用聚乙二醇修飾大分子藥物的研究進(jìn)展

●696●中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Jourmal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)用聚乙二醇修飾大分子藥物的研究進(jìn)展王俊，裴元英*(復旦大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，.上海 200032)摘要:綜述了近年來(lái)用聚乙二醇修飾大分子藥物的條件、修飾后藥物性質(zhì)的改變及存在的問(wèn)題和解決思路。關(guān)鍵詞:聚乙二醇:修飾:大分子藥物中圖分類(lèi)號: R944.9文獻標識碼: A文章編號: 1001-8255 (2004) 11-0696-06大分子藥物主要包括酶、細胞因子等一些具有于蛋白質(zhì)的二硫鍵和活性中心。Lys占蛋白質(zhì)中所特殊功能的蛋白質(zhì)，作用專(zhuān)一、高效，對人體健有氨基酸總量的10%，且較少參與構成多肽或蛋白康有重要作用。過(guò)去，多肽和蛋白質(zhì)只能從天然物質(zhì)的活性中心。因此，目前PEG通常修飾的位點(diǎn)質(zhì)中提純獲得，隨著(zhù)基因工程的發(fā)展，這個(gè)障礙已是大分子表面Lys殘基上的氨基，包括0x-NH2或ε-基本克服。但此類(lèi)藥物穩定性差、血漿半衰期短、具NH2。Bailon 等(對干擾素-0-2a進(jìn)行PEG修飾，結有免疫原性,使其在生產(chǎn)和應用方面受到極大限制。果表明94%的修飾位點(diǎn)都集中在干擾素的Lys3、1970年代末人們用聚乙二醇(PEG)修飾牛肝過(guò)氧化Lys12I、Lys131、 Lys1344 個(gè)殘基上，其余6%位于氫酶，改善其免疫原性和循環(huán)時(shí)間。1991 年P(guān)EG修Lys70和Lys3.若PEG與位于蛋白質(zhì)活性中心的Lys飾的腺苷脫氨酶面市后，已陸續有PEG修飾的門(mén)冬殘基連接，必然會(huì )影響生物活性，此時(shí)可選擇帶有酰胺酶、干擾素-a-2a和2b經(jīng)FDA批準用于臨床。羧基側鏈的氨基酸殘基為修飾位點(diǎn)，但必須考慮到目前，PEG 修飾技術(shù)正成為大分子藥物傳遞系統研氨基酸自身的交聯(lián)反應。在糖蛋白中糖基上也有一究的熱點(diǎn)之一(1~3]。些修飾位點(diǎn)，如還原性的末端醛基、羥基等，在采用PEG進(jìn)行結構修飾可改善藥物的以下性一些特殊情況下還包括伯氨基、羧基、磷酸基。此質(zhì): (1)增加穩定性: (2) 改善藥動(dòng)學(xué)性質(zhì); (3) 降低外，糖的鄰羥基較易被高碘酸氧化形成具有反應活免疫原性; (4)降低毒性，提高體內活性; (5) 改善.性的縮甲醛基[5]。體內分布。1.2活化的PEG修飾劑1 PEG 修飾的條件PEG末端的醇羥基化學(xué)性質(zhì)不活潑，為保證其1.1藥物的活性反應官能團與藥物活性基團間有適宜的反應速率，需對醇羥基PEG與多肽或蛋白質(zhì)的修飾反應屬于親核反進(jìn)行活化，以利于與蛋白質(zhì)的0-和ε氨基的反應。應。大分子藥物C端的0:-COOH、N端的0-NH2及按PEG與蛋白質(zhì)氨基形成的連接鍵類(lèi)型，活化PEG賴(lài)氨酸(Lys)、門(mén)冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精可分為以下兩大類(lèi)[6]:氨酸(Arg)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、色氨(1)烷基化PEG (alkylating PEGs，通過(guò)烷基鍵酸(Try)、甲硫氨酸(Met)、組氨酸(His)等9種氨連接)，如醛基化PEG (PEG aldehyde)、PEG-三氟基酸的側鏈在- -定的介質(zhì)環(huán)境中較易離子化而呈現乙基磺酸酯(2,2,2-trifluoroethanesulfonyl, PEG-T)親核性，親核活性由大到小依次為: R-S-> R-NH2和環(huán)氧烷基化PEG (PEG epoxide)。