過(guò)一定閾值時(shí),就會(huì )被存在于細胞質(zhì)中的某染Magi-CCR5細胞的能力降低75%沉默gag能使p24表達下降體系所感知并激活細胞質(zhì)中的RdRp,于是RdRp以異常RNA75%,nef- sirna則能使nef轉錄產(chǎn)物減少為原水平的10%,p24水為模板轉錄出小片段互補DNA(cDNA),這些cD2NA與核糖核酸平下降為原水平的4%。這些實(shí)驗都能大大降低游離病毒水平。酶形成一個(gè)序列特異的復合物RISC,CDNA處于復合物的中心。 Brisibe等指出,在HIV-1基因組中nef基因可能是最重要的調該復合物能與mRNA雜交,捕獲并降解與轉基因序列相同或互補控基因。Nef是HⅣ早期表達產(chǎn)物,幾乎占早期mRNA的80%,作的RNA,從而成為專(zhuān)一性作用于雙鏈RNA的RNA降解酶底物,用包括下調CD4、細胞凋亡、信號轉導和非CD4細胞萎縮,與引起低水平轉基因RNA的積累。體外實(shí)驗證明該酶能以RNA為L(cháng)TR有一定重疊。Xia等用重組腺病毒相關(guān)病毒(AAV)對轉基因模板合成cDNA,他們在體內雜合到相應mRNA上,并被特異作小鼠進(jìn)行腦內注射, shrnA使SCA1小鼠蒲肯野細胞中異常用于雙鏈RNA的RNA降解酶降解。 RdRp cDNa模型可以很好 ataxin蛋白和其mRNA降低了50%~60%, Calbi2ndin染色顯示神地解釋PTGS很強的序列特異性。非正常RNA能作為RdRp的經(jīng)元死亡大大減少,核內 ataxin包涵體減少50%,且 rotarod運動(dòng)底物,從而激活了RNA降解機制,導致外源基因轉錄后水平上的實(shí)驗也證實(shí)小鼠的運動(dòng)功能明顯改善。亨廷頓舞蹈病是外顯子沉默,脫腺苷化的mRNA作為異常RNA或RNA指導下的RNA1中HD基因引起多谷氨酰胺擴增,生成了毒性 huntingtin蛋白聚合酶模板,在細胞質(zhì)中作為潛在的基于同源降解機制的激活(htt)。理論上,沉默 huntingtin基因能減輕神經(jīng)毒性緩解舞蹈癥劑,只要有足夠的宿主編碼RNA指導下RNA聚合酶的底物,反狀。 Harper等將htt- shRNA質(zhì)粒以AAV為載體轉染小鼠,htt義RNA就能被合成。如果相關(guān)mRNA的3′端特定部分降解,就mRNA被抑制55%~85%,包涵體基本消失,對正常的內源性htt會(huì )引起轉錄后水平的基因沉默12沒(méi)有影響。 Rotarod運動(dòng)實(shí)驗證明,轉染 shRNA的小鼠的運動(dòng)功3RNAi的應用能明顯改善。腫瘤是一種多基因突變累積與相互作用形成的細3.1探索基因功能的有力工具胞異常增生。由于RNAi能沉默特定基因的作用,可能在誘導凋在功能基因組研究中,需要對特定基因進(jìn)行功能喪失或降低亡、增加藥物敏感性、抑制突變基因和血管生成等多方面成為突變,以確定其功能。由于RNAi可以使特異基因mRNA發(fā)生降新的腫瘤治療方法。p53變異發(fā)生在50%的人類(lèi)腫瘤,變異的p53解,從而獲得特定蛋白功能喪失或降低的突變株。因此RNAi可會(huì )影響野生型p53的功能。因此,應用RNAi沉默變異的p53可以作為一種強有力的研究工具,用于研究功能基因組。而與其他以恢復野生型p53的功能。Bcl22是調控凋亡的基因家族,高表達幾種進(jìn)行功能喪失的技術(shù)相比,RNAi技術(shù)具有明顯的優(yōu)點(diǎn),該技會(huì )引起腫瘤耐藥。業(yè)已證明,沉默Bc22可促進(jìn)腫瘤細胞凋亡,恢術(shù)高效、特異、低毒性、周期短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢是傳統的基復對藥物的敏感性。Bcr/Abl是最早發(fā)現的融合基因,它的表達敲除技術(shù)和反義技術(shù)所無(wú)法比擬的。RNAi技術(shù)在線(xiàn)蟲(chóng)全基因是引起慢性粒細胞白血病CML)的主要原因。Bcr/Abl- siRNA組功能硏究及果蠅、錐蟲(chóng)研究中均有很廣泛的作用。線(xiàn)蟲(chóng)全基能明顯抑制CML細胞中Bcr/ abImRNA表達,卻不影響c-abl和因組已于1998年測序完畢,RNAi的發(fā)現又為系統和高通量研究c-bcr表達,Bcr/Abl2 esiRNA能使各種細胞株對y射線(xiàn)和STI571線(xiàn)蟲(chóng)全基因組功能提供了可能。許多小組應用高通量的RNAi技(imat中國煤化工M細胞調亡術(shù)完成了功能基因組的分析,通過(guò)RNAi使預知的19427個(gè)基因4CNMHG中約95%的基因表達下調,實(shí)驗方法是:先用PCR方法或反轉錄Ax不明兒不L任亞研究領(lǐng)域引起了巨大反響,方法大規模獲得基因庫,直接體外或體內轉錄生成 dsRNA,再用由于能夠快速而簡(jiǎn)便的制備某個(gè)基因的功能缺失表型,它已成為CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT中外醫療13中外醫療MEDCAL THEATMENT基礎醫學(xué)基因功能研究中最有效的工具但在實(shí)際應用領(lǐng)域,一些問(wèn)題仍待解3191~3197決,如:如何選擇合適的載體;對于不同生物有效的sRNA的特征需要7] Zamore PD, et al. RNAi: double- stranded RNAdirects the AtP-de認;如何提高RNA的效率找到一種高效而低毒的適于人pendent cleavage of mRNAat 21 to 23 nucleotide intervals[J]體的轉染系統;如何避免脫靶效應;如何應對新的突變。