聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶的HPLC法測定

中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(11)●1063 ●聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶的HPLC法測定劉英，邵妤，胡海峰*(中國醫藥工業(yè)研究總院上海醫藥工業(yè)研究院，創(chuàng )新藥物與制藥工藝國家重點(diǎn)實(shí)驗室，上海200040)摘要:建立了分子排阻色譜-高效液相色譜法測定聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶(PEG-1)。 使用凝膠色譜柱，以0.05 molL磷酸緩沖液(pH 7.3) : 甲醇(80 : 20)為流動(dòng)相，檢測波長(cháng)220 nm。PEG-1在0.2 ~ 1.2 mg/ml范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好?；厥章蕿?6.32%，RSD 為1.74%。關(guān)鍵詞:聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶:高效液相色譜:測定中圖分類(lèi)號: 0657.72文獻標志碼: A文章編號: 1001-8255(2014) 1-1063-03Determination of PEGylated Arginine Deiminase by HPLCLIU Ying, SHAO Yu, HU Haifeng*(State Key Lab. of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Instiute of Pharmaceutical Industr,China State Instiute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040)ABSTRACT: A size exclusion chromatography (SEC) -HPLC method was established for the determination of thePEGylated arginine deiminase (PEG-1). A gel column was used with the mobile phase of 0.05 mol/L phosphate buffer(pH 7.3) : methanol (80 : 20) at the detection wavelength of 220 nm. The calibration curve of PEG-1 was linear in therange of0.2- 1.2 mg/ml. The recovery was 96.32%, with RSD of 1.74%.Key Words: PEGylated arginine deiminase; HPLC; determination人體正常細胞和大多數腫瘤細胞均能利用瓜氨治療藥物。其基因已被克隆到大腸桿菌中表達，在酸轉化成精氨酸。Sugimura 等證實(shí)"，- - 些腫瘤細體外和實(shí)驗動(dòng)物中能有效抑制腫瘤細胞的生長(cháng)。1胞有營(yíng)養缺陷，不能利用瓜氨酸轉化成精氨酸，必的血清半衰期僅幾小時(shí)，在人體存在較強的免疫原須外源添加精氨酸才能在體外生長(cháng)。因此，應用精生。美國Polaris Group公司用聚乙二醇修飾1后，氨酸脫亞胺酶(1)耗竭血漿中精氨酸，是靶向治療血清半衰期延長(cháng)到7d,現已在進(jìn)行治療肝癌的III一些腫瘤疾病的有效方法。期臨床試驗。Wang等從關(guān)節炎型支原體Mycoplasma聚乙二醇化蛋白質(zhì)的含量測定一般采用Lowryarthritidis中克隆出一種1(2)，其活性在生理pH值法和HPLC法。Lowry法存在易受干擾、反應時(shí)間長(cháng)、下最高，Km值極低，而且不含二硫鍵，適宜用作某些試劑不穩定等缺點(diǎn)[3]。而HPLC法定量精確、重復性好4。本研究根據中國藥典2010年版三部收稿日期: 2014-02-08: 修回日期: 2014-08-22基金項目:國家重大科學(xué)儀器設備開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(2011YQ15007208)、附錄的HPLC法，參照《生物制品質(zhì)量控制分析方上海市經(jīng)信委引進(jìn)技術(shù)的消化吸收專(zhuān)題(12X1-09)法驗證技術(shù)審評- -般原則》以及人用藥品注冊技術(shù)作者簡(jiǎn)介:劉英(1977-)， 副研究員，碩土生導師，從事藥理學(xué)研究。