熱變性和熱聚集對大豆分離蛋白溶解性的影響

106 2008, VoL 29, No. 07食品科字※基礎研究熱變性和熱聚集對大豆分離蛋白溶解性的影響葉榮飛，楊曉泉*，鄭田要，鄭恒光，朱建華，劉翀，司華靜(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院食物蛋白工程研究中心，廣東廣州510640)摘要:研究了溫度和濃度對大豆分離蛋白(SPI)溶解性的影響，并用SDS-PAGE電泳分析了其可溶部分中亞基的組成及聚集方式。結果表明，熱誘導大豆蛋白聚集生成了可溶聚集體，使得低濃度熱處理后完全變性的SPI具有良好的溶解性。關(guān)鍵詞:大豆分離蛋白:熱處理;溶解性;變性;聚集Effcts of Thermal Denaturation and Aggregation on Solubility of Soy Protein lsolatesYE Rong-fei, YANG Xiao-quan*, ZHENG Tian yao, ZHENG Heng guang, ZHU Jian-hua, LIU Chong, SI Huajing(Research and Development Center of Food Proteins, College of Light Industry and Food,South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)Abstract: The effects of tempetrature and concentration on the solubility of soy protein isolates (SPD) were studied, and thenthe subunit compositions and form of aggregation of soluble fractions obtained from trcated SPI were analyzed by SDS-PAGE.The results showed that the tally denatured SPI after thermnal treatment at low concentration bave good solubility due to formationof heatinduced soluble protein aggregates.Key words: soy protein isolates (SPD); thermal treatment; solubility; denaturation; aggregation中圖分類(lèi)號: TS201.7文獻標識碼: A文章編號: 1002-6630(2008)07-0106-03大豆分離蛋白不僅是一種蛋白含量高的大豆產(chǎn)品，脫脂豆粕山東新嘉華有限公司。.而且還因具有多種功能特性而廣泛應用于各類(lèi)食品。但所用化學(xué)試劑均為分析純。是，在大豆分離蛋白的生產(chǎn)中，熱殺菌、高溫噴霧干ECP3000三恒電泳儀北京六- -儀器廠(chǎng); 600E 蛋白燥等生產(chǎn)環(huán)節都會(huì )導致大豆蛋白發(fā)生不可逆的熱變性。純化系統美國 Waters公司; ALPHA-4冷凍F燥機日熱變性導致蛋白質(zhì)的解離，卷曲緊密結構的展開(kāi)和疏水本東京理化公司; TAQ100差示量熱分析儀美國 PE公基團的暴露。由于展開(kāi)分子的大量聚集，蛋白質(zhì)的變司: CS501超級恒溫水浴鍋.上海浦 東躍欣科學(xué)儀器性通常會(huì )引起溶解度的下降，從而影響其功能特性，限廠(chǎng); CR22G高速冷凍離心機日本日立公司;壓力滅制其應用"。但是，蛋白質(zhì)的變性不一定導致溶解性下菌鍋.上海博迅公司。降，國外已有研究表明(2]，在一定的條件下，大豆分.2 方法離蛋白即使是完全熱變性，也能具有高溶解性。.1.2.1SPI的制備)1熱處理條件下，大豆蛋白的熱變性、聚集與溶解低溫脫脂豆粕粉碎后過(guò)60目篩。豆粕粉按1:10的性之間關(guān)系的研究，對提高大豆分離蛋白的溶解性具有料液比加水攪拌，用1mol/L NaOH調pH至7.5,浸提重要的理論和實(shí)用價(jià)值。