醛基化PEG可> R-C00-= R-O -。Cys的巰基是最易被修飾的氨通過(guò)氰基硼烷還原、與R-NH2形成Schiff氏堿得到，基酸殘基，但Cys在蛋白質(zhì)中的總量很少，通常位適中國煤化工大分子藥物。但反應收稿日期: 2003-03-05速率THCNMHG長(cháng)時(shí)間的反應有可能作者簡(jiǎn)介:王俊(1979)， 男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向:藥物新使不想定的蟲(chóng)口庾大活。pH對反應的選擇性有重劑型、新制劑研究。要影響，pH5 左右時(shí)醛基化PEG只與a-NH2反應。裴元英(1943)，女教授，藥物新劑型、新制劑研究。PEG-T是另一種可保持含有正電荷活性中心蛋白質(zhì)Tel: 021-54237186E-n啊內數塘hmu edu.cn活性的PEG修飾劑，但反應專(zhuān)屬性不強、定性困中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)●697. .難。環(huán)氧烷基化PEG的反應速度也較慢，且其開(kāi)作用保護蛋白質(zhì)中易受各種蛋白酶攻擊的區域。環(huán)生成的羥基有可能與蛋白質(zhì)發(fā)生副反應。文獻(9)采用加速振搖試驗評價(jià)了未經(jīng)修飾和采用(2)?；疨EG (acylating PEGs,通過(guò)酰胺鍵連不同分子量的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)修飾的胰島接)，其中大多是羧酸化PEG與N_羥基琥珀酰亞胺素的物理穩定性，以保留50%起始濃度的時(shí)間為表(hydroxysuccimide)所形成的活性酯(PEG-0-X-示樣品物理穩定性的相關(guān)值。結果表明,mPEG與胰COOSu)，目前較常用的是PEG琥珀酰亞胺基琥珀島素的苯丙氨酸B'位點(diǎn)共價(jià)結合產(chǎn)物的物理穩定性酸酯(PEG-succinimidyl succinate, PEG-SS) 和PEG比未修飾的胰島素高36~40倍，且其穩定性隨著(zhù)琥珀酰亞胺基碳酸酯(PEG-succinimidyl carbonate,mPEG分子量的增大而延長(cháng)。Croyle 等[101分別用氰PEG-SC)。研究表明，- _COOSu 基團與PEG連接尿酰氯(cyanuric chloride)活化的mPEG、PEG-SS和的最后--個(gè)烷氧基長(cháng)度對其與氨基或水的反應活性PEG-T，對腺病毒進(jìn)行修飾，置一20、4、25、有顯著(zhù)影響,如PEG-0-CH2-CH2-CH2-COOSu的水解42"C的磷酸鉀緩沖液(pH7.4)中,進(jìn)行為期6個(gè)月的半衰期為23h，而PEG-O-CH2-COOSu僅為0.75h。物理穩定性考察。結果表明，在各試驗條件下，經(jīng)此外，用氯甲酸酯活化的PEG與用琥珀酰亞胺活化mPEG修飾的腺病毒的物理穩定性顯著(zhù)高于未修飾的PEG相比，修飾反應速率低、可控性強，修飾的病毒，其中后兩種活化mPEG修飾的腺病毒在室可具有一定的選擇性:在水相-有機相體系中的反應溫下24h內的效價(jià)幾乎無(wú)損失，有利于腺病毒作為也較容易。病毒載體的使用。Soares 等1分別考察了用分子量2修飾度的測定方法為5000的PEG-SS修飾的門(mén)冬酰胺酶(PEG-L-多肽或蛋白質(zhì)的修飾度指每個(gè)修飾產(chǎn)物上偶聯(lián)asparaginase)對酸、熱、酶的穩定性。結果表明，的PEG分子數?？赏ㄟ^(guò)三硝基苯磺酸法、鐵氰酸經(jīng)PEG修飾后，門(mén)冬酰胺酶的穩定性顯著(zhù)提高。胺法、熒光胺法測定未被修飾的氨基酸殘基的量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)結果顯示，而間接得到蛋白質(zhì)的修飾度。但千擾因素較多，靈pH3.5下PEG-L-門(mén)冬酰胺酶在lh內未發(fā)生變性,保敏度較低[6]。