一種核-殼結構的枝化聚乙二醇大分子的合成

國防科技大學(xué)學(xué)報第28卷第3期JOURNAL OF NATIONAL UNIVERITY OF DEFENSE TECHNOLOGYVol .28 No.3 2006文章編號:1001 - 2486( 2006 )03 - 0037 - 03-種核- - 殼結構的枝化聚乙二醇大分子的合成王孝杰李效東'，劉東華2 ,劉克良3( 1.國防科技大學(xué)航天與材料工程學(xué)院湖南長(cháng)沙410073 ; 2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院湖南長(cháng)沙410081 ;3.軍事醫學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所北京100850)摘要選擇以三羥甲基氨基甲烷( Tris )為核,以單甲氧基聚乙二醇( mPEC)為外層分子通過(guò)官能團反.應，合成出一種核一殼型枝化PEG衍生物利用叔丁氧羰基酸酐((Boc)0)對Tris上的氨基進(jìn)行保護對mPEG端羥基依次進(jìn)行羧基化、酰氯化等活化處理通過(guò)酰氯與羥基的官能團反應合成出目標分子。產(chǎn)物分子保留了活性官能團氨基為其進(jìn)-步的修飾反應提供了保障。通過(guò)紅外光譜分析、元素分析及分子量測定,證實(shí)了產(chǎn)物與目標分子的結構相吻合。關(guān)鍵詞:氨基保護枝化聚乙二醇核一殼結構冶成中圖分類(lèi)號:TB324文獻標識碼AA Novel Method for Synthesis of Core-shell TypeBranched PEG MacromoleculeWANG Xia-jie' LI Xiao-dong' ,LIU Dong-hua2 ,LU Ke-liang3( 1. College of Aerospace and Material Engineering , National Univ. of Defense Technology , Changha 410073 China ;2. College of Chemistry and Chemical Engineering , Hunan Normal University , Changsha 410081 China ;3. Institute of Pharmacology & Toxicology , Academy of Military Medical Science , Beijing 100850 ,China )Abstract :A novel core-shell type branched macromolecule was synthesized from the trid hydroxymethyl ) aminomethand( Tris ) andthe monomethoxypols( ethylene glycol I mPEG). The first step was to protect the amino group of Tris by using t-butyloxycarbonyl anhy-dride (( Boc )20 ) , then mPEG was activated by changing hydroxide terminal into acid chloride and carboxylation of mPEG was fulilleldbefore. The amino group was reserved so that it could be used as functional radical to modify the protein later. The product was con-firmned to inosculate with FT-IR ,EA and M . W. through infrared spectroscopic analysis , element analysis and mensuration of molcularweight.Key words protection of amino group ; branched PEG ; core-shell ; synthesis .蛋白質(zhì)及多肽藥物的生物利用度很低，很多還會(huì )引起嚴重的免疫反應通過(guò)對藥物進(jìn)行化學(xué)修飾可以有效地改善這些問(wèn)題。在常用的化學(xué)修飾劑中聚乙二醇( PEG )及其衍生物因其所具有的兩親性、生物相容性、無(wú)免疫原性、無(wú)毒副作用等1-2]特點(diǎn),而成為備受關(guān)注的化學(xué)修飾劑。人們已經(jīng)在這方面開(kāi)展了很多工作,也取得了一些成果。目前,在利用PEG作為修飾劑的研究中基本都是采用線(xiàn)形結構的聚乙二醇修飾劑3-4],例如mPEG琥珀酸基琥珀酸酯(mPEG-SS),mPEG琥珀酸基碳酸酯(mPEG-SC)等。