生物轉化淀粉產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展

長(cháng)江大學(xué)學(xué)報(自科版)農學(xué)卷2007年3月第4卷第1期Journal of Yangtze University( Nat Sci Edit) Agri Sci V Mar 2007, Vol 4 No. 1生物轉化淀粉產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展張橋(貴州大學(xué)貴州省生化工程中心貴州賈陽(yáng)55002江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)周禮紅,康冀川(實(shí)州大學(xué)州省生化工程中心貴州貴陽(yáng)550025)摘要]淀粉是可再生的有機資源。利用微生物將淀粉轉化為燃料乙醇,已成為現今發(fā)酵工程的研究熱點(diǎn)之。綜述了淀粉發(fā)酵工藝流程中原料預處理、淀粉水解和發(fā)酵3個(gè)主要階段的研究概況及存在的問(wèn)題[關(guān)鍵詞]淀粉;生物轉化;燃料乙醇;工藝流程[中圖分類(lèi)號]Q815[文獻標識碼]A[文章編號]1673-1409(2007)01-S088-04近年來(lái)的能源危機和環(huán)境惡化引起世界各國高度重視,尋找替代石油的燃料已成為全球日益緊迫的課題口。燃料乙醇因清潔便捷和可再生,是最有發(fā)展前景的液體燃料,被納入許多國家的發(fā)展戰略規劃,將其部分或全部代替汽油作汽車(chē)燃料己成為世界范圍的一種趨勢得到各國政府的支持和鼓勵。通過(guò)適當預處理,任何類(lèi)型的生物質(zhì)都可以作為酒精發(fā)酵的底物。美國能源部在1993年和1997年的2次規劃中都將生物能源( Bioenergy)作為重點(diǎn)發(fā)展方向,并預測2010年生物能源將占整個(gè)能源市場(chǎng)的50%。20世紀70年代始,巴西經(jīng)過(guò)30年的努力,乙醇燃料已得到廣泛應用,直至2002年,巴西乙醇替代汽油的比率接近50%。歐盟在2000年11月提出了清潔能源“綠皮書(shū)”,又于2002年4月啟動(dòng)了“歐洲聰明能源計劃”,計劃2010年生物能源至少達到12%以上3。我國也在“十五”規劃中將開(kāi)發(fā)生物能源擺在了重要位置,并通過(guò)試點(diǎn)已初步實(shí)現汽油中添加10%燃料乙醇的目標燃料乙醇是一種“生長(cháng)出來(lái)的綠色能源”可以用含淀粉(玉米、小麥、和薯類(lèi)等)、纖維素(秸稈、林木等)或糖質(zhì)(甘蔗、糖蜜等)等原料經(jīng)發(fā)酵蒸餾而制成。我國淀粉資源豐富,年產(chǎn)玉米至少1.2億t,小麥1.0億t左右,薯類(lèi)0.35億t,它們都是可再生的有機資源,將其生物轉化( Biotransformation)為燃料乙醇,可以緩解日益增長(cháng)的能源問(wèn)題。國內外已有大量關(guān)于淀粉產(chǎn)酒精的研究報告,并初步建立了相關(guān)的產(chǎn)業(yè)鏈。目前,美國以淀粉質(zhì)原料為基質(zhì)生產(chǎn)的最終酒精濃度可達到95g/dL,而我國大部分的酒精廠(chǎng)則在60~80g/dL之間15。然而傳統酒精發(fā)酵工藝存在原料轉化率不高、產(chǎn)生的酒糟和廢水對環(huán)境造成一定程度的污染,并給酒精生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)較大的酒糟后處理壓力等問(wèn)題。這給科研工作者今后如何充分利用生物質(zhì)能( Biomass energy)提出了新的課題和研究方向。目前已有一些成果得以應用,如雙酶法糖化門(mén)等,但有些成果的應用卻受料液帶渣所擾,如各種固定化發(fā)酵技術(shù)、差壓精餾技術(shù)等[。筆者從生物學(xué)的角度,以其工藝流程為線(xiàn)綜述了淀粉生產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展。淀粉原料的預處理玉米、小麥和薯類(lèi)是富含淀粉的經(jīng)濟農作物,這些原料中除富含淀粉外,還含有蛋白質(zhì)、纖維和果膠類(lèi)物質(zhì)。Wu等對不同基質(zhì)進(jìn)行研究后指出,不同組分的含量對酒精轉化效率存在明顯的影響,尤其是當直鏈淀粉含量高于35%時(shí),酒精的轉化效率非常高,而蛋白質(zhì)和纖維含量的變化對酒精轉化效率的影響小?？梢?jiàn)直鏈淀粉含量高的原料品種是酒精發(fā)酵工業(yè)中所需要的,以玉米淀粉作原料生產(chǎn)酒精是目前美國和歐洲等國廣泛使用的方法對淀粉原料進(jìn)行預處理是為了提高淀粉的酶水解糖化交H中國煤化工法(機械研磨、超CNMHG[收稿日期]2006-09-11[第一作者籬介]張析(1971-),男,斕北用州市人,碩士研究生,長(cháng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院師,從事微生物分子系統學(xué)研究[通訊作者]康翼川l, E-mail jchuank@ yahoo..co.uk.第4卷第1期張橋等:生物轉化淀粉產(chǎn)燃料乙醇的研究進(jìn)展微粉碎等)。預處理是否適當,對水解糖化效果和淀粉轉化率會(huì )產(chǎn)生直接或間接的影響。俄羅斯酒精工業(yè)開(kāi)發(fā)設計的一種機械渦流均質(zhì)機似乎對降低體系的粘度和保證均質(zhì)性,提高轉化率起到了一定的作用。 Liimatainen等「研究指出,馬鈴薯帶皮和不帶皮的加工處理對酒精產(chǎn)量和質(zhì)量有影響。 Shauck等2比較了玉米的干法脫胚脫皮和濕法研磨粉漿的處理工藝,認為濕法研磨粉漿胚芽分離完全、淀粉損失少、淀粉出酒率高可達到53.9%~54.2%但缺點(diǎn)是設備投入較大,需要建一個(gè)不干燥的淀粉車(chē)原料還可以通過(guò)化學(xué)、物理化學(xué)等方法處理。但無(wú)論采用何種方法,都要達到提高酶的水解率,減少碳水化合物的損失,降低對水解及發(fā)酵過(guò)程起抑制作用的副產(chǎn)物的過(guò)度產(chǎn)生,以及工藝流程的性?xún)r(jià)比要高等幾個(gè)方面的優(yōu)化結果。淀粉水解乙醇發(fā)酵微生物如釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)和運動(dòng)發(fā)酵單孢菌( Zymomonas mobilis),缺乏淀粉水解酶不能直接轉化淀粉為乙醇,必須在發(fā)酵之前將淀粉水解為乙醇發(fā)酵微生物可以利用的糖類(lèi)。目前對酶法水解和微生物水解研究較多2.1雙酶法直接水解淀粉原料生產(chǎn)酒精一般要經(jīng)過(guò)液化( Liquefaction)和糖化( Saccharification)過(guò)程,傳統液化方式主要通過(guò)高溫蒸煮來(lái)完成,這種方式不僅能耗高,而且液化效果也欠佳,在一定程度上影響了原料的轉化率。近年來(lái),隨著(zhù)酶制劑行業(yè)的發(fā)展,加酶液化技術(shù)已廣泛應用于淀粉水解口,并已取得了很好的效果。雙酶法糖化是淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精的重要前期處理步驟,即中溫蒸煮時(shí)加入a淀粉酶糖化時(shí)加入糖化酶,蒸煮目的是使顆粒狀態(tài)的淀粉變?yōu)楹癄顟B(tài)的淀粉,而糖化的目的則是要把糊化狀態(tài)的淀粉轉化為酵母能夠發(fā)酵的糖類(lèi)。但雙酶法糖化醪制備十分費時(shí),同時(shí)由于糖化酶的逆合作用和糖化酶制劑中所含葡萄糖苷轉移酶的作用,不可避免地會(huì )產(chǎn)生異麥芽糖和潘糖等非發(fā)酵性糖1,從而影響到淀粉的利用率,而且還要考慮體系溫度、pH作用時(shí)間、酶用量和原料成分等因素對水解率的影響當前利用淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精,其高成本主要有2個(gè)原因:一是酵母菌不能直接利用淀粉,需要使用酶;再者就是淀粉質(zhì)原料需要蒸煮。雖然采用低溫蒸煮或非蒸煮發(fā)酵使能耗降低50%16,但添加大量酶以獲得可發(fā)酵的糖是必須的。因而面對高運作成本的問(wèn)題,對于如何通過(guò)糖化工藝的改善有效降低酒精的生產(chǎn)成本顯得尤為重要。2.2微生物水解采用商業(yè)糖化酶水解淀粉原料生產(chǎn)酒精時(shí)成本較高,而將糖化菌與酒精生產(chǎn)菌混合培養于合適的條件下,同步糖化發(fā)酵淀粉生產(chǎn)酒精,不僅可以省去糖化工序,更重要的是能解除淀粉水解產(chǎn)物對糖化的反饋抑制作用1。能產(chǎn)生葡萄糖淀粉酶的微生物21主要有根霉( Rhizopus sp.)、黑曲霉( Aspergillus niger)、泡盛曲霉( Aspergillus awamori)、扣囊擬內孢霉( Endomyco psis fibuligera)、枯草芽孢桿菌( Bacil-lus subtilis)等,但目前主要用的菌種是A. niger和Rh,sp.產(chǎn)生的糖化酶。Rh,sp.是最常見(jiàn)的霉菌,繁殖生長(cháng)快,條件要求不苛刻,在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生豐富的葡萄糖淀粉酶,具有較強的生淀粉水解能力。曲霉在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生多種活性酶如葡萄糖淀粉酶、a淀粉酶蛋白酶等,現在工業(yè)上生產(chǎn)糖化酶的菌種主要是A. niger的變異菌種1,1。有不少研究者對此進(jìn)行了嘗試早在20世紀50年代,日本學(xué)者 Yamasaki等就報道過(guò)淀粉不經(jīng)蒸煮直接進(jìn)行酒精發(fā)酵,發(fā)現A.nier的淀粉酶活力比米曲霉(A. craze)高淀粉可不經(jīng)蒸煮就能被用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)酒精。1986年, HideoTanake等將能產(chǎn)a淀粉酶的好氧微生物泡盛曲霉(Asp. awamori)和運動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Z, mobili)混合固定于海藻酸鈣中,直接發(fā)酵淀粉生產(chǎn)酒精。Yeon等混合培養 Schwanniomyces castelli和S. cereussiae,直接發(fā)酵可溶性淀粉產(chǎn)酒精,利用率達94%。但有研中國煤化工醇的耐受性低,在現有的工業(yè)發(fā)酵的前期糖化過(guò)程中一般不使用產(chǎn)淀粉酶的CNMHG微生物作用是采用邊糖化邊發(fā)酵的原理,該工藝省去了蒸煮和糖化2個(gè)工段:蒸煮和預先糖化,節約了大量的能耗。鄧立紅等1和 Tanaka等指出混合培養時(shí)的關(guān)鍵是如何協(xié)調糖化菌和發(fā)酵菌的活性比及培養條件的優(yōu)化,使葡萄糖的生成量既能滿(mǎn)足酒精發(fā)酵的需要,又不過(guò)多被糖化菌消耗,從而保證酒90長(cháng)江大學(xué)學(xué)報(自科版)農學(xué)卷2007年3月精的得率與產(chǎn)率。發(fā)酵3.1發(fā)酵菌種菌種是酒精工業(yè)生產(chǎn)的原動(dòng)力,菌種優(yōu)劣不僅直接影響發(fā)酵率的高低,而且影響酒精的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此,菌種選育是實(shí)現酒精工業(yè)的關(guān)鍵。葡萄糖通過(guò)發(fā)酵近乎定量地轉化為酒精都是用酵母作菌種,如釀酒酵母(S. cerevIsiae)、卡爾斯伯酵母(S. carlsbergensis)脆壁克魯維酵母( Kluyveromyces fragilis)和熱帶假絲酵母( Candida tropicalis)等,而很少用細菌2)。雖然酵母用于生產(chǎn)乙醇有很多優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也有很大局限性,如可利用的底物種類(lèi)少,對酒精的耐受力有限2。因其工業(yè)重要性,不同方面的研究屢見(jiàn)報理想的酒精發(fā)酵微生物應該具備快速發(fā)酵、乙醇耐受高、副產(chǎn)品少、滲透壓和溫度耐受力強等特性雖然利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇有些缺點(diǎn),但比其它已知能生產(chǎn)乙醇的微生物更接近上述的特性,目前引起普遍關(guān)注能生產(chǎn)乙醇的微生物是運動(dòng)發(fā)酵單孢菌。運動(dòng)發(fā)酵單孢菌利用葡萄糖生產(chǎn)乙醇的速度比酵母快3~4倍,乙醇產(chǎn)量可以達到理論值的97%而且生長(cháng)不需要氧氣,能忍耐40%(w/w)葡萄糖溶液,在13%(v/v)乙醇濃度中可以生存2)。盡管這樣,運動(dòng)發(fā)酵單孢菌利用碳水化合物時(shí)因代謝存在的問(wèn)題,如用于細胞生長(cháng)的能量和副產(chǎn)物等,并沒(méi)有在工業(yè)上取代酵母的生產(chǎn)地位。3.2發(fā)酵工藝與傳統發(fā)酵工藝相比,已經(jīng)發(fā)展了一些實(shí)際生產(chǎn)良好的發(fā)酵模式,在工藝上得到進(jìn)一步的完善和創(chuàng )新,如濃醪發(fā)酵、清液發(fā)酵和連續發(fā)酵等。下面僅就一個(gè)發(fā)酵體系中所用菌株的種類(lèi)介紹當前發(fā)酵工藝的研究概況。(1)單菌種發(fā)酵相對于游離細胞發(fā)酵而言,固定化酵母細胞發(fā)酵生產(chǎn)酒精是自20世紀60年代發(fā)展起來(lái)的酒精發(fā)酵新工藝之一[2:,是當今酒精發(fā)酵工藝的重要研究方向之一[2,26,在應用和基礎理論研究等方面得到了較大的突破,其中以包埋法應用最為普遍。常用的載體有海藻酸鈉、卡拉膠、多孔玻固定化酵母細胞持續轉化底物和生物催化的再循環(huán)是非常有價(jià)值的工藝,能使發(fā)酵罐內細胞濃度提高,細胞可連續使用,使最終發(fā)酵液酒精濃度得以提高。如固定化酵母發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)酒精比同樣濃度的懸浮細胞快282。而傳統發(fā)酵工業(yè)中的游離細胞發(fā)酵一一間歇發(fā)酵法,具有許多缺點(diǎn),如發(fā)酵器內細胞濃度低,酵母只能一次性使用,設備復雜,勞動(dòng)強度大0。因此開(kāi)發(fā)固定化酵母發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)酒精的技術(shù)具有重要的現實(shí)意義另外,某些微生物如 Saccharomyces sp.自身有很強的絮凝能力,可形成顆粒,與傳統的各種載體固定化細胞方法相比具有簡(jiǎn)單、無(wú)附加費用的突出優(yōu)點(diǎn),可以降低酒精生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率。酵母細胞自絮凝特性為發(fā)酵產(chǎn)酒精提供了新工藝,使得實(shí)現酒精連續發(fā)酵并聯(lián)產(chǎn)酵母十分方便,且發(fā)酵速率快1而兩步連續發(fā)酵工藝生產(chǎn)酒精目前進(jìn)一步受到關(guān)注,為提高酒精得率和基質(zhì)轉化效率提供了發(fā)展空間2)復合菌種發(fā)酵由于乙醇產(chǎn)量受末端產(chǎn)物抑制,低細胞濃度以及底物基質(zhì)抑制, Gauss等提出在同一個(gè)反應罐中進(jìn)行糖化和乙醇發(fā)酵的同步糖化發(fā)酵法( Simultaneous Saccharification and Fermentation,SsF)3)。這樣a-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶對淀粉水解和乙醇發(fā)酵過(guò)程在同一裝置內連續進(jìn)行,水解產(chǎn)物葡萄糖由菌體的不斷發(fā)酵而被利用,消除了葡萄糖因基質(zhì)濃度對纖維素酶的反饋抑制作用。在工藝上采用一步發(fā)酵法,簡(jiǎn)化了設備,節約了總生產(chǎn)時(shí)間,提高了生產(chǎn)效率。然而復合菌種面臨的一個(gè)重要的問(wèn)題是因產(chǎn)淀粉酶微生物消耗大量的淀粉而降低了乙醇產(chǎn)量。而有研究報道,由于對乙醇的耐受性低,在現有的工業(yè)發(fā)酵中一般不使用產(chǎn)淀粉酶的微生物。中國煤化工4小結CNMHG目前看來(lái),因再生能源燃料和礦物燃料的性?xún)r(jià)比差別,人們依然傾向于使用礦物燃料。但從長(cháng)遠發(fā)展第4卷第1張橋等:生物轉化淀粉嚴燃料乙醇的研究進(jìn)展來(lái)看,隨著(zhù)經(jīng)濟步人健康的發(fā)展軌道,再生能源的消耗最終會(huì )增長(cháng),從而逐步取代礦物燃料。作為可再生的綠色資源—淀粉原料,在較多的農作物中含量豐富,如玉米、小麥、大麥、馬鈴薯等,但因地域差別,各自占的比重有所不同。因此應該結合地區的農業(yè)特色,開(kāi)發(fā)挖掘可以生產(chǎn)燃料乙醇的原料。生物質(zhì)原料生產(chǎn)的酒精要和其它燃料競爭,不論采用何種底物,其生產(chǎn)工序必須簡(jiǎn)單,能耗低、得率高、成本低廉。隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程手段構建和提高直接發(fā)酵淀粉的酵母菌在理論上是可行的,并且已獲得了一些不同類(lèi)型的重組菌株,而細胞表面展示技術(shù)在實(shí)驗室酒精發(fā)酵中的成功運用又給了我們一個(gè)方向,這無(wú)疑又為酒精發(fā)酵工業(yè)帶來(lái)新的希望,并具有很重要的意義,但仍有很多問(wèn)題需要解決,如乙醇耐受力、反饋抑制、基因的穩定性和發(fā)酵工藝的完善等。而從代謝角度出發(fā)的途徑工程和發(fā)酵系統優(yōu)化無(wú)疑將是發(fā)酵工程的一個(gè)重要方向,包括從基因到蛋白質(zhì)甚至代謝網(wǎng)絡(luò )中不同水平的層疊與整合是認識系統內單一組分特性及對整個(gè)細胞功能影響的關(guān)鍵3?？傊?目前所獲得的重組菌株距離實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)尚待時(shí)日。[參考文獻[1]Alan E W, Luiz C B, Denise M G,et al. 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