目前常用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)持穩定。將其置65'C、pH6.8的50mmo/L Tris-HCl間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time溶液中，Ih后生物活性仍可保留32%。在體外人of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS) [7]分血清培養試驗中，其生物活性40min內無(wú)改變。離和檢測。通過(guò)得到的分子離子峰及所用修飾劑的3.2藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)改善分子量,就可確定不同產(chǎn)物的修飾度。但由于儀器昂經(jīng)PEG修飾后，許多蛋白質(zhì)在體內的藥物動(dòng)力貴、樣品需前處理，使其應用也受到了一定的限制。學(xué)性質(zhì)都發(fā)生了顯著(zhù)改變，血漿半衰期明顯延長(cháng)，Sartore等8提出了一種 根據氨基酸測定多肽或蛋白腎清除率顯著(zhù)降低。目前認為這種變化主要是基于質(zhì)修飾度的方法。正亮氨酸(Nle)是很少在多肽或以下3點(diǎn): (1)許多經(jīng)靜脈給藥的蛋白質(zhì)很快被網(wǎng)狀蛋白質(zhì)中出現的氨基酸，所以可先合成PEG-Nle-內皮組織(RES)、腎、肝、脾消除，這種消除依OSu,用其修飾蛋白質(zhì)，再用鹽酸水解，通過(guò)測賴(lài)于蛋白質(zhì)分子的大小、電荷及與特定細胞內受體定Nle的含量可計算得出修飾度。的親和力，而用PEG修飾后，上述性質(zhì)均發(fā)生了改3修飾后藥物性質(zhì)的變化變; (2)蛋白質(zhì)易被體內的蛋白水解酶代謝，半衰期3.1穩定性增強和滯留時(shí)間較短，PEG 可利用空間位阻作用減少受某些物理和化學(xué)因素會(huì )改變或破壞蛋白質(zhì)分子水解中國煤化工解: (3) 藥用的非人的空間構象，導致其生物活性的喪失和- - 些理化性源性CHCN MH性，進(jìn)入體內后易質(zhì)的改變。親水性PEG與蛋白質(zhì)共價(jià)結合后，可被免疫系統清除，PEG 的空間位阻作用可掩蔽蛋白使蛋白質(zhì)顆粒表面形成較厚的水化層，阻止其凝質(zhì)上的抗原決定簇，從而減少被免疫系統清除的幾集、沉淀。此外，PEG的柔性鏈可通過(guò)空間位阻率[9,12]?！?98●中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)Pepinsky等(13)采用分子量為20000的乙醛化PEG細胞體外集落形成能力的影響。結果表明，修飾后對重組人干擾素-β-1a進(jìn)行修飾，并以猴、大鼠、細胞表面的CD3、CD4和CD8抗原的相對熒光強度小鼠為模型動(dòng)物，靜脈或皮下注射給藥，考察其體明顯下降，mPEG的濃度越大，遮蔽效果越好。體內藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)。在所有模型中,血漿半衰期平均增加外人干細胞培養試驗表明，用不同濃度mPEG修飾5倍，清除率為原先的1/10， 分布體積明顯減小，的淋巴細胞組培養，形成的粒細胞-巨噬細胞集落可推斷干擾素經(jīng)PEG修飾后減少了在血管外的分形成單位(colony forming unit-granulocyte布。Cohen等[41分別考察了用分子量為5000和20000macrophage, CFU-GM) 數量與對照組無(wú)顯著(zhù)性差的PEG修飾的重組人乙酰膽堿酯酶(rHuAChE)在異，說(shuō)明mPEG修飾后幾乎可完全遮蔽其表面抗原，小鼠體內的藥動(dòng)學(xué)行為。結果表明，PEG 20000-但不影響干/祖細胞在體外的增殖、分化能力。He .rHuAChE(4: 1)組的平均滯留時(shí)間(MRT)是未經(jīng)修等[18]在天花粉(trichosanthin, TCS) 的PEG定位修飾的rHuAChE的50倍，這種顯著(zhù)的改變可能取決飾研究中，采用聚合酶鏈反應制備了S7C、Q219C、于連接到酶上的PEG分子的大小和個(gè)數。