Xenorhabdus nematophila發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

生物數學(xué)學(xué)報2007,22(2):243-250 BiomathematicsXenorhabdus nematophila發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究王永宏張興(西北農林科技大學(xué)無(wú)公害農藥研究服務(wù)中心,陜西楊陵712100)摘要:在分批發(fā)酵中,研究了 Xenorhabdus nematophila YL001的生長(cháng)、基質(zhì)消耗及抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的特性,基于 Logistic方程和 Luedeking- Piret方程,得到了描述分批發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型及模型參數,同時(shí)對實(shí)驗數據與模型進(jìn)行了驗證比較.模型計算值與實(shí)驗數據擬合良好,模型基本反映了 Xenorhabdus nematophila yL001分批發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)特征.分批發(fā)酵中細胞生長(cháng)與產(chǎn)物合成屬于偶聯(lián)型關(guān)鍵詞: Xenorhabdus nematophila;發(fā)酵動(dòng)力學(xué);數學(xué)模型中圖分類(lèi)號:TQ92MR分類(lèi)號:92C40;92C45文獻標識碼:A文章編號:1001-9626(2007)02-0243080引言Xenorhabdus屬細菌與昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng) Steinernema共生,屬腸桿菌科叫.線(xiàn)蟲(chóng)攜帶共生菌通過(guò)氣孔、肛門(mén)、節間膜等自然孔口進(jìn)入昆蟲(chóng)體內,將共生菌釋放到昆蟲(chóng)的血腔中,共生菌在其中大量繁殖,產(chǎn)生毒素和抑菌物質(zhì),使昆蟲(chóng)患敗血癥,一般在48小時(shí)內死亡.共生菌具有多種生物學(xué)功能,在昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)的大規模生產(chǎn)中,共生菌不僅可直接作為線(xiàn)蟲(chóng)的營(yíng)養源,而且可分解寄主組織和培養介質(zhì),為線(xiàn)蟲(chóng)的生長(cháng)、繁殖提供營(yíng)養;共生菌的次生代謝產(chǎn)物具有抑菌2,、殺蟲(chóng)國、殺線(xiàn)蟲(chóng)和抗腫瘤間等多種活性;在醫療衛生和農業(yè)領(lǐng)域具有較大的應用前景和商業(yè)潛力微生物反應動(dòng)力學(xué)包括細胞生長(cháng)動(dòng)力學(xué)、基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)和代謝產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué).通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究和發(fā)酵模型的建立,能更好的認識微生物發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(cháng)和產(chǎn)物形成的機制,以及影響這些機制的一些重要環(huán)境因素,最終實(shí)現發(fā)酵過(guò)程的有效控制,達到提高產(chǎn)物發(fā)酵指標的目的.本文對X. nematophila Yl001的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,并對動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行了模擬1材料與方法11試驗材料(1)供試共生細菌收稿日期:200603-27中國煤化工基金項目:國家863項目“昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)共生菌殺蟲(chóng)、殺菌劑的CN MH GAA241140)作者筒介:王永宏(1968-),男,陜西鳳翔縣人,副教授,博士. E-mail: hwang68@126com*通訊作者生物數學(xué)學(xué)報第22卷昆蟲(chóng)病原線(xiàn)蟲(chóng)共生菌X. nematophila YLool從其寄主線(xiàn)蟲(chóng) Steinernema