脂質(zhì)分析進(jìn)展

2002年第4期.糧食與油脂39文章編號: 1008-9578(2002)04- -039--03脂質(zhì)分析進(jìn)展Development in Lipids Analysis喬國平王興國孫冀平胡學(xué)煙(江南大學(xué)食品學(xué)院， 無(wú)錫214036)摘要概述近年來(lái)脂質(zhì)分析方法最新進(jìn)展，簡(jiǎn)要介紹微波輔助提取法、超臨界CO,提取法在脂質(zhì)舍量測定方面的應用及原位脂肪酸甲酯合咸法在簡(jiǎn)化脂質(zhì)分析中的應用。關(guān)鍵詞脂質(zhì)分析徵波法超臨界CO, 法原位脂肪酸甲酯合威法中圖分類(lèi)號: TQ646文獻標識碼: A近年來(lái),因脂肪酸營(yíng)養特性和健康方面的影響,對脂肪可以對樣品一溶劑混合物進(jìn)行選擇性加熱,使得脂質(zhì)在提取酸進(jìn)行快速準確的分析就變得越來(lái)越重要。一般講，脂肪總過(guò)程中受到不利條件的影響要比傳統的加熱方式要小。另量要用索氏(Soxhlet)抽提器測量，而脂肪酸主要是通過(guò)氣外,微波技術(shù)也可應用于脂肪酸甲南的合成(4)和脂肪酸原位相色譜法(GC)來(lái)測定。因脂肪酸的沸點(diǎn)較高，進(jìn)行色譜分衍生化[5),加速反應速度,提高反應效率。析時(shí)，要將脂肪酸轉化成脂肪酸甲酯、異丙酯或丁南,而其中到現在為止,對微波輔助脂質(zhì)提取雖然只有少量的研究又以脂肪酸甲嘴的沸點(diǎn)較低,在色譜圖中所產(chǎn)生的峰形也較報告,但是對微波技術(shù)在分離有機化合物方面的廣泛深入的突出,所以在分析生物體組織或食品中的脂肪含量和脂肪酸應用和其明顯的效果正日益受到人們的關(guān)注,與之相關(guān)的微組成時(shí)經(jīng)常進(jìn)行的是脂肪酸的甲酯化。在進(jìn)行脂肪酸甲酯波脂質(zhì)提取設備也會(huì )不斷在實(shí)踐中得到應用?；瘯r(shí),為了避免干擾,常常要將脂質(zhì)用有機溶劑從樣品中提1.2超臨界二氧化碳流體提取取出來(lái),然后在催化劑作用下使脂質(zhì)衍生化而生成胎肪酸甲利用有機溶劑提取法對各種含脂肪樣品進(jìn)行脂肪含量酯,再用GC法測定脂肪酸組成。整個(gè)過(guò)程時(shí)間長(cháng)，且費用測定時(shí)，因為- 些脂寤性色素、蠟質(zhì)和膠質(zhì)也溶于非極性溶很商。此外,索氏脂肪測定法只能測定樣品中的粗脂肪含劑而被同時(shí)提取出來(lái)，因此傳統的索氏抽提法只能測定粗脂量,不能對脂肪含量進(jìn)行準確定量。因此,許多研究工作者肪的含量,而不能夠準確測定樣品中脂肪的含量。而且,使-直在尋求一種快捷、簡(jiǎn)單的方法來(lái)代替傳統的方法。近年用傳統的方法測定脂肪時(shí)，還要消耗大量揮發(fā)性溶劑，會(huì )造來(lái),出現了與這種需求相適應的幾種新的提取方法和脂肪酸成環(huán)境污染并對操作人員的健康構成威脅,整個(gè)實(shí)驗時(shí)間很測定方法，如徼波輔助提取法和超臨界流體提取(SFE)法，長(cháng),消耗能量高。近來(lái)，有研究工作者已開(kāi)始嘗試使用越臨以及脂肪酸原位(in situ)脂肪酸甲酯合成技術(shù)等。界流體提取技術(shù)進(jìn)行脂質(zhì)的定分析，可以避免使用有毒的1提取新技術(shù)有機幫劑，減少實(shí)驗操作時(shí)間,提高效率。而在此之前,超臨1.1微波輔助脂質(zhì)提取界流體技術(shù)只用于大批量的脂質(zhì)提取。