此外，K173C和[K173C，Q219C] (KQ)4種TCS的突變PEG-rHuAChE的表觀(guān)分子量與其在體內的MRT有體，分別采用分子量為5000和20000的PEG進(jìn)行修一定的線(xiàn)性關(guān)系。 Li 等[5采用分子量為5000、12000飾，考察PEG-TCS在小鼠體內的免疫原性。結果表20000的PEG-SS修飾重組人腫瘤壞死因子-0明，采用PEG 20000修飾后的所有TCS突變體在小(rHuTNF-ax)。結果表明，其在小鼠體內的半衰期鼠體內誘導的IgG和IgE滴度均顯著(zhù)降低。均顯著(zhù)延長(cháng)，其中PEG 20000-rHuTNF-的半衰期3.4毒性降低， 體內活性增強(24.8h)是未修飾(28.8min)的50倍。Trakas 等[16)采Tsutsumi等[19]首先制備了-種重組的免疫毒用馬來(lái)酰亞胺化PEG (PEG- maleimide)為修飾劑，素，該免疫毒素由兩部分組成:抗人Tac單克隆抗體制備了帶有2個(gè)鼠源性抗乙酰膽堿受體(AchR)主要的單鏈Fv片斷和一段38kD的假單胞菌外毒素免疫原性區域(main immunogentic region, MIR)的單(Pseudomonas exotoxin, PE) 片斷[anti-Tac (Fv)-克隆抗體Fab片段。大鼠體內的藥動(dòng)學(xué)試驗表明，PE38，LMB-2]。 然后對其進(jìn)行PEG定位修飾。結未經(jīng)PEG修飾的Fab片段在3~6h內很快被清除;果表明，修飾后的藥物在小鼠體內的毒性明顯降低，而修飾后半衰期則顯著(zhù)延長(cháng)至30h左右，與AchR的PEG- LMB-2的LDso(3.0mg/kg)是LMB-2的結合能力未發(fā)生顯著(zhù)改變,而免疫原性則顯著(zhù)降低。(0.5mg/kg) 的6倍。此外，PEG-LMB-2 在荷Tac-43.3免疫原性降低腫瘤的小鼠體內的抗腫瘤活性是LMB-2的3倍?，F在臨床上使用的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物大多是非人源Eliason等[20)制 備了PEG修飾的重組人粒細胞集落刺性的，重復給藥后會(huì )在- -定程度上誘導機體產(chǎn)生免激因子(rHuG-CSF)，考察其在獼猴體內的藥物活疫反應，從而影響療效。用PEG修飾能掩蔽蛋白質(zhì)性。結果表明，修飾后藥物的體內活性顯著(zhù)增加,其表面的抗原決定簇，降低免疫原性。中PEG 2000-rHuG-CSF單劑量肌注6d后，血中嗜文獻91采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)評價(jià)了4中性粒細胞水平與rHuG_CSF連續注射6d相當。種PEG修飾的胰島素在小鼠體內的免疫原性和抗原Matousek等(1以荷黑色素瘤的無(wú)胸腺裸鼠為動(dòng)物模性。結果表明，PEG修飾的胰島素與抗IgG抗體的結型，研究經(jīng)PEG修飾的牛胰核糖核酸酶(bovine合能力顯著(zhù)下降，mPEG的分子量為2000時(shí)，修飾pancreatic ribonuclease, RNase A)和牛精液核糖核物的免疫原性幾乎不存在。這為解決胰島素使用中酸醐中國煤化工Ise, BS-RNase) 在裸出現的誘導機體產(chǎn)生變態(tài)反應和抗體介導的內源性鼠仫:TYHCN MH C表明，未經(jīng)修飾時(shí)，胰島素分泌抑制等問(wèn)題提供了良好的解決途徑。張RNase A對腫瘤的生長(cháng)沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的抑制作用，而全等17]采用mPEG修飾臍血淋巴細胞，并觀(guān)察修飾BS-RNase則具有較高的抗腫瘤活性;用PEG修飾后對淋巴細胞表面某些抗原的遮蔽作用及造血干/祖后，RNase A的抗腫瘤活性明顯提高，與BS-RNase中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)_●699●的活性相近。但修飾后兩者的免疫原性基本不變?？赡茏柚沟孜锱c蛋白質(zhì)活性中心的位點(diǎn)結合，從而3.5體內分布改善影響被修飾蛋白的生物活性或與受體結合的能力。由于大多數大分子藥物的分子量在10000~這一缺點(diǎn)大大制約了PEG修飾技術(shù)在大分子藥物中30000內，全身給藥后能通過(guò)腎小球濾去。與PEG的應用，目前各國研究者正在設法解決這一問(wèn)題。結合后，分子量增大，可防止其從腎小球毛細血管4.1.1引入可逆的位點(diǎn)保護基團中滲出，減少在尿中的排泄量。同時(shí)，用PEG修飾可選用一些對于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)有特殊親和力后可提高大分子藥物在體循環(huán)中的穩定性，延長(cháng)在的底物、抑制劑等，在PEG修飾反應前對活性位點(diǎn)體循環(huán)中的滯留時(shí)間，有益于改善藥物的體內分布，進(jìn)行保護，修飾后再脫去保護基團。Caliceti 等[261尤其有利于大分子藥物在具有滲透和滯留增強效應首先將胰蛋白酶(trypsin)抑制劑苯甲脒(benzamidine)(enhanced permeability and retention effect, EPR) 的共價(jià)結合到瓊脂糖凝膠樹(shù)脂上,在適宜的pH和離子腫瘤以及炎癥部位的蓄積(231。強度下，與胰蛋白酶的活性位點(diǎn)結合,再進(jìn)行PEG修鮭降鈣素(salmon calcitonin, sCT)在腎臟中迅速飾反應，最后通過(guò)改變pH將修飾產(chǎn)物從樹(shù)脂上洗脫代謝為無(wú)活性的小片段，占體內總代謝的2/3。Yoo下來(lái)。作者比較了PEG修飾前經(jīng)苯甲脒保護和未保等[24)用分子量為5000的mPEG-SC修飾sCT,采用護的胰蛋白酶的水解活性。結果表明，分別以酪蛋氯胺T法標記PEG-sCT和未經(jīng)修飾的sCT,考察其白和牛血清白蛋白為底物時(shí)，前者的活性為95%和在大鼠體內的分布。結果表明，單-和二-PEG-sCT45%，而后者為28%和0。Tsunoda 等[27)采用可逆(分別表示sCT上連接了1種和2種PEG)在腎臟中的的氨基酸保護劑二甲基馬來(lái)酐(dimethylmaleic分布明顯比未經(jīng)修飾的sCT低，二-PEG-sCT在肝anhydride, DMMAN)在PEG修飾前對腫瘤壞死因臟和脾臟中的分布也顯著(zhù)減少。二-PEG-sCT與sCT子-ax(TNR-a)進(jìn)行保護，結果顯示經(jīng)DMMAN保護的消除半衰期分別為(107.2士32.8)和(59.8土45.2)的PEG-TNF在雌性小鼠體內抗Meth-A纖維素肉瘤min，穩態(tài)分布體積(V.)分別為(229.9士68.3)和的活性是未保護的PEG-TNF的2倍。(603.1土332.3) ml/kg。Caliceti 等[21制備了PEG修4.1.2 選擇合適的PEG類(lèi)型飾的蛋清抗生物素蛋白(egg white avidin)，考察了其目前采用的PEG修飾劑主要有線(xiàn)形和分枝狀兩在荷Erlich實(shí)體瘤小鼠體內的分布。結果表明，PEG大類(lèi)。分枝狀PEG由于其空間位阻效應，只能與易修飾后藥物在肝、腎中的分布顯著(zhù)減少，其中用接近的氨基酸殘基反應，因此可較大程度地保留蛋PEG 20000修飾的藥物在小鼠尾靜脈給藥15min后，白質(zhì)的生物活性。Veronese 等[28]采用分枝狀的肝和腎中的分布僅為原藥的1/8~ 1/7;在腫瘤組織Lys (PEG)2(表示Lys.上連接2種PEG)修飾尿酸酶中的分布明顯增加，用分子量5000、10000、 20000(uricase)，當修飾度為30%時(shí)，修飾產(chǎn)物可保留的PEG修飾的藥物在腫瘤中的分布量分別是4%、5%32%的生物活性。而采用線(xiàn)形的mPEG修飾的產(chǎn)和8%，其中用PEG 20000修飾的在腫瘤中的高蓄物，在修飾度為20%時(shí)，僅保留2.5%的生物活性。積濃度(> 6%)可維持72h。