sp中分離鑒定獲得(2)指示菌蠟狀芽孢桿菌 Bacillus cereus由西北農林科技大學(xué)無(wú)公害農藥研究服務(wù)中心提供(3)培養基斜面及平板培養基:NA培養基,牛肉膏3.0g、蛋白胨50g、營(yíng)養瓊脂20g、水1000ml、pH72~74;共生菌鑒別培養基:NBTA培養基,NA+(TTC0.04g、BTB0.025g);發(fā)酵培養基:葡萄糖6.13g/L、蛋白胨21.29g/L、MgSO41.50g/L、(NH4)2SO4246g/L、KH2PO40.86g/L、K2HPO41.1g/L、Na2SO41.72g/L、水1000ml,pH72~74.12試驗方法(1)共生菌的培養種子培養:將種管保存的X. nematophila yl001,劃線(xiàn)于NA培養基平板上活化,28°C培養24~48h,從生長(cháng)良好的活化平板上挑取單菌落,再劃線(xiàn)于NBTA培養基平板上,28°C培養24~48h,觀(guān)察菌落的顏色變化,區分初生型和次生型共生菌.菌落為藍色,周?chē)囵B基中的染料被吸收變?yōu)辄S色的為初生型;菌落為紅色,周?chē)囵B基中的染料不被吸收而保持藍色的為次生型.用接種環(huán)挑取初生型菌,接種于搖瓶發(fā)酵培養基中,28C、180r/min振蕩培養16h發(fā)酵罐培養:使用鎮江東方生物工程設備技術(shù)公司生產(chǎn)的GUJS-7B型L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐進(jìn)行分批發(fā)酵.發(fā)酵罐容積江L,兩層六平直葉攪拌,三擋板.裝料系數07,接種量9%,發(fā)酵溫度26~28°C,通氣量25L/min,攪拌轉速300rpm,發(fā)酵過(guò)程中流加泡敵消泡(2)發(fā)酵過(guò)程參數檢測OD的測定:取不同時(shí)期的培養液,用分光光度計在600m測定發(fā)酵液OD值DCW的測定:在一定的細胞濃度范圍內,光密度與細胞濃度成正比,因而通過(guò)建立光密度與細胞干重的直線(xiàn)回歸方程來(lái)測定發(fā)酵過(guò)程中的細胞干重(DCW)pH測定:由pH電極在線(xiàn)測定發(fā)酵過(guò)程中的pHDO測定:復膜氧電極在線(xiàn)測定發(fā)酵過(guò)程中的溶解氧DO還原糖測定:采用3,5二硝基水楊酸法(DNS)測定培養過(guò)程中還原糖的變化動(dòng)態(tài)氨基氮測定:采用甲醛滴定法測定培養過(guò)程中氨基氮的變化動(dòng)態(tài)抑菌活性測定:用管碟法測定X. nematophila YL001的抑菌活性.將熔化的NA培養基冷卻至45°C~50°C,加入指示菌(1.5%V/V)搖均,每皿(d=9.0cm)倒入15ml培養基,制好平板后,用打孔器(直徑75mm)在平板上均勻的打三個(gè)孔,每孔內加入1004l共生菌發(fā)酵液無(wú)菌濾液,以培養基為對照,在28°C培養24h,測量抑菌圈直徑x. mematophilaYl001抑菌活性單位定義:在上述測定條件下,1004發(fā)酵濾液抑菌圈直徑為105mm時(shí)定義為1個(gè)活性單位(U),即此發(fā)酵液活性為1m1成1m00/(3)數據處理方法中國煤化工模型參數的優(yōu)化及方程組的求解均利用DPS軟亻CNMHG第2期王永宏等: Xenorhabdus nematophila發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究2結果與分析21江L發(fā)酵罐中X. nematophila YL001的分批發(fā)酵分批發(fā)酵的實(shí)驗結果見(jiàn)圖1.由圖可以看出YL001菌株的細胞生長(cháng)曲線(xiàn)比較明顯.0~6h為生*太義半1長(cháng)遲滯期,063)0為指數生長(cháng)期,細胞生長(cháng)在30達到穩定生長(cháng)期,此后細胞生長(cháng)量基本維持不變,DCW57h達到最大,為1958g/L.從抑菌物質(zhì)活性單位變還原糖14X-PH化曲線(xiàn)圖可以看出,其變化過(guò)程與生物量的變化趨勢非常接近,抑菌物質(zhì)活性單位在48h達到最大,為06121824303642485460667223.2U/ml,此后抑菌物質(zhì)的活性單位下降較慢,保持圖1x. nematophila yloc的分批發(fā)酵曲線(xiàn)在較高水平.從葡萄糖消耗曲線(xiàn)可看出,葡萄糖的利用基本上與細胞生長(cháng)呈影鏡關(guān)系,而從生長(cháng)曲線(xiàn)與活性單位曲線(xiàn)的關(guān)系可以反應出抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生伴隨著(zhù)細胞的生長(cháng),因此預計Xnematophila YL001生產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵類(lèi)型可能屬于生長(cháng)關(guān)聯(lián)型.22動(dòng)力學(xué)模型的建立(1)生長(cháng)動(dòng)力學(xué)描述菌體生長(cháng)最常用的模型為 Monod方程,該模型為典型的決定論均非結構模型,而且最簡(jiǎn)單.