治療性抗體的改造

學(xué)分子生物學(xué)雜志,2006,3(4):245249 J Med Mol Biol,2006,3(4):245-249院士述評治療性抗體的改造沈倍奮軍事醫學(xué)科學(xué)院基礎醫學(xué)研究所北京市,100850沈倍奮,中國工程院院士,軍事醫學(xué)科學(xué)院基礎醫學(xué)研究所研究員,博士生導師。中國人民解放軍分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室主任?，F任中華醫學(xué)會(huì )副會(huì )長(cháng),中國發(fā)明家學(xué)會(huì )副理事長(cháng)。從事單克隆抗體和基因工程抗體的研究和應用多年,近年來(lái)與不同學(xué)科的專(zhuān)家合作致力于基于抗原一抗體相互作用的立體結構信息設計新功能分子的研究。在國內外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文200余篇,主編專(zhuān)著(zhù)4部?！菊渴袌?chǎng)上已有18個(gè)被FDA批準的單克隆抗體,它們用于治療如腫瘤、移植排斥、自身免疫病、病毒感染等人類(lèi)疾病。治療性抗體代表了生物制藥業(yè)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。隨著(zhù)技術(shù)的發(fā)展,各種形式的工程抗體被構建來(lái)改善它們的特性和效能,包括:鼠抗體人源化,提高生物學(xué)活性,如親和力成熟,改進(jìn)效應功能,改善藥代動(dòng)力學(xué)。文章評述了這一領(lǐng)域的最新進(jìn)展,同時(shí)也討論了工程抗體的免疫原性和親和力【關(guān)鍵詞】單克隆抗體;治療性抗體;基因工程抗體;抗體人源化【中圖分類(lèi)號】R392.116Improvement of Therapeutic AntibodiesInstitute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, 100850,ChinaAbstract] In the market, there are eighteen monoclonal antibodies approved by the FDA. Theyhave been used to treat human disease, such as cancer, transplant rejection, autoimmudisease..&tiviral prophylaxis and so on. The therapeutic antibodies represent one of the fastest growing areas ofthe biopharmaceutical industry. With the technology development, a diversity of engineered antibodyforms have been created to improve their characterization and efficacy, including humanization ofmurine antibodies, enhancing their biological activities such as affinity maturation, improvement ofeffector functions, and altering pharmacokinetics. This review summarized recent developments inthis field, also discussed the immunogenicity and affinity of engineered antibodiesKey words] monoclonal antibody; therapeutic antibody; engineered antibody; humanized anti-bod治療性抗體是可以用來(lái)治療疾病的抗體,因此中最重要的一大類(lèi),也是世界生物工程制藥業(yè)的支也稱(chēng)它們?yōu)榭贵w藥物。截至2005年5月,美國柱產(chǎn)品之一。FDA已經(jīng)批準18個(gè)抗體藥物,主要用于治療腫抗體作為治療性藥物已有上百年的歷史。當時(shí)瘤、自身免疫性疾病、病毒感染和器官移植時(shí)的排主要用抗血清進(jìn)行治療,由于其成分太復雜、多斥反應等。同時(shí)有100多種治療性抗體正在進(jìn)行變,而且是異源蛋白,在治療時(shí)會(huì )出現嚴重副作臨床試驗,500多種抗體處于臨床前研究。2003~用中國煤化工世,它是一種均一2004年抗體藥物銷(xiāo)售增長(cháng)48.1%,突破100億美性好CNMHG抗原決定簇的抗元。在以后幾年里,抗體藥物可能以更快的速度增體。1982年,Lewy制備了針對一個(gè)B淋巴瘤患者長(cháng),預計到2010年可達到300億美元2。從抗體瘤細胞的抗獨特型單克隆抗體,對該患者的治療取藥物的發(fā)展速度來(lái)看,目前它已成為生物技術(shù)藥物得很好的療效。這一結果引起了人們對單抗用于治沈倍奮.治療性抗體的改造療產(chǎn)生了極大熱情和期望,單抗被稱(chēng)之為“魔維結構確定抗體高變區中與抗原結合的關(guān)鍵氨基彈”。但事實(shí)并非如此,以后試用的一些抗腫瘤單酸,然后將這些決定特異性的關(guān)鍵氨基酸移植到相抗并沒(méi)有達到預期的效果。1986年,美國FDA批匹配的人抗體相應位置上。