要求國際協(xié)調會(huì )(ICH)Q2(R1)分析方法驗證，建Tel: 13801661101立了分子排阻色譜-高效液相色譜法(SEC-HPLC)E- mail: liuyingsipi@163.com通信聯(lián)系人:胡海峰(1967-)， 研究員，博士生導師，從事微生物測定PEG-1含量。藥物研究與開(kāi)發(fā)。1儀器與試藥Tel: 021-62892873中國煤化工E-mail: haifenghu88@ 163.comE2695型本心二進(jìn)樣器、柱溫箱、MYHCNM HG●1064.中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(11)2489型紫外檢測器和Empower3軟件(美國Waters公司)。2.64x10, r=0.999。 PEG-1 在0.2~ 1.2 mg/mlPEG-1對照品溶液(濃度1.2 mg/ml,峰面積歸- -化法濃度范圍內與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。最低定量限測得其純度為99.17%)和PEG-1溶液(批號20130708-1、(LLOQ)為20 μg/ml。20130708-2. 20130708-3， Lowry 法測得濃度分別為3.9、2.02.5精密度、重復性和回收率試驗和2.4 mg/ml)均為自制(5);緩沖體系均為0.05 mol/L磷酸取對照品溶液，連續進(jìn)樣6次，計算得峰面積緩沖液+0.145 mol/L 氯化鈉溶液(pH 7.0); 甲醇為色譜純,的RSD為0.50%。其他試劑均為分析純。取PEG-1共5份，按“2.1”項下方法處理，2方法與結果分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算得峰面積的RSD為2.1供試品溶液配制0.21%。將20130708-1、20130708-2 和20130708-3批向PEG-1中加入相當于80%、100%、120%次的PEG-1分別稀釋4、2和2倍后測定。含量的對照品，得到低、中、高濃度的溶液，各32.2色譜條件份，分別進(jìn)樣測定。由回歸方程求算待測樣品中的色譜柱YMC-Pack Diol-300型凝膠柱(8.0 mmxPEG-1并計算回收率，結果平均回收率為96.32%300 mm, 5 μm);流動(dòng)相0.05 mol/L磷酸緩沖液(n=9)，RSD為1.74%。(pH 7.3) :甲醇(80 : 20); 流速0.6 ml/min; 檢2.6穩定性和耐用性試驗測波長(cháng)220nm;分析時(shí)間30min;柱溫(30+2)C;取供試品分別于2~8 C和(25+2) C放置柱壓(500+10)psi;進(jìn)樣量10 μl.7d，于d1、 2、4、7分別取樣，稀釋后檢測。結果2.3系統適用性試驗PEG-1含量的RSD均小于1%，可見(jiàn)1經(jīng)PEG修PEG-1的相對分子量大于2.5x10',在本試驗飾后較穩定。條件下，保留時(shí)間約10.3 min,理論板數約1 000,2.7樣品測定峰形良好: 1的保留時(shí)間約15.5 min; PEG無(wú)紫外取供試品，按“2.1”項下方法處理，進(jìn)樣測吸收，不干擾測定。見(jiàn)圖1。定。以外標法計算，并折算稀釋倍數后，求得3批2.4線(xiàn)性試驗PEG-1溶液的含量分別為3.99、2.06 和2.47 mg/ml,取PEG-1對照品溶液，用0.05 mol/L磷酸緩沖分別為L(cháng)owry法測定值的102. 18%、102.85%和液(pH 7.3)逐步稀釋得到1.2、1.0、 0.75、 0.5 和102.71%。0.2 mg/ml的系列濃度對照品溶液，按“2.2”項下3討論條件分別進(jìn)樣。以濃度c為橫坐標，峰面積A為縱Lowry法檢測的是樣品中的蛋白質(zhì)總量，坐標，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程: A=1.17x10'c-PEG-1中可能存在未修飾的蛋白質(zhì);同時(shí)，PEG修0.32.AU0.24 I0.24-0.160.0808-0.00-0.08t/min'24-0.08E12 t/min1824 30ABA: PEG-1, B: 1圖1 SEC-HPLC 圖譜中國煤化工Fig.1 SEC-HPLC ChromatoguMHCNM HG中國醫藥工業(yè)雜志Chinese Joumal of Pharmaceuticals 2014, 45(11)1065●飾可能會(huì )影響肽鍵與試劑的結合，因此不能完全采1992, 2(3): 191-196.信Lowry法測定結果。SEC-HPLC系統中YMC-[2] Wang M, Basu A, Palm T, et al. Engineering an argininecatabolizing bioconjugate: biochemical and pharmacologicalPackDiol-300凝膠柱能夠較好地分離相對分子量characterization of PEGylated derivatives of arginine1x10*~ 1x10°的蛋白質(zhì)，且PEG無(wú)紫外吸收，本deiminase from Mycoplasma arhritidis [J]. Bioconjug Chem,法能更準確地檢測PEG-1。