它是基于以下假設建立的:(1)菌體生長(cháng)為均衡型非結構式生長(cháng),細胞成分只需要用個(gè)參數即菌體濃度表示即可;(2)培養基中只有一種底物是生長(cháng)限制性底物,其它營(yíng)養成分不影響微生物生長(cháng);(3)將微生物生長(cháng)視為簡(jiǎn)單反應,并假設菌體得率為常數,沒(méi)有動(dòng)態(tài)滯后0.10.顯然(2)、(3)不符合共生菌發(fā)酵的特征,采用 Monod方程有偏差.結合菌體生長(cháng)的特性圖1)和多批次發(fā)酵結果,發(fā)現該菌在發(fā)酵過(guò)程中,在一定發(fā)酵條件下,菌體的生長(cháng)有一最大濃度. Logistic方程可以很好地解釋這一現象Logistic模型是一個(gè)典型的S型曲線(xiàn),能很好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中因菌體濃度的增加對自身生長(cháng)存在的抑制作用,能較好地擬合分批發(fā)酵過(guò)程的菌體生長(cháng)規律dt Amax/I-rdXX(1式中,max:最大比生長(cháng)速率(h-1);X:菌體濃度(g/L);t:時(shí)間(h),當t=to時(shí),X=X0,將(l)式積分得:2)產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型微生物產(chǎn)物形成過(guò)程非常復雜,為便于研究,d之間的關(guān)系,將其分為三種類(lèi)型:(1)相關(guān)模型,是H中國煤化工與細胞生長(cháng)速率CNMHG長(cháng)相關(guān)的過(guò)程,此時(shí)產(chǎn)物通常是基質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物,代謝產(chǎn)物的生成與細胞的生長(cháng)是同步的;(2)部分相關(guān)246生物數學(xué)學(xué)報第22卷模型,該類(lèi)反應的生成與基質(zhì)消耗僅有間接的關(guān)系,在細胞生長(cháng)期內,基本無(wú)產(chǎn)物生成;(3)非相關(guān)模型,產(chǎn)物的生成與細胞的生長(cháng)無(wú)直接聯(lián)系,它的特點(diǎn)是當細胞處于生長(cháng)階段時(shí),并無(wú)產(chǎn)物積累,當細胞生長(cháng)停止時(shí),產(chǎn)物卻大量生成dPdx⊥3x式(3)為 Luedekin-Piret's方程,式中a≠0、B=0可表示I類(lèi)發(fā)酵;a≠0、≠0可表示Ⅱ類(lèi)發(fā)酵;a=0、≠0可表示Ⅲ類(lèi)發(fā)酵,由于 Piret's方程既能反映出伴隨著(zhù)菌體生長(cháng)產(chǎn)物的形成速度,也能反映出獨立于菌體之外,細胞催化底物形成產(chǎn)物的速度.因此, Piret'方程原則上均適用于一般的發(fā)酵過(guò)程通過(guò)共生菌發(fā)酵過(guò)程分析及特征(1)可以看出,抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生與菌體生長(cháng)有直接相關(guān)性,即產(chǎn)物的生成與底物的消耗是直接的關(guān)系.為了進(jìn)一步驗證產(chǎn)物形成與菌體生長(cháng)的關(guān)系,對相關(guān)模型和部分相關(guān)模型均進(jìn)行了分析(1)部分相關(guān)模型dp dX+BX穩態(tài)時(shí),dX=0,x=xnm,則上式可變?yōu)?以t=0時(shí)P=0為初始條件,將式(4)代入式(3),積分后得:P=aXoIn(1-em-ekmaxpma式(⑤5)可寫(xiě)成如下形式:P=aA(t)+BB(t)其中,A(t)=Xo(1umaxXB(t)XAmaxl(1-xm(1-c)式(6)中B可由式(4)得到,mar、Xmax、X0均已知,以(P-BB(t)對A(t)作圖,直線(xiàn)斜率即為a值根據實(shí)驗結果,接種后0~36h是菌體生長(cháng)期,36~72h是抑菌物質(zhì)穩定合成期(圖1)當菌體生長(cháng)處于穩定期時(shí),dX/t=0,X=Xmax中國煤化工,取抑菌物質(zhì)穩定合成期抑菌物質(zhì)的活性單位P對時(shí)間t作圖,利CNMH得到兩者關(guān)系為:P=24436-0.025833,相關(guān)系數R=0505抑函砌質(zhì)根足臺城期御圖物質(zhì)的活性單位P與時(shí)間t無(wú)線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系.