但無(wú)論如何cell,2000,101(1):25-33作為一種重要的研究基因功能的有效工具,隨著(zhù)RNA研究的不斷完8] Elbashir S M, Lendeckel w, Tuschl T RNAinterference is mediated善和廣泛應用,它將在生命科學(xué)的研究疾病的防御及治療中發(fā)揮重by 212and 222nucleotide RNAs[].Genes Dev, 2001, 15(2):要的作用。參考文獻[9] Bernstein E, Caudy AA, Hammond S M, et al. Role for bidentate[1 Marx, JInterfering with gene expression[J]. Science, 2000, 288: 1ribonuclease in the initiation step of RNAinterference J]. Nature,370~3712001,409(6818):363~368[2] Guo S, Kemphues KJ Par2l, a gene required for establishing [10] Robin A RNAi and heterochromatin-a Hushed-up affair[]. Science,polarityin C elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase2002,297:1818~1819that is asymmetrically distributed[J]. Cell, 1995, 81(4): 611-620[ll] Jones L, Ratcliff F, Baulcombe DC. RNA2directed transcriptionalgene silencing in plants can be inherited ineinterference by double st randed RNAin Caenorhabditis elegans[J]RNAtrigger and requires Metl for maintenance[]. Curr Biol, 2001Nature,1998,391:806-810ll(10):747~757[4] Hamilton AJ, Baulcombe DC.Aof small antisense RNAin[12]孫建國,座榮霞,陳正堂,RNA干涉分子機制研究進(jìn)展[].生posttranscriptional gene silencing in plants[]. Science, 1999, 286物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2002,29(5):678-68113] Fraser AG, Kamath RS, et al. Functional genomic analysis of C.[5] Hammond SM,et al. An RNA-directed nuclease mediates post-tran-elegans chromosome I by systematic RNAinterference[J]. Nature,scriptional gene silencing in Drosophila cells[J]. Nature, 2000, 4042000,408(6810):325-330(6775):293[6] Tuschl T, Zamore P D, Lehmann R, et al. Targeted mRNAdegrada【收稿日期】2008-12-13tion by doublestranded RNAinvitro[]. Genes Dev, 1999, 13(24)《科技創(chuàng )新導報》稿件要求及投稿說(shuō)明稿件要求1、稿件應具有科學(xué)性、先進(jìn)性和實(shí)用性,論點(diǎn)明確、論據可靠、數據準確、邏輯嚴謹、文字通順。3、所變題家在半位內,計學(xué)號國家標學(xué)名詞及符號4、參考文獻按引用的先后順序列于文末6、正確使用標點(diǎn)符號,表格設計要合理,推薦使用三線(xiàn)表。7、圖片要請晰,注明圖號。1、來(lái)稿律使用Word排版且具有一定的學(xué)術(shù)水平,以2700宇左右為宜,并保證文章版權的獨立性,嚴禁抄襲,文責自負,請勿一稿多投,歡迎投稿2、本刊已加入《中國學(xué)術(shù)期刊(光盤(pán)版)》、《中文科技期刊數據庫》、《數字化期刊群》等網(wǎng)絡(luò )媒體,本刊發(fā)表的文章將在網(wǎng)絡(luò )媒體上全文發(fā)布。3、本刊編輯部對來(lái)稿有修改權,不愿改動(dòng)者請事先說(shuō)明。自收稿之日起1個(gè)月內未收到刊用通知,作者可自行處理4、來(lái)稿請注明作者姓名、單位、通訊地址、郵編、聯(lián)系電話(huà)及5、本刊發(fā)表周期為10天,出刊后5天內郵寄樣刊中國煤化工6、如有一稿多投、剽竊或抄襲行為者,一切后果由作者本人負責CNMHG14中外醫療 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT