聚乙二醇處理對羊草種子萌發(fā)及活性氧代謝的影響

第!1卷第1期Val11.N.1mACTA PRATALLfUKAE SINICA8/2002聚乙二醇處理對羊草種子萌發(fā)及活性氧代謝的影響劉杰,劉公社" ,齊冬梅,李芳芳,汪恩華(中國科學(xué)院櫝物研究所.北京11093)摘要:應用聚乙二醇(PEG 600)引發(fā)法探討了不同引發(fā)滲透處理時(shí)間處理對羊草種子萌發(fā)及活力的影響，結果表明:以30% PEG處理羊草種千24 h.能顯著(zhù)提高羊草種子發(fā)芽率和幼苗活力降低萌發(fā)過(guò)程中的外滲電導率。在羊草種子萌發(fā)期間,經(jīng)PEG處理的羊草種子.呼吸速率初始低千對照,之后迅速增加;超氧負離子(O2- )濃度明顯降低.超氧化物歧化酶(SOD)相過(guò)氧化物酶(PO0D)的活性均顯著(zhù)增加:脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物內二醛(MDA)的積累最明顯低于對照。經(jīng)PEG引發(fā)引起的羊草種子活力升高與體內活性氧代謝的變化存在著(zhù)定的內在聯(lián)系。關(guān)鍵詞:聚乙二醇(PEG);活力指數;活性氧代謝;羊草種子中圍分類(lèi)號:S543.903.7文獻標識碼:A .文章編號:1004- 5759<2002)01 0059-06羊草又稱(chēng)堿草(Leymus chinensis) ,是禾本科牧草之王,我國約占世界羊草總面積的一半,主要分布 于東北平原、內蒙古高原的東部和中部、華北北部山區、黃t高原。羊草具有蛋白含量高、適口性好、適應性強、產(chǎn)草量高等特點(diǎn)，牛、羊均喜食，素有“牧草中的細糧”之稱(chēng)1。羊草草地是優(yōu)良的天然放牧地和割草地,在目前北方草原改良和人工草地建設中.已成為大面積種植的主要優(yōu)良牧草,在當前發(fā)展草原畜牧業(yè)、改善西部生態(tài)環(huán)境等方面具有舉足輕重的地位。因此,加大科研投入,采用生物技術(shù)手段全方位開(kāi)展對羊草的科學(xué)研究,已引起政府和越來(lái)越多研究者的關(guān)注(2.2]。由于羊草的人工馴化時(shí)間較短,野生性較強,使得羊草的結實(shí)率、發(fā)芽率、產(chǎn)草量偏低的“三低”問(wèn)題長(cháng)期得不到很好地解決,成為限制草原改良和人工草地建設的“瓶頸”。近年來(lái),雖有一些研究報道了對羊草種子休眠機理及種子發(fā)芽特性釣探討15.6.但仍缺E近-步的研究資料。本試驗采用滲透調節劑聚乙二醇PEG-6000引發(fā)羊草種子,測定種子萌發(fā)過(guò)程中過(guò)氧陰離子(O2-)的含量、脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物丙二醛(MDA)的積累,分析膜透性及有關(guān)活性氧清除酶的變化,對在滲透調節作用下羊草種子萌發(fā)過(guò)程中括性氧代謝與其相關(guān)酶類(lèi)的活性和幼苗活力之間的內在聯(lián)系進(jìn)行了初步研究,旨在闡明PEG引發(fā)對促進(jìn)羊草種子萌發(fā)和活力的效應,為解決羊草“三低”難題提供理論依據。1材料與方法1.]試驗材料供試羊草種子1998 年采自中科院內蒙古多倫縣草原站。1.2滲 透處理配制5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%的PEG-6000浸潤種子，置于14 C培養箱中避光處理10 h后，用蒸餾水沖洗3~4次,置于濾紙上10 min,自然風(fēng)千。然后將羊草種子置于培養皿濾紙上,放入培養箱中20/30 C變溫(8 h高溫,16h低溫>黑暗條件下萌發(fā),萌發(fā)過(guò)程中保持水分。每組200粒種子,3個(gè)重復。逐日觀(guān)察統計發(fā)芽情況。10d后檢測幼苗活力指數[幼苗活力指數=(胚根長(cháng)+下胚軸長(cháng))X發(fā)芽率]。根據最高活力指數的PEG濃度對羊草種子進(jìn)行3.12.16.20.24.36、48 h的浸潤處理,篩選出24 h處理時(shí)間與30% PEG-6000滲透引發(fā)為最佳處理條件。再用30%PEG-6000處理羊草種子24 h后,進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗，分別取萌發(fā)4d.5d、6d.7d、中國煤化工8d.9d、10d的幼苗為材料,進(jìn)行下一步的生理生化指標的測定。MHCNMHG收稿日期:200 07-03作者簡(jiǎn)介:劉杰(1963-).男、河北來(lái)定人，博士,副研究員。*通迅作者50ACTA PRATACULTURAE SINICA(Vol. 11,No. 1)3/20021.3測定方法經(jīng)PEG預處理的各組羊草種子,用蒸餾水洗干凈后,取重量-致的萌發(fā)種子(1. 34 g.500粒),在25 ml重蒸水中萌發(fā),分別在4.5.6.7.8.9、10 d時(shí)測定種子外滲電導串,3次重復。外滲電導率的測定參照陳光儀的方法[”;呼吸速率的測定參照堿吸收法,25C時(shí)測定萌發(fā)種子呼吸釋放的CO,含量f°8];超氧陰離子的測定參照王愛(ài)國等.的羥胺法[";過(guò)氧化物酶(POD)活性的測定按波欽諾克的方法[0];過(guò)氧化物歧化酶(SOD)活性的測定,采用氮藍四唑(NBT)光化還原抑制法"”;丙二醛(MDA)含量的測定,按Heath 等的硫代巴比妥酸(TAB)比色法”。2結果與分析2.1 PEG 處理對羊草種子活力的影響用不同濃度PEG、不同時(shí)間處理的羊草種子萌發(fā)率及幼苗活力指數均高于對照,其中以30%PEG處理24h的羊草種子差異最為顯著(zhù)(表1、2),發(fā)芽率可提高4倍左右,而活力指數提高了近10倍。表1不同PEG濃度處理對羊草種子萌發(fā)率及幼苗活力指數的影響Table 1 Effect of difterent PEG concentration on the vigour index in wildrye seeds項目ltemCK10% 15%20%25%30%35%發(fā)芽率Rate gerninatioa (%)11.20 24. 6029.400 35.800 39.200 46.700 56.500 55. 400胚根+胚軸長(cháng)Length of radicle and pocotyl (cm)2.120 2.440 2. 9803. 2603. 1203.440 3. 8803. 210活力指數Vigour index0. 2370. 6000.876 1.167 1. 2231.6062. 1921.778表2 30%PEG 濃度不同時(shí)間處理對單草種子萌發(fā)率及幼苗活力指數的影響Table 2 Effect of different PEG concentratioo and time on the vigour index in wildrye seeds項目1lem12h16h20 h24h 36h 48 h發(fā)芽事Rate germination (%)11.400 35.600 38.200 40.500 42.400 58.800 53.600 54. 100胚根+胚軸長(cháng)Leagth of radicle and pocotyl (cm)1.980 3.140 3.100 3.210 3. 2203.850 3.680 3. 530括力指敷Vigour index0.225 1.1181.184 1.300 1.365 2.264 1 9721. 9102.2 PEG處理對外滲電導率的影響不同濃度PEG處理24 h的羊草種子,置于蒸餾水中萌發(fā),萌發(fā)過(guò)程中其外滲電導率較對照均有明顯下降，以30%PEG濃度處理組最小(圖1)。以30% PEG依度對羊草種子進(jìn)行不同時(shí)間處理,在萌發(fā)過(guò)程中的外滲電導率隨處理時(shí)間的增長(cháng)而逐漸減小。處理時(shí)間大于24 h的實(shí)驗組,雖外滲電導率仍在下降,但幼苗活力指數卻有所降低(表2.圖1),可能是由于PEG處理控制了水分滲透勢,過(guò)分限制了水分進(jìn)入種子內部,從而影響萌發(fā)進(jìn)程。.3 30%PEG預處理24h對羊草種子呼吸和O2~含量的影響羊草種子在萌發(fā)過(guò)程中呼吸代謝逐步加強，以每mg蛋白CO2釋放量計的呼吸速率第9d達到最大值。經(jīng)30%PEG處理的羊草種子呼吸速率增加的速度明顯大于對照,第7d時(shí)已接近對照組(圖3)。隨著(zhù)羊草種子萌發(fā)過(guò)程中呼吸強度的逐步增加，細胞內0;離子含量呈逐步升高的趨勢，第8d達到峰值，表現出與呼吸強度變化的密切相關(guān)。而經(jīng)PEG處理的羊草種子,其02含量雖也增加,但增加速度明顯降低,到第7d的O2-含量?jì)H為對照的48.6%(圖4)。測定結果表明PEG處理可有效降低種子萌發(fā)過(guò)程中O2~自由基的積累。中國煤化工2.4活性氧清 除酶活性的變化超氧化物歧化酶(SOD)作為植物體內抗氧化酶體系的關(guān)MH. CNMHG2O;自由基。使用鄰苯三酚自氧化法")和腎上腺自氧化法測定[*ISOD活性時(shí),由于羊草葉子粗提液中多酚氧化酶的干擾,很難達到理想效果。采用氮藍四唑光化還原抑制法，能夠避免多酚氧化酶的不利影響。酶活性的計算以對NBT光化還原第11卷第1期草業(yè)學(xué)報202年6|的抑制率作為標準,50%抑制率為一個(gè)活性單位。圖5的結果表明:測定初始PEG處理組與對照S0D活性幾乎在同一水平,以后隨萌發(fā)時(shí)間的增加,SOD活性逐漸升高,第8d達到最高水平,與對照相比較,處理組SOD活性明顯高于對照,峰值時(shí)是對照的1.44倍。700+cx母5強七15*-20+35%0 10%600700 十25%一 30%里500，5004040030員300200希200P 100中100cK 81216 20 236 48時(shí)間Time油)時(shí)間Time (h)圖1不同濃度PEG處理后羊草種子圍2不同時(shí)間30%PEG處理后對萌發(fā)過(guò)程中外滲電導率的變化浸泡10 h羊草種子電導率的影響Fig. 1 Change of conductivity of wildrye seed germinating Fig. 2 The conductivity of wildrye seed in 10 h marioatingwith different concentration of PEG treatmentafter treatment in different time with 30% PEG←CK甘30%PEG士-CK一30%PEG0.8置3E20.40.2;561891010萌發(fā)時(shí)間Time (d)圖3羊草種子萌發(fā)過(guò)程中呼吸強度的變化圖4羊草種子萌發(fā)過(guò)程中O2 -的變化Fig. 3 Cbange of respiratory intensityFig.4 The content ofO2 inof wildrye seeds during germinationwildrye seeds during germination◆30%PEG七CK+ 30%PEG -0-CK500京3400光e300東e200家100中國煤化工9 10MHCNMH G圖5羊草種子萌發(fā)過(guò)程中 SOD活性的變化圖6羊草種子萌發(fā)過(guò)程中POD活性的變化rig.5 Activity of SOD in widrye seeds during germinationFig. 6 Activity of POD in wildrye seeds during germination62ACTA PRATACULTURAE SINICA(Vol. 11,No. 1)3/2002過(guò)氧化物酶(POD)是植物體內另一種淯士30%PEG母CK除括性氧的重要酶類(lèi)。測定結果表明:在羊草種25 f子萌發(fā)初期,細胞內P0D活性急劇升高,第8d時(shí)達到峰值。與對照相比,經(jīng)PEG處理后的羊20草種子,其POD活性升高幅度明顯大于對照，o一6d后的POD活性是對照的1.24倍(圖6)。PEG處理能有效誘導SOD與P0D活性氧清除酶的活性升高。2.5丙二醛(MDA)含董的變化植物細胞膜系統的主要組成成分是脂質(zhì)和萌發(fā)時(shí)間Time (d)蛋白質(zhì)。脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基可使膜質(zhì)過(guò)氧圖7羊草種子 萌發(fā)過(guò)程中MDA含量的變化化而造成細胞膜損傷。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)Fig.7 Change of the content of MDA in氧化反應的產(chǎn)物，與自由基活性氧的含量關(guān)系wildrye seeds during germination密切,其形成的速率在一定程度上反應機體內清除自由基能力的大小和活性氧代謝的水平1s]。圖7的結果表明:羊草種子萌發(fā)過(guò)程中MDA的含量呈增高的趨勢,用PEG預處理羊草種子可降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應。3討論羊草種子休眠時(shí)間為4年左右,且發(fā)芽時(shí)間長(cháng),成活率低。有些研究報道了采用磁處理.低溫流水浸泡、激素處理等方法可打破羊草種子休眠并對提高種子發(fā)芽率有一定作用5.162。聚乙二醇(PEG)是較為理想的滲透調節劑,PEG處理在大豆、高粱、水稻、蔬菜、花生等作物種子上都表現出明顯效果"”1。在禾本科牧草研究上,也有一些PEG處理種子的研究報道。國外學(xué)者多采用低滲透勢、長(cháng)時(shí)間對種子進(jìn)行處理,而國內研究人員則多傾向于高滲透勢、短期的處理!0]。本實(shí)驗的結果表明:用30%的PEG處理24 h后的羊草種子,在提高發(fā)芽率、發(fā)芽勢、種子活力等方面,效果也很顯著(zhù)(表1、2)。植物體內的活性氧(AOS)對植物幼苗、細胞結構與功能、生物大分子、酶系統、DNA均有一定的傷害作用02]。AOS是生物體進(jìn)行氧化還原反應時(shí)發(fā)生的電子滲漏,滲漏的電子與O2結合而產(chǎn)生。當體內活性氧清除酶量不足或活性太低時(shí)，就會(huì )有活性氧積累。逆境誘導也會(huì )引起植物體內活性氧增加，由此產(chǎn)生的氧化脅迫導致植物的不可逆損傷。