因此,不宜用部分相關(guān)模型表示抑菌物質(zhì)的形成規律第2期王永宏等: Xenorhabdus nematophila發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究247(2)相關(guān)模型在相關(guān)模型中產(chǎn)物生成速率與菌體生長(cháng)速率成線(xiàn)性關(guān)系:d dx對式(7)積分可得產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型P= Po+a(X-Xo將式(2)代入式(8)可得XP=a根據相關(guān)模型方程(9),以產(chǎn)物生成速率dP/對菌體生長(cháng)速率dx/t進(jìn)行線(xiàn)性擬合,得到兩者關(guān)系為:P=0.168783+2.0028,相關(guān)系數R=0.9072,由此可見(jiàn),利用相關(guān)模型方程(⑨)對整個(gè)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物生成數據擬合偏差較小,該模型適合用于表示抑菌物質(zhì)生成規律分析過(guò)程也進(jìn)一步驗證了圖1中關(guān)于X. nematophila YL001生產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵類(lèi)型可能屬于生長(cháng)關(guān)聯(lián)型的推論(3)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型在YL001菌株的發(fā)酵過(guò)程中,基質(zhì)(葡萄糖)的消耗主要用于:(1)構成菌體成分;(2)維持菌體生長(cháng)和代謝的需要;(3)合成抑菌物質(zhì).因此,基質(zhì)消耗的方程可表示為:dsdsdtdtdt即ds1 dXdt1 dP+mX(10式中S為基質(zhì)濃度(g/L),X為細胞濃度(g/L),P為抑菌物質(zhì)活性單位U/m),m為細胞的維持系數(1),Yx/s為菌體相對于基質(zhì)的得率系數(g/g),YP/s為抑菌物質(zhì)活性單位相對于基質(zhì)的得率系數(g/g)將式(7)代入式(10)后得dsdXXdtYxISdt(11)P/S式(11)可簡(jiǎn)化為:dsdXdt(12)中國煤化工其中,CNMHG248生物數學(xué)學(xué)報第22卷6P/S穩態(tài)時(shí)=0,X=Xmax,由式(12)得:a})將式(2)代入式(13)后積分得S=So-YXomaxIn(1Amax式(1)、(7)、(12)構成了X. nematophila YL001發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(cháng)、抗菌物質(zhì)形成及基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型,式(2)、(9)、(14)分別為3個(gè)模型的積分形式以上各式描述了發(fā)酵過(guò)程中X. nematophila YL001菌體生長(cháng)及抗菌活性單位的變化規律.23模型求解將上述模型根據實(shí)驗數據在計算機上模擬求解,得到模型中的各個(gè)參數及初始條件見(jiàn)表因此,菌體生長(cháng)動(dòng)力學(xué)模型為:dXds0.1361×(1X18.50733抗菌物質(zhì)產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)模型為.dP=2.0028×ddXdtdX基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型為:-d:=039838×d+043x表1動(dòng)力學(xué)模型參數Table 1 Parameter values in the kinetic models for Xenorhabdus nematophila batch fermentationParametersCalculated data1.83406/Lg/L0.131612.0028U/g細胞0.00443g葡萄糖/(g細胞.b)0318987g葡萄糖/(g細胞)2.4模型的驗證在已知實(shí)驗條件下,進(jìn)行分批發(fā)酵的重復實(shí)驗,中國煤化工合成及底物消耗的變化曲線(xiàn),并對分批發(fā)酵的實(shí)驗值與各動(dòng)力學(xué)模CNMH如圖2,3,4的結果第2期王永宏等: Xenorhabdus nematophila發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究≥實(shí)驗值實(shí)驗值擬合值00612182430364248546066720122436486072圖2菌體生長(cháng)的發(fā)酵實(shí)驗值與模型計算值的比較圖3抑菌物質(zhì)活性單位的實(shí)驗值與模型計算值的比較從圖可以看出,細胞生長(cháng)的實(shí)驗值與模型擬合結果能較好地吻合;在產(chǎn)物合成的擬合中,模型僅能6基本描述抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程.