反義核酸技術(shù)及應用

第25卷第4期大連醫科大學(xué)學(xué)報2003年12月Journal of Dalian Medical University反義核酸技術(shù)及應用曹長(cháng)姝,隋鴻錦大連醫科大學(xué)解剖學(xué)教研室遼寧大連116027)關(guān)鍵詞扳義核酸技術(shù);反義寡核苷酸P2-2010中圖分類(lèi)號夏52文獻標識碼文章編號:1671-72932003)4-0300-03反義核酸技術(shù)是用人工合成的或生物合成的特定互補合成的反義寡核苷酸抑制真核細胞基因、癌基因、病毒基因的DNA或RNA片段阻斷從基因到蛋白的信息流,以達到及其他內源基因的表達其已經(jīng)成為一種重要的抗腫瘤、抗抑制或阻斷基因表達的生物新技術(shù)。利用核酸分子雜交原病毒侯選藥物并進(jìn)行了大量的體外、體內研究。理將反義寡核苷酸( antisense oligonucleotide ASON胙作為外源性基因表達抑制物結合到靶mRNA序列上阻止其翻譯成2反義核酸技術(shù)的作用機制蛋白1。具有雜交特異性和選擇性調節基因的表達的特在反義核酸技術(shù)的應用過(guò)程中由于多種化學(xué)修飾的反點(diǎn)21這一技術(shù)不僅已成為常用的實(shí)驗室研究方法還廣泛義寡核苷酸的出現其作用機制已不僅僅是誘導 RNaseh的的應用于研究病毒、腫瘤、寄生蟲(chóng)和遺傳性疾病的預防和治切割機制RNεseH是一種廣泛存在旳酶在病毒和人體細胞療具有重要的應用前景。中都有發(fā)現能降解 DNA/RNA復合物中的RNA鏈)還存對于人類(lèi)基因的研究,人們采用分子克隆、分子雜交、在于非 RNaseh依賴(lài)的切割機制:如雙鏈 RNase、 RNasel、PCR技術(shù)等一系列研究手段。DNA重組技術(shù)的問(wèn)世推動(dòng) RAsp合成的切割物以及核( ribozyme)而且可以通過(guò)了一個(gè)新的研究領(lǐng)域的發(fā)展3。反義核酸技術(shù)從反向遺傳非切割機制阻礙mRNA的代謝如5′帽加工、調節剪接、抑學(xué)的角度為分子生物學(xué)增添了新的內容。所謂反義核酸技制翻譯起始、抑制翻譯延長(cháng)破壞核酸的相互作用5。術(shù)是一種根據堿基互補原則用人工合成或生物合成的與特所以在設計ASON時(shí)不僅要考慮它的序列特異性還要定的基因互補的DNA或RNA片段或其化學(xué)修飾物)斷考慮它的作用機制而且對一個(gè)特定的ASON其反義活性可從基因到蛋白的信息流從而達到抑制或阻斷基因表達的技能涉及多種機偉術(shù)。反義寡核苷酸是一類(lèi)人工合成或構建的重組載體表達的寡核苷酸片段通過(guò)堿基互補的原理干擾基因的解旋、復3反義核酸技術(shù)中寡核苷酸的序列設計、攝取及轉運制、轉錄、mRNA的剪接加工、翻譯等各個(gè)環(huán)節從而調節細從目前的研究來(lái)看反義寡核苷酸的設計應考慮到其在胞的生長(cháng)、分化等。體內的穩定性、能容易地進(jìn)入細胞并與靶序列高親合性結合反義核酸技術(shù)的發(fā)生發(fā)展且不產(chǎn)毒性與靶序列結合后特異性抑制靶基因地表達。所以選擇反義DNA或反義RNA時(shí),為使之特異地結合mR1977年 Paterson發(fā)現外源性核苷酸可調節基因表達,NA上,般至少15個(gè)核苷酸最長(cháng)不超過(guò)20~25個(gè)太長(cháng)1978年 zamecnik等證明特異互補的寡核苷酸在體外能有效的反義核苷酸很難進(jìn)入細胞內,一般選用18個(gè)核苷酸左右的扣制Rous肉瘤病毒RSv增殖。80年代早期人們發(fā)現細為宜其中G-C質(zhì)量分數應在60%-65%67所以長(cháng)的菌內的一類(lèi)基因組DNA自發(fā)轉錄的反義RNA4通過(guò)堿基反義RNA并不比短的反義RNA有效。