然而,植物在長(cháng)期進(jìn)化過(guò)程中,形成了一個(gè)完善的清除氧防衛系統,使植物體內產(chǎn)生與清除活性氧維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。當該動(dòng)態(tài)平衡被破壞,植物的結構與功能就可能受到損傷甚至出現死亡。隨著(zhù)自由基生物學(xué)的發(fā)展,特別是超氧化物歧化酶的發(fā)現,使得對植物體內重要調節保護機制一抗氧化酶 系統的研究日漸深入221]。研究發(fā)現:在種子萌發(fā)過(guò)程中氧自由基會(huì )對質(zhì)膜、酶系統、蛋白質(zhì)合成造成一定的傷害作用,使種子發(fā)芽率降低。SOD活性與種子活力密切相關(guān),在種子人工老化處理后的吸漲萌發(fā)過(guò)程中,SOD活性比對照不僅低且出“晚“3]。羊草種子經(jīng)30% PEG處理24 h后,活力指數比對照高出近10倍.萌發(fā)過(guò)程中O2含量降低顯著(zhù)，而MDA的積累僅為對照的60%左右.SOD、POD抗氧化酶的活性與對照相比有明顯增強。萌發(fā)期間的外滲電導率明顯低于對照,而呼吸速率的增加則明顯高于對照。因此,PEG處理對羊草種子萌發(fā)過(guò)程中活性氧自由基引起的過(guò)氧化反應起到一定的抑制作用,從而提高種子發(fā)芽率和幼苗活力。PEG引發(fā)是通過(guò)引發(fā)溶液的滲透壓來(lái)達到引發(fā)種子的目的。其實(shí)質(zhì)是限制水分進(jìn)入種子的速率,減少種子吸漲過(guò)程中膜系統的損傷,也有利于膜系統損傷的修復[24。Rich(1978)研 究發(fā)現:在種子萌發(fā)過(guò)程中,如果線(xiàn)粒體內膜損傷減小,呼吸電子傳遞鏈上NADH-黃素蛋白和輔|中國煤化工減少,就會(huì )降低O2~形成的速率，并引起外滲電導率的降低(2]。植物SOD是一:DHCN M H G外部環(huán)境條件可影響.SOD活性水平。在某種意義.上,PEG處理對種子萌發(fā)來(lái)說(shuō),起到是一種水分脅退的作用，如果這種脅迫是在植物體耐受范圍之內,便會(huì )激活體內包括抗氧化酶在內的一系列保護機制的啟動(dòng)16]，從而引起機體內抗氧化活動(dòng)的第11卷第1期草業(yè)學(xué)報2002年53增強，加速活性氧自由基的清除,減低對種子萌發(fā)過(guò)程中的不利因素,提高種子活力水平。銬文獻:[1]賈慎修. 中國飼用植物志(I)[M].北京:中國農業(yè)出版社,1987.19-35.[2]劉公社.王 志遠.北方農牧交鍇帶可持續發(fā)展論文集[C].北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社:1999.[3]劉杰,劉公社,齊冬梅,等. 用徼衛星序列構建羊草遺傳指紋圖譜[].植物學(xué)報200.42(9):985-987.8[4]武保國,權寧玉. 羊草種子發(fā)芽特性的研究[J].牧草與飼料1992,(1):16-18.[5]易津. 羊草種子的休眠生理及提高發(fā)芽率的研究[].中國草地,1994,(6):1-6.[6]趙傳孝, 楊根風(fēng),張國瞳,等.羊草種子發(fā)芽率的研究[]，中國草原，1986,<5):54-56. .[7] 陳光儀,傅家瑞. 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During germination peri-od，although the respiratory intensity of wildrye seeds pretreated with 30% PEG for 24 h was lower at begin-ning , it increased rapidly soon afterward; the content of O:- decreased visibly but the activity both of superox-ide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) increased. The accumulation of malondialdehyde (MDA) wasmuch lower than that of control. Consequently, it suggested that there was some interacting relationship be-tween the increasing of vigour index through pretreatment with PEG and the increasing of activity oxygenmetabolism.Key words: activity oxygen metabolism; PEG; vigour index; wildrye seed中國煤化工MHCNMHG