在發(fā)酵前3h能較好5◆實(shí)驗值擬合值地擬合模型抑菌物質(zhì)的實(shí)際產(chǎn)生過(guò)程.但在36h后實(shí)驗值出現了急劇的降低,其原因可能是:抑菌物質(zhì)言2是由多種成分組成,且發(fā)酵是一個(gè)非常復雜的過(guò)程,在抑菌物質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中不僅有合成還有分解,尤其是3648當外界環(huán)境條件不利于抑菌物質(zhì)穩定時(shí),因此,在圖4葡萄糖消耗的橫型值與實(shí)驗值的比較描述抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生時(shí)不能單純地只考慮細胞生物量的情況,還必須考慮抑菌物質(zhì)的組成成分、菌體的自溶和不利的外界條件等對產(chǎn)物分泌的影響;對于底物碳源消耗的擬合過(guò)程,在發(fā)酵前30h過(guò)程中,經(jīng)計算該模型方程與實(shí)驗值偏差在15%以上,在發(fā)酵30h后模型能夠很好地描述實(shí)驗值3討論通過(guò)X. nematophila Y001發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究,擬和出其細胞生長(cháng)、產(chǎn)物形成及基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)方程,能基本反映YL001菌株的發(fā)酵過(guò)程微生物反應過(guò)程非常復雜,該過(guò)程既包括細胞內的生化反應,也包括胞內與胞外的物質(zhì)交換,還包括胞外的物質(zhì)傳遞過(guò)程.要對這樣一個(gè)復雜的體系進(jìn)行精確的描述幾乎是不可能的特別是在分批發(fā)酵過(guò)程中建立機制模型幾乎是不可能.為了工程上的應用,首先要進(jìn)行合理的簡(jiǎn)化,從模型的簡(jiǎn)化考慮一般釆用均衡生長(cháng)的非結構模型,即在細胞的生長(cháng)過(guò)程中,細胞內各種成分均以相同的比例增加,視菌體為單組份,不考慮環(huán)境對菌體組成的影響101.本文建立的模型均基于均衡生長(cháng)的非結構模型假設目前,國內外生化工程學(xué)者所構建的模型大多屬于數學(xué)擬合模型和正規模型,數學(xué)擬合模型應用最為廣泛.其中,數學(xué)擬合模型建模較為簡(jiǎn)便,便于分析驗證,易實(shí)現計算自動(dòng)化.這些模型從本質(zhì)上講是對分批發(fā)酵過(guò)程總體現象和行為的描述,是一種現象模型.從工程角度出發(fā),建立模型是為了更深刻地了解微生物復雜的反中國煤化工到,建立最優(yōu)的操作條件,并為反應器的優(yōu)化和控制服務(wù).一個(gè)好的現NMHG正:(1)模型能夠定量的描述發(fā)酵過(guò)程的變化;(2)主要影響因子的作用能夠在模型甲反映出來(lái).本研究所建250生物數學(xué)學(xué)報第22卷立的動(dòng)力學(xué)模型基本具備以上兩個(gè)特征,能較好的描述X. nematophila Y001發(fā)酵過(guò)程的變化,特別是細胞生長(cháng)模型,但產(chǎn)物生成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)方程的模型預測值與實(shí)驗值有一定的偏離,這可能是由多種原因造成的,如抑菌物質(zhì)的組成成分、菌體的自溶和不利的外界條件等對產(chǎn)物分泌的影響等.因此需要在以后的研究中根據抑菌物質(zhì)的合成、基質(zhì)的消耗規律不斷去修正所建立的動(dòng)力學(xué)模型參考文獻(1 G M, Poinar G O. 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The antibiotics formation is gronLatch cultures withXenorhabdus nematophila YL001中國煤化工Key words: Xenorhabdus nematophila; FermeCN Gematical models