近來(lái)有研究表明:使用枝化PEG修飾劑比使用線(xiàn)形PEG修飾劑可使酶的活性保持得更好[5],例如在對尿酸酶的化學(xué)修飾研究中發(fā)現,如果用枝化PEG作為修飾劑聚乙二醇化后酶活性為未修飾酶活性的32% ,而使用線(xiàn)形PEG ,聚乙二醇化后酶活性?xún)H為未修飾酶活性的2.5%。另外,使用枝化的修飾劑可以大大降低修飾產(chǎn)物的結構分散性這在干擾素聚乙二醇化過(guò)程中得到很好的證明用線(xiàn)形聚合物修飾產(chǎn)生11種位置同分異構體而用枝化聚合物只有中國煤化工被聚乙二醇化6]。因此枝化的PEG衍生物在藥物修飾領(lǐng)域具有重大YHCNMHG能團的化合物為核,以活化了的mPEG為外層分子通過(guò)官能團反應,合成出一種具有核殼結構的枝化PEG衍生物。由于合成的枝化PEG衍生物在修飾藥物時(shí)需要有活性位點(diǎn),本文選擇三羥甲基氨基甲烷(Tris)作為核材料,收稿日期2005- 12-09作者簡(jiǎn)介王孝杰( 1970- - )男博士生，講師。38國防科技大學(xué)學(xué)報2006年第3期并通過(guò)氨基保護使產(chǎn)物分子保留了活性官能團，為其進(jìn)-步的修飾反應提供了保障。產(chǎn)物分子通過(guò)紅外光譜分析、元素分析及分子量測定結果表明產(chǎn)物為目標分子。實(shí)驗部分1.1儀器與試劑單甲氧基聚乙二醇( mPEG ,Mn= 750),ACROS公司;三羥甲基氨基甲烷( Tris),ACROS公司;叔丁氧羰基酸酐(( Boc )0),吉爾生化;二氯亞砜、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、無(wú)水乙醇、甲醇、無(wú)水乙醚等均為國產(chǎn)分析純試劑,使用前均進(jìn)行了干燥處理。紅外光譜儀, Nicolet Mangna IR-550 型,KBr 壓片沅素分析儀,USA ,PE-24001型CHN元素分析儀液質(zhì)聯(lián)用儀,Agilent 1100 series LC-MSD 核磁共振儀,VarianINO-VA-300 ,TMS 為內標,CDCI; 為溶劑。1.2 合成方法1.2.1單甲氧基聚乙二醇酰氯(mPEG-COCl)的制備稱(chēng)取羧基化單甲氧基聚乙二醇(mPEG-CO0H)0.5g(自制),加入到裝有球形冷凝管的三口燒瓶中。用滴液漏斗滴加二氯亞砜至過(guò)量,用氫氧化鈉吸收氯化氫氣體室溫攪拌反應1h。水泵減壓蒸餾除去過(guò)量的二氯亞砜,得到黃棕色固體用無(wú)水乙醚洗滌3次除去殘余的二氯亞砜置干燥器中干燥以備下面實(shí)驗。1.2.2三羥甲基氨基甲烷的氨基保護反應式如下:--OH-.OHHC/ CH-Ot- CH&-i-HN- OHTris(Boc)0Boc-Tris稱(chēng)取1.2g( 0.01mol )Tris ,加入到250ml三口燒瓶中,加60ml無(wú)水甲醇攪拌溶解后,再加2.2g(0.01mol )( Boc)20。 50下回流、攪拌反應10h旋轉蒸發(fā)完溶劑得到白色固體在水中重結晶，得到產(chǎn)物1.8g產(chǎn)率為81.8%。1.2.3 核-殼型枝化大分子的合成CH3-0( CH2CH20 )。-CH2CH2COCl + Boc-Tris- ? Boc-Tris( mPEG);，i=1~3將mPEG-COCI溶于30ml二甲基甲酰胺中,加入Boc-Tis( mPEG-COCI與Boc-Tris 的摩爾比為3:1 ),用氫氧化鈉吸收反應產(chǎn)生的氯化氫尾氣,在50C下反應5h ,減壓蒸餾溶劑,至溶液體積約10ml左右停.止加熱冷卻至室溫用無(wú)水乙醚沉淀,色 譜柱分離得到淡黃色固體0.3g產(chǎn)率為55%。2結果與討論2.1三羥甲基氨基甲烷的氨基保護(Boc-Tris)2.1.1 Boc-Tris的紅外表征Boc-Tris的紅外光譜如圖1所示,在2500~ 3560cm-'處,原料Tris的氨基、羥基的寬強吸收峰消失,同時(shí)Tris的伯胺基的面內彎曲振動(dòng)峰1588cm-消失,說(shuō)明原料參與了反應,出現了氨基甲酸酯的組合特征峰3421em-1為N-H伸縮振動(dòng)峰,1715em-1為C=0伸縮振動(dòng)峰,1650cm-l為 N-H面內彎曲振動(dòng)峰,1250cm-為N-CO-0反對稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰。中國煤化工2.1.2Boc-Tris的核磁共振表征YHCNMHGBocTris的'HNMR分析結果如圖2所示δ= 1.44(9H , Boc)3.70( 6H ,-0( CH20H))5.32(3H ,0H),7.92( -CONH )。2.1.3 Boc-Tris的LC-MSD的表征Boc-Tris的液質(zhì)聯(lián)用譜如圖3所示,白色晶體經(jīng)液相色譜分離后,在t=2.201min處出現單峰，說(shuō)明王孝杰等:一種核一殼結構的枝化聚乙二醇大分子的合成39該晶體為純凈物,m/z=221 處為分子離子峰而沒(méi)有其他雜質(zhì)峰質(zhì)譜儀采用常壓化學(xué)電離( APCI)法得到的就是分子離子峰幾乎沒(méi)有碎片離子峰。