在進(jìn)行超臨界流體近來(lái)已有關(guān)于微波技術(shù)用于脂質(zhì)提取的報道。利用微萃取過(guò)程中使用最多的是超臨界CO2。波技術(shù)可以發(fā)展-種快捷、安全、代價(jià)低的方法來(lái)進(jìn)行各種有研究工作者已經(jīng)將超臨界流體提取與傳統的方法進(jìn)行生物質(zhì)的脂肪含量測定，而且,所處理的樣品還可以不受水比較。Frod(6)等對幾種油料種子、 牛肉和幾種焙烤食品中的分的干擾(u,這使樣品的預處理變得更簡(jiǎn)單,也避免了脂質(zhì)脂肪含量用超臨界二氧化碳進(jìn)行測定,每份樣品重1克,操作在進(jìn)行高溫干燥時(shí)氧化和變質(zhì)。壓力9,000 psi,溫度100C,流速2L/分鐘,在穩定后萃取25最初關(guān)于利用微波技術(shù)對脂質(zhì)提取進(jìn)行可行性研究出現分鐘。然后再將所得到的脂肪進(jìn)行甲酯化,用GC法測定脂在二十世紀八+年代,Ganzier2)等用微波輔助對油料種籽、肪酸含量。最后對超臨界流體直接所得脂肪質(zhì)量、GC法換算食品飼料和土壤中的脂肪含量進(jìn)行測定，在操作中,他們將的脂肪含量以及傳統的方法所得結果進(jìn)行比較，得到了滿(mǎn)意一定量的溶劑和樣品混合后,用微波對樣品進(jìn)行30秒輻射處的結論。Sot(]等人對幾種油料種籽在1000psi壓力理(在處理過(guò)程中避免溶劑拂騰) ,冷卻后再進(jìn)行處理，重復幾80C下用超臨界流體處理3.0~3.5克樣品,將所得脂肪含量次。然后進(jìn)行離心分離,上清液揮千溶劑，并將所得脂肪用氣與索氏抽提法測定的脂肪含量進(jìn)行比較,得到了滿(mǎn)意的結果。相色譜柱檢測脂肪酸組成，證明比傳統方法的效率要高很多。Dionisl[8]等對奶粉、牛奶巧克力等含脂食品中脂質(zhì)利用超臨近來(lái),隨此項技術(shù)的不斷發(fā)展，出現了-些使用少量溶劑進(jìn)行界CO2進(jìn)行萃取,回收率達到98.4%,并對所得脂肪進(jìn)行脂微波輔助提取的設備。Lerayl3等 用此設備對生物組織中的肪酸組成分析，與傳統的方法相比沒(méi)有明顯差別。對于超臨各種脂質(zhì)進(jìn)行了定性和定量分析,并與傳統的方法進(jìn)行比較，界流體進(jìn)行脂質(zhì)萃取的研究還有相當多的報道(9.0],都對這種證明用此方法不但使用的溶劑量很少,所用時(shí)間短,而且所得新技術(shù)可行性進(jìn)行大量k研究工作。脂質(zhì)與傳統的方法所得相比并沒(méi)有區別。超臨界流體進(jìn)行脂質(zhì)萃取時(shí)，為了得到滿(mǎn)意的結果,應雖然用徼波處理樣品時(shí)也會(huì )引起脂質(zhì)的氧化和脂肪酸中國煤化工就是溫度和壓力,因為含量的變化,但在通常條件下這種變化是很小的,而且與傳它YH另外,只使用超臨界.統方法所引起的同樣的變化要小得多。這主要是因為微波cd.C.N M H G份的提取有很好的效收稿日期: 2002-02-084(糧食與油脂2002年第4期果,但對于非極性脂質(zhì)萃取效果很差。因此對于含有-定量果是對已提取出來(lái)的脂肪進(jìn)行甲酯化,則不必考慮水的影響。非極性朋質(zhì)的樣品(如牛奶)就不大適用。為了提高非極性但采用原位法直接對樣品進(jìn)行脂質(zhì)的酯交換，樣品是不可能完脂質(zhì)的回收率,可以在超臨界流體中添加少量的甲醇、乙醇，全脫水的。在水份達到-定量時(shí)，甘三酯很容易從單一相中分甚至是水作為挾帶劑。