本實(shí)驗研究溫度和濃度對溶解2h后離心(8000X g, 20min, 4'C), 取上清液用1mol/L性及大豆蛋白亞基組成的影響，并選取2%的溶液研究HCI調pH至4.5,靜置0.5h后再次離心(5000 X g, 20min,了可溶部分的熱變性情況和聚集物的生成，以期為大豆4C)，棄去上清液，加水并用1mol/L NaOH調蛋白凝乳分離蛋白生產(chǎn)中的熱加工提供一定的理論指導。的pH至7.0,經(jīng)冷凍干燥后即得SPI.凱氏定氮法測得SPI的蛋白含量為88.6%。1材料與方法1.2.2SPI的熱處理SPI分散于蒸餾水中使其濃度(W/V)分別為2%、1.1材料、試劑與設備4%、6%、8%和10%，每個(gè)樣制備三份，磁力攪拌2h,然后分別在80^C(水浴)、100C(水浴)和120C(滅菌收稿日期: 2007-10-01基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(20776050);廣東省自然科學(xué)基金項目(07006508)作者簡(jiǎn)介:葉榮飛(1983-), 男，碩士研究生，研究方向為糧食油脂及植物蛋白。E-mail: yeyunfei1314@ tom.com※基礎研究食品科字2008, VoL 29, No. 07107鍋中進(jìn)行)加熱30min,迅速用冰浴冷卻5min,再經(jīng)高亞基(a'、a及β )通過(guò)非共價(jià)作用構成的三聚體(1。速分散均質(zhì)機分散后冷凍干燥。因為β -巰基乙醇可還原而斷開(kāi)二硫鍵，所以通過(guò)1.2.3溶解度的測定[41對比還原和非還原電泳圖可判斷亞基間是否有二硫鍵交.稱(chēng)取0.5g各干燥樣品(經(jīng)熱處理的SPI)，用蒸餾水聯(lián)。圖2顯示不同濃度的SPI溶液在80C下加熱30min定容至50ml,磁力攪拌2h后離心(12000 X g, 20min,后，其可溶部分的亞基沒(méi)有明顯變化，其中圖2(b)表明20C)。用凱氏定氮法測上清液(可溶部分)的蛋白含量。AB(分子量約為58kD)仍明顯存在。說(shuō)明AB之間的二硫上清液的蛋白含量與樣品蛋白含量的比值即為溶解度。鍵仍未斷開(kāi)。此現象與Petrucelli S的研究結果致1。綜合圖2(a)和圖2(b)分析，構成小聚集物和大聚集物的1.2.4SDS-PAGE電泳根據Laemmli U K的方法間，在不連續緩沖系統上亞基相互作用力以-硫鍵為主。-人聚集物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%和12%，考馬斯亮藍R-250染色。還原電泳樣品]小聚集物緩沖液中含10mmol/L β . 巰基乙醇，其他成分與非還原97kD67kDSDS-PAGE電泳緩沖液相同。參照1.2.3制備上清液，冷43kD-AB凍干燥后用于電泳分析。30kD) .1.25凝膠過(guò)濾|15參照1.2.3制備上清液，上樣量為5m1。采用14.4kD .Sepharose CL-6B 凝膠柱，洗脫液用Tris-HCl緩沖液1234567891011(pH7.5,含有0.1molL NaCI)。流速為1m/min,每3ml收集一管，收集的組分在280nm檢測。a.還原SDS-PAGE圖譜(添加β .巰基乙醇); b.非還原SDS-PAGE團譜1.2.6差示量熱掃描(DSC)(未添加β -巰基乙醇)。1 為Marker: 2為未熱處理的SPI: 3~7為參照1.2.3制備上清液，冷凍干燥后用于DSC分析。2%、4%、6%、8%和10%的SPI溶液在80C加熱30min后可溶部分稱(chēng)取2mg樣品放入鋁盤(pán)中，加入10 μ I磷酸鹽緩沖液(H7.0)的還原電冰圖譜: 8~11為2%、4%、6%和8%的SPI溶液在80C加使樣品混和均勻，參考盤(pán)為空鋁盤(pán)，掃描溫度范圍為熱30min后可溶部分的非還原電泳圖譜。到2 不同濃度的SPI溶液在80C加熱30nin后可溶部分的SOS PACE圖譜20~ 120C，升溫速率為10'C/min .Fig.2 SDS-PAGE pattems of soluble fractions obtained from2結果與分析different concentrations SPI themally treated at 80Cfor 30 min圖3(b)顯示，SPI 溶液在100C下加熱30min后，AB2溶解度測定已經(jīng)解離，表明在此熱處理條件下，AB之間的二硫鍵已斷開(kāi)。