通過(guò)紅外、液質(zhì)聯(lián)用及核磁共振分析表明得到的產(chǎn)物是目標產(chǎn)物。m^\.1FTTns4000300020001000圖1 Boc-Tris 的紅外譜圖圖2 Boc-Tris 的'HNMR譜圖.Fig.1 FT-IR spectra of Boc-TrisFig.2 1 HNMR spectra of Boc-Tris2 250 000100 I2 000 0001 750 00080 I1 500 0001250 000601 000 00040750 000500 00020250 000012.3。45610020(; 1:30011min圖3Boc-Tris的液質(zhì)聯(lián)用譜圖Fig.3 LC- MSD spectra of Boc- Tris2.2核一 殼型枝化大分子( CSBM )的合成2.2.1 CSBM的純化由于CSBM的分子量是聚乙二醇的3倍多它的分子體積較大極性基團也較多,因而硅膠對它的吸附作用強于對聚乙二醇的吸附薄層色譜結果顯示聚乙二醇的Ry=0. 80,CSBM的R,=0.5。比移值的差別表明產(chǎn)物中未反應的mPEG可以通過(guò)色譜柱分離法除去。實(shí)驗以80~ 100目的硅膠為填充劑無(wú)水乙醚一無(wú)水甲醇( 30:50 )為展開(kāi)劑,進(jìn)行色譜柱分離。合并含產(chǎn)物的淋下液旋轉蒸發(fā)至少量溶液時(shí),加無(wú)水乙醚沉淀得到白色固體干燥貯藏。2.2.2 CSBM 的紅外表征CSBD的紅外光譜如圖4所示,1745em-I處出現較強的酯鍵特征吸收峰1110cm-1為聚乙二醇鏈段醚鍵伸縮振動(dòng)吸收峰,說(shuō)明mPEG通過(guò)生成的酯鍵接上了。1360cem-為叔丁基面內彎曲震動(dòng)峰2888cm~1為鏈骨架C-H伸縮振動(dòng)吸收峰。表1CSBM的元素分析結果Tab.1 The result of element analysis about CSBMCHO4000 3000 20000000理論% 54.2 8.8 0.6 36.4中國煤化工的紅外譜圖實(shí)測% 51.5 8.41.0 39.1pectra of CSBMMHCNMH G'(下轉第70頁(yè))7(國防科技大學(xué)學(xué)報2006年第3期201 - 214.[ 16] Valiant L G. The Complexity of Enumeration and Reliability Problem-[ J]. SIAM Jourmal of Computing , 1979( 8) 410- 421.(上接第39頁(yè))2.2.3 CSBM 的元素分析產(chǎn)物的元素分析結果如表1所示。由于采用CHN元素分析儀,所以表中氧的數據為計算所得。實(shí)測值與理論值稍有偏差,可能是由于產(chǎn)物不是純凈物，核上連接的mPEG鏈不完全是三條,而是幾種鏈數的混合物。2.2.4 CSBM的分子量測定本文應用凝固點(diǎn)降低法測定CSBM的分子量。以水作溶劑,△T/ 值為0.017C ,計算出平均分子量為2188。理論計算CSBM含三條鏈的分子量為2591含兩條鏈的分子量為1801含-條鏈的分子量為1011 ,實(shí)測值為2188 ,可以推斷所得產(chǎn)物是含三條鏈和兩條鏈的混合物,可能還含有少量-條鏈的。3.結論以Tris 為核,以酰氯化的mPEG為外層分子,通過(guò)官能團反應,合成出一種具有核-殼結構的枝化PEG衍生物并通過(guò)Boc保護Tris的氨基,使產(chǎn)物分子保留了活性官能團,為其進(jìn)一步的修飾反應提供了保障。產(chǎn)物分子通過(guò)紅外光譜分析、元素分析及分子量測定結果表明產(chǎn)物為目標分子。參考文獻:[ I ] Zalipsky s. Functionalized Poly( Ethylene Glycol ) for Preparation of Biologically Relevant Conjugatec[ J]. Bioconjugafe Chem. , 1995 , 6 :50 -165.[2] Roberts M J ,Benley M D , Harris J M. Chemistry for Peptide and Protein PEGylaion[ J]. Advanced Drug Delivery Reviews , 2002 ,54 :459 -476.[3] Palaparthy R , Wang H , Gulati A. Current Aspets in Pharmacology of Modified Henoglobin{J]. 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