在原核生物中針對互補原理與靶RNA主要是mRNA)配對結合抑制靶 RNA SI序列及其附近區域的反義RNA可能有效。真核生物中,的功能從轉錄水平和翻譯水平調節相關(guān)基因的表達發(fā)揮對應5′端非編碼區的反義RNA可能比針對編碼區反義其生物學(xué)作用。隨著(zhù)深入的研究反義核酸技術(shù)迅速地發(fā)展R中國煤化工不應有開(kāi)放讀框,否則該起來(lái)反義寡核苷酸其優(yōu)點(diǎn)在于高度靶特異性(堿基互補)反義的配對結設計多樣、合成容易及高度的局部性和針對性是常規藥物合。N形成位點(diǎn)或者3端非翻的設計、生產(chǎn)和作用所不可比擬的?，F在人們廣泛應用人工譯區、mRNA5’端非翻譯區、nRNA編碼區(主要是起始密收稿日期2002-10-17修回日期2002-12-24。作者簡(jiǎn)介曹長(cháng)姝1975-)女大連人碩士第4期曹長(cháng)姝等反義核酸技術(shù)及應用碼)這些區域的AXON可產(chǎn)生明顯的抑制功能8但高效的作用這是S-oigs最顯著(zhù)的特點(diǎn)。②甲基化寡核苷酸低毒的反義寡核苷序列設計尚無(wú)眀確的規律要證實(shí)反義寡(M-ogos)可對抗細胞內酶的水解對細胞無(wú)毒性作用已核苷對靶mRNA的特異性抑制、排除非特異作用機制除檢用于培養細胞上抑制病毒基因或內源性基因的表達。③聚測靶mRNA表達及蛋白質(zhì)外更重要的是要設立必要的對酰胺核酸ⅣNA)漢稱(chēng)肽核酸其保留核酸結構中最主要旳照。常用的對照有正義鏈( sense)錯義鏈( missense)及反義堿基結構其他兩種結構〔戊糖和磷酸殘基變成線(xiàn)性酰胺tit( antisense 1結構故PNA是一連串的酰胺基相連的長(cháng)鏈與一系列單個(gè)反義寡核苷酸旳穩定性問(wèn)題用化學(xué)修飾的方法有可能堿基相連的新型物質(zhì)。近年來(lái)隨著(zhù)ASN純化合成的硏究得到解決。目前認為靶向轉運系統可能解決反乂寡核苷酸技術(shù)進(jìn)展多種化學(xué)修飾的ASON問(wèn)世其中最具代表性的攝取及轉運問(wèn)題。已研究的特異性靶向技術(shù)包括受體介導是第一代反義核酸藥物的硫代ASON但與天然結構反義核的靶向轉運、免疫脂質(zhì)體靶向及毫微粒靶向、信號肽轉運苷酸相比其與靶πNA特異結合能力減弱;與一些細胞因signal peptide sP)或HIⅤg4l蛋白融合序列的寡肽載體子、受體、蛋白結合能力增強可受到3’核酸酶降解等缺點(diǎn)。等而且后兩者不需要經(jīng)過(guò)內吞過(guò)程可以有效地將反義核因此在應用中提高ASON的穩定性和保持其生物學(xué)活性酸轉運至細胞核。是選則ASON化學(xué)修飾物的關(guān)鍵因素。4反義寡核苷酸的劑量、給藥途徑和方式以及毒性6反義核酸技術(shù)的應用4.1反義寡核苷酸的劑量用反義寡核苷酸選擇性抑制基因表達的功能對于生物在不同的臨床前藥效研究中寡核苷酸旳有效劑量不同,醫學(xué)硏究有著(zhù)深遠的意乂特別是對于一些功能性的基因。與下列因素有關(guān)(1所用動(dòng)物的種系及疾病的種類(lèi)(2凜寡應用這種技術(shù)可使許多疾病得到治療或緩解15作為一組核苷酸的化學(xué)性質(zhì)(3給藥方法和途徑。所以有效劑量尚復合物被發(fā)展為治療劑。例如有一種反義寡核苷酸應用于有待于探索。巨細胞角膜炎的治療161因為目前許多眼部疾病沒(méi)有滿(mǎn)意4.2給藥途徑和方式的治療方案而這項技術(shù)為治療眼部疾病提供了廣闊的前在體內實(shí)驗中可以全身給藥。為了避免多次給藥可景。腫瘤一直是醫療工作者要攻克的頑癥對于腫瘤的化學(xué)采用微滲透泵等裝置。優(yōu)點(diǎn)在于能持續釋放藥物維持治療在以往的化療藥物可對病人身體產(chǎn)生一定的副作用有效濃度缺點(diǎn)在于用藥結束后必須手術(shù)去除。對臨床應用缺乏特異性腫瘤學(xué)家正在探索多種治療方法,以提高對腫來(lái)講生物體兼容的、生物學(xué)上可降解的持續釋放裝置更好瘤細胞的特異性?