Li 等[15)考察了未修飾4.1.3 PEG欠量的修飾反應(stoichiometric deficiency)和用PEG修飾的rHuTNF a在荷S- 180實(shí)體瘤小鼠體根據蛋白質(zhì)與PEG的化學(xué)計量關(guān)系，在投料時(shí)內的分布。結果顯示，給藥后6h,后者在血液和腫使多肽或蛋白質(zhì)過(guò)量，可使反應主要集中在高親核瘤組織中的蓄積量明顯大于前者，其中PEG 20000-活性的氨基酸殘基上，從而減少活性中心上低反應rHuTNF-a在腫瘤組織的分布量為前者的5倍?；钚灾袊夯ば?。此外，反應后4存在的問(wèn)題與解決思路進(jìn)行DTHCNM H G生物活性，找出生4.1對蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的保護物活性最高的，并進(jìn)行開(kāi)發(fā)。Veronese 等[6]采用PEG可防止蛋白水解酶或抗體對多肽或蛋白質(zhì)PEG欠量的修飾反應，結果只得到了在12、21位某些片段的攻擊，保持大分子藥物的穩定性，但這也單PEG修飾的異構體，其中的一個(gè)修飾產(chǎn)物經(jīng)證實(shí)中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2004, 35(11)具有較高的生物活性。-種新型給藥系統[J].中國藥學(xué)雜志, 2001, 36(5):4.1.4定位修飾技術(shù)292-296.利用不同氨基酸殘基反應活性的差異，控制反[3]姜忠義,高蓉, 許松偉,等藥物蛋白的聚乙二醇修飾[J].應條件使修飾反應只發(fā)生在某些氨基酸殘基上。Cys中國藥學(xué)雜志2002, 37 (6): 409-412.中巰基的親核活性最強，通過(guò)蛋白重組技術(shù)可在蛋[4] Bailon P, Palleroni A, Schaffer CA, et al. Rational design of白的非活性區域引入Cys，可使大部分修飾反應都a potent, long-lasting form of interferon: a 40 kDa branched集中在該氨基酸上,從而起到保護活性中心的作用。polyethylene glycol-conjugated interferon a 2a for the treat-Goodson等[29]通過(guò)重組技術(shù)把Cys殘基引入白介素ment of hepatis C[J]. Bioconjugate Chem, 2001, 12(2): 195-202.(rIL-2)的非活性單糖基化位點(diǎn)，采用馬來(lái)酰亞胺活化的PEG (PEG maleimide)對其進(jìn)行修飾。結果表[5] Veronese FM, Morpurgo M. Bioconjugation in pharmaceuti-cal chemistry[J]. Fammaco, 1999. 54(8): 497-516.明，PEG-Cys-rIL-2 與IL-2具有幾乎相同的生物活[6] Veronese FM. Pepide and protein PEGylation: a review of性，而前者在體循環(huán)中的滯留時(shí)間是后者的4倍。problems and solutions [J]. Biomaterials, 2001, 22 (5): 405-4.2聚乙二醇的原料質(zhì)量(301417.在修飾反應前，需先對PEG末端的醇羥基進(jìn)行[7]蔡 耘基質(zhì)輔助激光解吸附 飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-活化。為避免在修飾過(guò)程中發(fā)生交聯(lián)和團聚,常采用MS)在生物工程產(chǎn)品質(zhì)量控制中的應用[].生物工程進(jìn)展,mPEG作為修飾劑的合成原料。不同的聚合工藝和1996, 14(4): 23-25.不同來(lái)源的mPEG的分散性不同，mPEG的分散性[8] Sartore L, Caliceti P, Schiavon 0, et al. Accurate evaluation高，修飾物的均- -性難以保證。