圖3(a)還顯示，當濃度在6%以上時(shí)，上清液即可100「溶部分中的B和β已不存在，但A、a' 和a還明顯存在。305100根據Yamagishi T等P用11S和7S來(lái)做的模型實(shí)驗結論可推s0 t測，此熱處理條件下A、a' 和a通過(guò)二硫鍵相互作用形基40成可溶性聚集物，而B(niǎo)和β形成了不溶聚集物。20 t10濃度(%，W/V)圖1不同濃度的 SPI經(jīng)不同溫度熱處理后的溶解度曲線(xiàn)Fig.1 Solubility profiles of dfferent concentrations SPI atterthermal treatments of dfferent temperatures圖1顯示不同濃度的SPI經(jīng)不同溫度熱處理后的溶解度曲線(xiàn)。在不同熱處理溫度下，溶解度隨著(zhù)濃度的增加而明顯下降。低濃度時(shí)顯示較好的溶解性，特別是78210112%的SPI分別經(jīng)80、100和120C熱處理30min后溶解度都在80%以上。a.還康SDS-PAGE圖譜: b.非還原 SDS-PAGE圖譜: 1 為未熱處理的2.2 SDS-PAGE 分析SPI: 2~6為2%、4%、6%、8%和10%的SPI溶液在100C加熱大豆蛋白主要由大豆11S球蛋白(lycinin)和7S球蛋白30min后可溶部分的還原電泳圖譜: 7~11 為2%、4%、6%、8%和(β -conglycinin)組成。11S 是一一個(gè)六聚體，它由六個(gè)酸性10%的SPI溶液在100C加熱30min后可溶部分的非還原電泳陽(yáng)譜。圖3 不同濃度的SPI溶液在10C加熱30min后可溶部分的SDS-PAGE圖譜亞基(A)和六個(gè)堿性業(yè)基(B)通過(guò)二硫鍵連接組成，這兩種Fig.3 SDS-PAGE patterns of soluble fractions obtained from亞基的分子量大約分別為38kD和20kD.7S是一類(lèi)由三種difterent concentratins SPI thermally treated at 100C for 30 min108 2008, VoL. 29 No. 07食品科字※基礎研究度相差不大，又因為上樣量相同，因此可確認熱處理后的SPI的第一個(gè)洗脫峰增加的主要原因是分子量較大的可溶聚集體的增加。.4 t第1.6-0.8 I0 60120180240300360420時(shí)間(min)a.還原SDS-PAGE圖贈: b.非還原 SD8-PAGE圖譜: 1~5 為2%、4%、6%、8%和10%的SPI溶液在120C加熱30min后可溶部分的還a.未加熱; .80C下熱處理: c.100C下熱處理: d.120C下熱處理。原電泳圖譜: 6~10為2%、4%、6%、8%和10%的SPI溶液在120圖6 SPI溶液(2%)在不同溫度下加熱30min后可溶部分的凝膠過(guò)濾圖譜C加熱30min后可幣部分的非還原電泳圖語(yǔ)。Fig.6 Gel fltration chromatograms of soluble fractions obtained團4不同濃度的 SPI溶液在120C加熱30min后可溶部分的SDS PAGEfrom SPI (2%) themally treated at dfferent temperatures for 30 min圉譜Fig.4 SDS-PAGE pattems of soluble fractins obtalned from3結論dfflerent concentations SPI themally treated at 120C for 30 min3.1 SPI 的溶解性隨著(zhù)熱處理時(shí)濃度的降低而明顯升如圖4所示，分離膠中各亞基帶顏色明顯變淺，而高。2%濃度的SPI經(jīng)不同溫度熱處理后，其溶解度均在濃縮膠項部有很明顯的聚合物形成。說(shuō)明該可溶部分能達到80%以上。主要由聚集物組成，構成聚集物的作用力不是疏水相互3.2 80C下熱處理時(shí)，SPI部分變性，11S中的AB未作用和二硫鍵，可能是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生了反應而通解離; 100C熱處理時(shí)，11S完全變性，AB解離，亞過(guò)共價(jià)鍵相連接[9]?；鵄可能與a'和a通過(guò)二硫鍵交聯(lián)形成了可溶聚集體，2熱變性分析.