，F有大量的證據表明反義藥物是安全的些?，F有利用腺病毒在體內表達相應的反義核苷酸以達而且在人體腫瘤的動(dòng)物模型中顯示其功效1。而且體內外到治療目的1對較為局限的病灶可局部給藥采用局部實(shí)驗證眀AS○N能特異性扣制腫瘤細胞增殖是治療腫瘤潛注射或局部微滲透泵?，F已研制岀來(lái)的EP-2010是一種在的新型藥物。反義核酸技術(shù)亦應用于心臟、腎移植、延長(cháng)呼吸系統反義寡核苷酸作用于腺苷№2贗體G-蛋白偶同種移植的生存期等臨床治療。而且這項技術(shù)作為聯(lián)受體作為一種氣霧劑直接被輸送到肺12這樣全身不良種基因治療越來(lái)越有效地服務(wù)于藥物開(kāi)發(fā)人類(lèi)的致病反應輕給藥方便,而且肺吸附面積較大,帶有表面活性物菌金葡菌復雜的基因分析通過(guò)反義技術(shù)調節基因的表達取質(zhì)冋促進(jìn)藥物在肺組織的分布在哮喘的治療發(fā)揮重要的得成功提供了一種分析葡萄球菌基因產(chǎn)物的方法這可應作用用于抗生素的開(kāi)發(fā)20。在美國已有10種以上的反義寡核4.3反義寡核苷酸的毒性苷酸作為治療藥物進(jìn)入臨床前期實(shí)驗階段。在基礎研究方反義寡核苷酸的毒性與動(dòng)物種類(lèi)和用藥劑量有關(guān)。腹面已用于研究G-蛋白、磷脂酶((PLC)蛋白激酶C的作腔或皮下給藥與其在體內的分布特點(diǎn)相符有可能分布除用以及與癌癥有關(guān)的功能腦以外的各種組織對腎臟、肝、脾、骨髓等系統器官產(chǎn)生反義核酸技術(shù)對于RNA表達調控有巨大的潛力。近年定的毒性作用大部分ASON最終在網(wǎng)狀內皮系統的器官中來(lái)反義寡核苷酸的生物學(xué)特點(diǎn)、臨床前研究和臨床試驗研積累。因此這些器官既是其發(fā)揮作用的場(chǎng)所同時(shí)有可能究取得了相當的進(jìn)展但這項技術(shù)的成功率不高反義寡核受到侵害。也有報道在小鼠和大鼠中寡核苷酸的毒性與苷酸其作用機制、作用的選擇性、特異的核苷酸序列設計、化序列相關(guān)13對靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物猴的實(shí)驗中寡核苷酸的毒性學(xué)修飾和劑型設計、靶組織的有效給藥方法、有效劑量及安與其化學(xué)修飾相關(guān)13全性等問(wèn)題尚需解決。表達的反義寡核苷酸能有效并長(cháng)期5常見(jiàn)的人工合成的反義寡核苷酸地降低一種基因的表達狙不能區分部分相似序列等一系列問(wèn)題中國煤化工基礎研究及臨床治療提供由于正常結構的反義寡核苷酸片段易被細胞內和體內了廣CNMHG新的途徑大量存在的核酶降解很難達到預期效果通常采用其化學(xué)修飾產(chǎn)物硫代磷酸化反義核苷酸s- oligos)是在磷原參考文獻子上含有一個(gè)硫取代氧的結構具有較強核酸酶抗性能激「1] Walton sp, Stephano∞usGN, Yarmush m,etal.活 Rnaseh從而引起靶降解等特性成為目前反義應用研究Thermodynamic and kinetic中最多的一種修飾寡核苷酸在細胞中具有明顯的抗核酸酶oligodexynucleotide binding to a structured mRNA J ] J大連醫科大學(xué)學(xué)報第25卷Biophys20028x1)366-3(13)3038-3041[2 ]Tamm I, Dorken B Hartmann G. 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It has importment realistic valuleKey words: antisense technology antisense oligoneucleotide EP2-2010H中國煤化工CNMHG