Monanil)等利用兩步萃取法(超離出來(lái)，從而減緩反應，甚至中止反應繼續下去。Austin[14)臨界CO2.超臨界CO2/乙醇混合流體)對大豆進(jìn)行脂肪和等人對大豆粕等多種含油樣品進(jìn)行分析時(shí)，采用已烷作溶磷脂的分別提取,結果發(fā)現極性較強的磷脂選撣性地溶于超劑，堿性催化劑處理I0mg樣品,80"C下加熱10分鐘完成臨界CO2/乙醇混合流體中。此外,樣品的粉碎程度和含水脂質(zhì)的衍生化。樣品中水份達到10%時(shí),甲酯化幾乎已經(jīng)量也應考慮在內。不能發(fā)生，而在8%時(shí)影響不大。Franz1)用 酸性催化劑，超臨界流體萃取技術(shù)可以在很多方面取代傳統的脂肪含甲苯為溶劑對含脂肪10~50mg的食品樣品進(jìn)行原位酯交量測定方法,但還存在者操作設備昂貴對非脂質(zhì)成份(例如換反應，加入100 mg水對實(shí)驗結果影響不大。因此，在進(jìn)水)的萃取,以及在某些情況下對脂肪提取不完全等缺點(diǎn),因此行酯交換反應時(shí)，必須考慮到對實(shí)驗結果有影響的各種因.對于操作時(shí)的條件還應該不斷優(yōu)化，以能得到滿(mǎn)意的結果。素,而且溶劑的選擇與催化劑的種類(lèi)也有-定的關(guān)系。2原位(in situ)脂肪酸甲酯合成2.2 催化劑選擇對于各種含油物質(zhì)的脂肪酸組成分析,-般的方法是進(jìn)行原位脂質(zhì)衍生化所用的催化劑,與傳統甲酯化反應先用有機溶劑將脂肪萃取出來(lái),然后在催化劑作用下進(jìn)行使用的相類(lèi)似,包括重氮甲烷酸性催化劑(HCIHSO,脂肪酸的衍生化得到脂肪酸甲酯,最后用GC法測定脂肪BF;)和堿性催化劑NaOCH,NeOH和KOH)等。重氮甲酸組成和含量。這種傳統的方法需要大量的溶劑，操作繁烷是一種高效、快速的酯交換催化劑,但因操作條件苛刻、使瑣,所用時(shí)間很長(cháng)，效率不高。因此,研究工作者一直在尋用壽命短而不被廣泛采用。在實(shí)際操作中常使用的是酸或求一種簡(jiǎn)便、易行的方法進(jìn)行脂質(zhì)的分析,其中最有成效的堿性催化劑。就是脂肪酸甲南的原位(in siu)合成法?！霸弧?合成法，2.2.1堿性催化劑是0uen[1]等人于1976 年提出來(lái)的，即不進(jìn)行脂質(zhì)的提堿基催化反應速度快，條件襤和,在室溫下即可發(fā)生反取過(guò)程，而是直接對樣品用少量的有機溶劑和催化劑處理應,對-些酸不穩定脂肪酸(如含有環(huán)丙烯、環(huán)氧基等基團，進(jìn)行酯交換,所以又稱(chēng)為一步萃取- 酯交換法。對祥晶中以及含共軛不飽和鍵結構)尤其適用。但堿性催化劑也有其脂質(zhì)的提取、酯交換同時(shí)進(jìn)行,大大縮短了實(shí)驗時(shí)間,減少缺點(diǎn):游高脂肪酸不會(huì )或很少量參加酗化反應;酯化時(shí)會(huì )發(fā)了有機溶劑的用量,也因為操作過(guò)程少而減少了實(shí)驗誤差。生皂化反應等。原位法與一般的脂質(zhì)分析過(guò)程需要3~s克相比，使用的樣堿基催化反應使用的有機溶劑通常為正已烷、石油醚和品量也大大減少，只需要幾十毫克[13]。因此利用原位法進(jìn)二氧雜環(huán)已烷。而使用最多的堿性催化劑為甲醇鈉的甲醇行脂肪酸和脂質(zhì)分析,不但可以分析各種含脂物質(zhì),也可對溶液，其制法是將金屬鈉投入無(wú)水甲醇中即可得到。此試劑在TLC法分離脂質(zhì)過(guò)程中從展開(kāi)板上刮下的硅膠中所含可以存放幾個(gè)月。Austin4 等使用甲醇鈉和己烷對谷物和脂質(zhì)進(jìn)行分析。乳制品中脂質(zhì)進(jìn)行分析,結果與AOAC官方方法相符合。.對于脂質(zhì)的衍生化，包括脂肪酸的甲酯化和甘三酯的酯Dennis[10]等也使用類(lèi)似的溶劑對嬰兒奶粉中的脂質(zhì)進(jìn)行原交換兩個(gè)過(guò)程:位脂肪酸甲酯化,同樣得到滿(mǎn)意的結果。除了NaOCH,外,還有其它-些有機類(lèi)堿性催化劑,如R'-C0-0H+ CH,-0H回p'-CO-0CH。+ HOH四甲基胍鹽(TMG)和氫氧化四甲胺就是比較常用的試劑。R'- co-OR" +CH-OH"威0C*R'-CO-0CH.+R" OH此類(lèi)有機堿催化劑不但可以進(jìn)行甘三南的雕交換甲酯化反應,也可以同游離脂肪酸發(fā)生反應，彌補了NaOCH,不足。脂肪酸只能在酸性催化劑和重氨甲烷作用下進(jìn)行酯化Schuchard(1]等人使用TMG對游離脂肪酸含f達6.7%的反應，而甘三酯則可在酸性、堿性和重氮甲烷作用下進(jìn)行酯脫膠油進(jìn)行甲酯化,其甲雕化程度可以達到99%。馬亭[18)交換。對于天然存在的生物物質(zhì)中的脂質(zhì),脂肪酸-般以甘等人用氫氧化四甲胺1甲醇作為繼化劑和反應試劑分析魚(yú)三酯或磷脂的形式存在，因此對于脂肪酸甲甯的合成主要指油中的脂肪酸組成,并使游高脂肪釀轉化為氫氧化四甲胺的的是酯交換過(guò)程。脂肪酸鹽,后者在氣相色譜的進(jìn)樣室內受熱裂解而生成相應在進(jìn)行“原位”脂肪酸甲酯合成時(shí)需要注意兩點(diǎn):脂質(zhì)的脂肪酸甲酯,經(jīng)處理后的樣品直接用于GC/MS和GC分的痦解性(應該溶解迅速、反應完全)和防止水和其它化合物析,得到滿(mǎn)意結果。的干擾。因此， 必須根據樣品的性質(zhì)決定使用何種落劑,是2.2.2酸性催化劑否要進(jìn)行干燥，以及選擇何種催化劑等。因為酸性催化劑可以將注射脂肪酸和結合脂肪酸同時(shí)2.1溶劑選擇進(jìn)行催化而得到廣泛應用，但是與堿性催化劑相比，反應時(shí)進(jìn)行原位脂肪酸甲酯的合成,需要選用合適的溶劑，此溶需要加熱(50~100C),且反應時(shí)間長(cháng)(1~2小時(shí))。另外, .劑對脂質(zhì)(特別是不易溶于甲氧基催化劑中的非極性脂質(zhì))有中國煤化工圖中月桂酸甲酯后會(huì )很好的溶解性，使甲醇、脂質(zhì)和其它試劑形成完全互溶的狀出現YHCNMHG; NMR確定此蜂為r-態(tài)。如果樣品中存在-定量的水份,必須考慮水的影響。如2002年第4期糧食與油脂41HOCH2 ,0.H'MeOH,CH;HzCγ-戊酮酸甲酯峰的出現會(huì )使測定值偏高，但在高脂肪、lyical Supereitial Fluid Extraction [U]. J. AOCS, 1993, 70低糖分樣品中影響較小。(4): 437-439.酸性催化反應使用的溶劑有已烷四氫呋喃、苯甲苯和[8] F. Dionisl el. Supercritical CO, Extracion for Total Fat Ana-氟仿等(2),其中效果最好的是苯,但因為苯有毒,所以一般傾，lysis of Food Products [印J. Food Sci. 999 64(4); 612--615.向于使用甲苯。常用的酸性?xún)敾瘎镠CI.H2SO.,BF, 的甲[9] Peter et. Comparison of Supercritical Carbon Dioxide and醇溶液。由于酸性倦化反應使用的溶劑、催化劑種類(lèi)、反應條Soxhlet Extraction of Lipids from a Browm Scaweed, Sar-件(溫度、加熱時(shí)間)等各不相同,得到的結果也不盡相同。gassaon hemipyllum (Turn.) C. Ag J. Agr. Food Chem.Fran{[5]用HC1- CH2OH 作催化劑,以甲苯取代苯作溶劑，1998, 46: 4228- -4232.分析食品中所含脂質(zhì)時(shí),所得結果與傳統的酸解- -乙醚萃取[10] s. P. J. Brooks et. Measuring Total Lipid Conent in Rat方法相比偏高,但比氯仿-甲醇提取法所得結果要低。KeCarcasses: A Comparison of CommonlyEmployed Extract-vinf[1]等用H:SO.- -CH2OH 對葵花籽進(jìn)行原位甲南化,在甲ion Methods []. J. Agr. Food Chem. 1998, 46. 4214- -4217.醇佛點(diǎn)溫度下反應4小時(shí)，所得結果要比己烷提取法為高。(11] Luigi Moitanari et. Selecive Extraction of Phospholipid使用原位法進(jìn)行脂質(zhì)的酯交換,只要選擇合適的催化Mixtures by Ssupereritical Carben Dioxide and Cosolvents劑，反應條件恰當(含水量、溫度、樣品量、使用的非極性溶[小. J. Food Sci. 1996, 61(6); 1230-1233.劑),理論上得到的定性與定量結果與傳統的方法相比不會(huì )(12] Outen t. Diret Methylation of Long Chain Fatty Acids in有明顯的差別。而且由于原位合成脂肪酸甲酯操作過(guò)程簡(jiǎn)Feeds, Digesta and Fecs Without Prior Extration ([], J.單，在反應過(guò)程中也沒(méi)有加入不利的實(shí)驗操作，實(shí)驗誤差就Sci. Food Agr. 1976, 27: 419-425.要小得多,所得結果應該比傳統的方法更準確。實(shí)際上由于[13) M. Sonichsen, B. w. Mulr. A Rapid and Quantitarive祥品中往往含有一定的水分,或是有些脂質(zhì)與樣品結合的Method for Total Fatty Acid Analysis of Fungi and Other比較牢固而不能完全反應,為了得到準確、可信的結果,需要Biological Samples [0 Lipids. 199, 34(12): 1347-1349.對樣品進(jìn)行預處理。但總的來(lái)說(shuō),脂質(zhì)的原位合成法對大多[4] Austin R Long, Rapid Direcl Extraction Derivatizaton Mc數樣品來(lái)說(shuō)都是可行的。thod for the Detcrmination of Acylgycerol Lipids in Selected參考文獻Sarmple Matrices []. J. Food Sai. 1988, 53(3): 940- 942.[1] J. R. Jocelyn Pare et. 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