而B(niǎo)與B形成了不溶聚集體: 120C熱處理時(shí)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)可能發(fā)生了某種反應而共價(jià)連接。分析表明，熱誘導大豆蛋白聚集生成了可溶聚集體，使得低濃度熱77.4處理后完全變性的SPI具有良好的溶解性。95.1參考文獻:1] 王鳳翼，錢(qián)方大豆蛋白質(zhì)生產(chǎn)與應用[M].北京:中國輕工業(yè)出版社, 2004,0 7-81.405030100122 WAGNERJ R, SORGENTINI D A. Relaion between sobilill and溫度(C)surface hydrophobicity as an indicator of modifcaions during preparn-tion processes of commercial and lbonatory-prpared soy protin isolatcsa.未加熱; b.80C下熱處理; c.100C下熱處理: d.120C下熱處理。0 I Agric Food Chem, 2000 48: 3159-3165.團5 SPI 溶液(2%)在不同溫度下加熱30min后可溶部分的DSC圖譜31 王顯生不同亞基變異類(lèi)型的大豆分離蛋白凝膠質(zhì)構特性的研究辦FIg.5DSC thermograms of soluble fractions obtained from SPI中國糧油學(xué)報，2006, 21(3): 116-120.(2%) thermally treated at dfferent temperatures for 30 minsolbility and functional properties of commercial Boy protein isolatces如圖5所示，在未經(jīng)熱處理的SPI中，7S和11S的[D].J Agric Food Chem, 1991, 39: 1029-1032.LAEMMLIU KClavage of stuctural protcins during the ascmbly of變性溫度分別為77.4C和95.1C.2%濃度的溶液在80Cthe bead of beceriophage T4I], Neature. 1970, 227: 680-685.下熱處理30min后，其可溶部分的7S沒(méi)有吸熱峰，說(shuō)6 THANH v H, SHIBASAKI K. Major proteins of soybean seds.A明7S已完全變性，但11S的吸收峰還很明顯。而2%濃strightforward fractionation and their chansteriztio[n. J Agnic FoodChem, 1976, 24: 1111度的溶液在100C和120C下熱處理30min后，其曲線(xiàn)為[7] PETRUCCELI s. Thermal aggregation of soy protein iolntete[J.J一條直線(xiàn)，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)已完全變性。Agric Food Chem, 1995. 43: 3035-3041.8 YAMAGISHT, MTYAKAWA A, NODAN,eal. Ioluaioo and electo24 凝膠過(guò)濾色譜分析pboreic analysis of hea-induced products of mixes soybean 7S and 11S如圖6所示，與未加熱的SPI對照，熱處理后的globulins(J]. Agric Biol Chem, 1983, 47: 1229-1237.SPI的第一個(gè)洗脫峰顯著(zhù)增高。實(shí)驗測得未經(jīng)加熱的SPI9 WANG H, WANG T, JOHNSON L A. Effet of alkali on therefunctionalizatio of soy protein by hydrotbermal coking[]. J Am0il的溶解度為81.3%，與經(jīng)不同熱處理的2%的SPI的溶解Cbem Soc, 2005, 82: 451-456.