因此,建議先通過(guò)質(zhì)method of the polymer content in monomethoxy (polyethylene譜或凝膠過(guò)濾色譜分析確定出不同來(lái)源的mPEG聚glycol) moified proteins based on amino acid analysis[I].合物的分布寬度指數Mw/M.的值，據此選購mPEGAppl Biochem Biotechnol, 1991, 31 (3): 213-221.原料。另外，由于聚合過(guò)程中少量水的存在，mPEG[9] Hinds KD,Kim SW. Effects of PEG conjugation on insulin產(chǎn)品中有1% ~ 15%的PEG二醇(OH-PEG PEG-OH)propertiesl[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(4): 505-530.雜質(zhì)。其含量取決于mPEG的分子量，分子量越小，[10] Croyle MA, YuQC, Wilson JM. Development of a rapid method二醇的含量越低。二醇在mPEG的活化過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生for the PEGylation of adenoviruses with enhanced transduc-交聯(lián)或團聚。若mPEG產(chǎn)品中存在二醇，凝膠過(guò)濾tion and improved stability under harsh storage conditions[J].Hum Gene Ther, 2000, 11(12): 1713-1722.色譜圖譜上就會(huì )出現一個(gè)位于主峰前的小峰，分子量恰好是mPEG的2倍;通過(guò)峰面積可確定相應的[11] Soares AL, Guimaraes GM, Polakiewicz B, et al. Effects ofpolyethylene glycol atachment on physicochemical and bio-二醇含量。logical stability of E. coli L-asparaginase[J]. Int J Pharm,5結語(yǔ)2002, 237(1-2): 163-170.PEG修飾技術(shù)近年來(lái)發(fā)展較快，除用于修飾多12] 成軍.長(cháng)效干擾素治療慢性丙型肝炎的效果評價(jià)[J].國肽和蛋白質(zhì)以外，也用于核酸、脂質(zhì)體、納米粒等的外醫學(xué)一-流行病學(xué)傳 染病學(xué)分冊, 2001, 28(2): 60-63.修飾。隨著(zhù)新的修飾劑和修飾技術(shù)的研究,將會(huì )極大[13] Pepinsky RB, Lepage DI, Gill A, er al. Improved pharmnacoki-地促進(jìn)大分子藥物的臨床應用。netic properties of a polyethylene glycol-modified form ofinterferon-B-Ia with preserved in vitro bioactivity[J]. J參考文獻:中國煤化工3): 1059-1066.6[1Veronese FM, Harris JM. Introduction and overview of.MHCN M H G.eral Efce of cemicalpeptide and protein pegylation[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2002,modification of recombinant human acetylcholinesterase by54(4): 453-456.polyethylene glycol on its circulatory longevity[J]. 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