耐用性考察結果顯示，2006, 17(6): 1447-1459.流速、柱溫和檢測波長(cháng)在發(fā)生小變化的情況下，與[3]張雪梅,郭 橋,吳福泉，等.聚乙二醇化重組干擾索a2b .原條件相比，PEG-1 含量的RSD均小于1%，表明的質(zhì)量檢測[J].中國生物制品學(xué)雜志，2005, 18(1): 48-50.本法耐用性良好。[4] 王軍志 .生物技術(shù)藥物研究開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制[M].2版,北京:科學(xué)出版社, 2007: 81-84, 536-539.參考文獻:[5] Monstadt GM, Holldorf AW. Arginine deiminase from[1] Sugimura K, Ohno T, Kusuyama T, et al. High sensitivity ofHalobacterium salinarium. Purification and properties [J].human melanoma cell lines to the growth inhibitory activity ofBiochem J, 1991, 273(P3): 739-745.mycoplasmal arginine deiminase in vitro [J]. Melanoma Res,(.上接第1035頁(yè))表2不同提取方法樣品對EAC小鼠存活期的影響(土s，n=6)[1] 何迅,龐秀清,李勇軍,等。多指標綜合評分法優(yōu)選蒲薏Tab.2 Impacts of Samples with Diferent Extraction顆粒提取I藝[].中國現代應用藥學(xué), 2012, 29(1): 31-35.Methods on Survival Time of EAC Mice(ts, n=6)[2] 遲明艷,黃 勇，王愛(ài)民,等.蒲薏顆粒藥效學(xué)實(shí)驗研究[J].組別存活時(shí)間/d生命延長(cháng)率/%時(shí)珍國醫國藥, 2009, 20(9):2174-2175.荷瘤對照組13.0+6.8[3] 楊剛,杜守穎,吳清,等. HPLC法測定忍冬藤中綠原酸22.0+9.0"46.3樣品B18.8+10.024.8及咖啡酸含量[J].中國藥品標準, 2004, 5(4):47-50.樣品C20.4+7.1'35.7[4] 蔣曄.郝曉花,馮玉梅，等. RP-HPLC非水相測定牛黃解樣品D24.6211.3*毒軟膠囊中的大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量[J].中CTX組.23.0+8.2”52.8 .成藥, 2005, 27 (9): 1036-1038.注:與荷瘤對照組比較，"P<0.05, “P<0.01[s李海燕，宋漢敏，李振國.培元通腦膠囊質(zhì)量標準研究[D].3討論中國實(shí)驗方劑學(xué), 2013, 19(2): 129-132.由于中藥成分較為復雜，單一的化學(xué)成分難以[6] 秦建平,陸艷芹,羅雪磊,等. HPLC同時(shí)測定火麻仁中a-亞麻酸、亞油酸和油酸含量[J]. 中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志,代表整個(gè)處方的功效。故在蒲薏顆粒的工藝研究中，2012, 18(7): 71-74.根據本方的臨床用途，選擇藥材中的主要有效成分[7] 羅云，朱夢(mèng)良，趙海平，等.不同廠(chǎng)家六味地黃濃縮丸多作為化學(xué)指標，選用EAC小鼠生命延長(cháng)率作為藥糖含量比較[J].時(shí)珍國醫國藥, 2013, 24(2): 289 290.效學(xué)評價(jià)指標，以水提、水提醇沉、乙醇提取、醇[8]瞿葉清,陳軍,林愛(ài)華，等.馬錢(qián)子總生物堿復合磷脂脂水雙提4種方法提取，優(yōu)選出醇水雙提的提取方法,質(zhì)體的抗腫瘤作用研究[J].中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志, 2012,使其生產(chǎn)工藝更趨科學(xué)、合理。18(3): 143-145.S45-48 DMSO 提供甲巰基通過(guò)S、Ar反應得芳基甲硫醚Jones-氟(或氯)離去,得相應芳基甲硫醚,氟苯7例收率60%~ 81%，Mensah E等[Tetrahedron Lett, 2014, 55: 5323]氯苯3例收率21%~ 52%。對二硝基苯得4-甲硫基硝基苯收帶吸電子基(硝基、氰基、甲?；?的氟(或氯)苯在率80%。這是中國煤化I基的SsAr反應。N,N-二異丙基乙胺(1.0 eq)和水(1.0 eq)中,與DMSO加熱反應，[張清泉摘]MHCNM HG