另一種常用的人源化方準抗CD3單抗OKT3用于抗移植排斥反應;1995法是表面重塑技術(shù),即鼠抗體框架區表面氨基酸的年,歐洲上市17-1A鼠單抗治療大腸癌。這些單抗“人源化”,通過(guò)鼠和人抗體可變區立體構象疊的臨床應用顯示出兩個(gè)方面的主要問(wèn)題:鼠抗體雖合比對,尋找合適的人抗體模板,將鼠Fv段表面然對靶抗原是非常特異的,但它不能激活相應的人暴露的框架區殘基中與人Fv不同者改為人源的氨的效應系統,如抗體依賴(lài)性細胞介導的細胞毒作用基酸,達到Fv的表面殘基人源化,使免疫原性降(ADCC)、補體依賴(lài)的細胞毒作用(CDC)等;此低,由于不影響Fv的整體空間構象,所以仍保留外,鼠抗體作為外源蛋白進(jìn)入人體,會(huì )使人體免疫與抗原的結合能力。系統產(chǎn)生應答,即產(chǎn)生人抗鼠抗體( human anti20世紀90年代,抗體庫技術(shù)的出現為抗體人mouse antibody,HAMA),而且異源蛋白在人體內源化和人源抗體的制備開(kāi)辟了新途徑41。該技很快被清除,即半壽期很短4。因此,人們利用術(shù)將PCR擴增、抗體片段在大腸桿菌中功能性表重組DNA技術(shù)來(lái)解決上述問(wèn)題561。達和噬菌體展示技術(shù)結合起來(lái),在體外模擬體內的抗體生成過(guò)程。具體是利用PCR方法將B細胞中1抗體人源化改造所有抗體基因釣出來(lái),克隆到載體上,使之表達于最早出現的人源化抗體是人-鼠嵌合抗體,將噬菌體表面,構建成噬菌體抗體庫,然后用抗原篩鼠抗體可變區基因片段連接到人抗體恒定區基因選出表達相應抗體的噬菌體,經(jīng)擴增、測序獲得特上,由于IgG類(lèi)型的抗體穩定性好,易純化和保異性抗體基因。如果B細胞來(lái)源于人外周血,則存,因此嵌合抗體通常用凵gG型。人lgG有4個(gè)亞可得到人抗體。也可以通過(guò)合成抗體庫獲得人抗類(lèi),其中IgCI和lgC3亞類(lèi)能結合補體,因此需要體。該技術(shù)基于對已有人抗體的序列信息進(jìn)行聚類(lèi)CDC效應來(lái)殺傷靶細胞的嵌合抗體采用IgCl型恒分析后,將可用的胚系基因及所有重排的序列進(jìn)行定區。一般嵌合抗體的人源化程度可達70%。分組,所有序列中95%以上可歸為14個(gè)亞組,其進(jìn)一步人源化的方法很多,最早是CDR移植,將中7個(gè)VH亞組、4個(gè)V和3個(gè)V亞組,亞組的鼠抗體的互補決定區( complementarity determining每個(gè)成員之間都有高度同源性。因此,可以設計、region,CDR)移植到人抗體的相應部位,這樣人合成14個(gè)亞組各自通用的基因,作為構建組合抗源化程度可達90%以上。但簡(jiǎn)單的CDR移植往往體庫的主干基因,然后與上述方法相似,用抗明顯降低抗原-抗體反應的親和力,甚至喪失與抗原從合成抗體庫中篩選出相應的抗體。原結合的能力。為了保留親本鼠抗體的親和力和特抗原表位定向選擇( epitope guided selection異性,一些支持 CDR loop構型的鼠郾g框架區氨基的人源化方法就是利用抗體庫技術(shù)進(jìn)行鼠抗體人源酸也應該進(jìn)行移植。隨著(zhù)計算機模建技術(shù)的發(fā)展,化的又一種方法。將鼠抗體的輕鏈或重鏈文庫蛋白質(zhì)晶體結構數據庫中抗體和某些抗原晶體數據與人抗體的重鏈或輕鏈文庫配對,構建成“人的增多,在抗體人源化改造時(shí),可以根據人和鼠鼠雜合抗體庫”,篩選與抗原結合的克隆,分離獲CDRs間結構相似性選擇人lg模板,挑選能支持移得人抗體的重鏈或輕鏈基因。再將它們與人的輕鏈植的鼠CDR與相應抗原結合的模板進(jìn)行人源化改或重鏈文庫混合,用抗原篩選,就能得到與抗原結造。最近,也有人提出框架改組( framework合的特異性人抗體。為了獲得高親和力的抗體,往shuffling)的方法進(jìn)行抗體人源化改造,主要是往需要大容量抗體庫。噬菌體抗體庫需要通過(guò)生物將鼠抗體的6個(gè)CDR區以正確的讀框融合到人Ig體轉化。受轉化效率的影響,一般庫容不大。而核胚系框架中構建成庫,用相應抗原篩庫。由于篩出糖體展示技術(shù)不需要通過(guò)體內轉化。因此,構建的的抗體框架來(lái)源于相匹配的CDR序列和結構,因抗體聲中可篩選高親和力此它保留了與抗原的最好結合,這種抗體接近于天抗體中國煤化工結構生物學(xué)、生物然的全人抗體。如果抗原也有晶體結構,則可以采信息CNMH體人源化的方法層用特異性決定基( specificity determining residues,出不窮。SDR)移植的方法2),該方法首先需要分析待改目前人源抗體的制備主要有4種技術(shù):EB病造抗體的結合位點(diǎn),或通過(guò)抗原-抗體復合物的三毒轉化人B淋巴細胞、人x人雜交瘤技術(shù)、抗體醫學(xué)分子生物學(xué)雜志,2006,3(4):245249 J Med Mol Biol,2006,3(4):245-249247庫技術(shù)(包括噬菌體抗體庫、合成抗體庫、核糖行隨機突變,然后篩選高親和力的突變體。幾種方體展示等)和轉基因動(dòng)物,有關(guān)內容已有多篇綜法結合起來(lái)可以大大提高抗體親和力22述2。據 DATAMONITOR分析,抗體產(chǎn)業(yè)化發(fā)23改進(jìn)抗體的ADCC或CDC效應展趨勢是:鼠源抗體到人-鼠嵌合抗體,到人源化在人類(lèi)的效應細胞上,存在幾種 FeaRs,它們抗體。特別是人源抗體,全人抗體的浪潮將在是FyRI(CD4)、FcyRⅡ(CD32)和FeyRⅢ2007年開(kāi)始121。(CD16)。FYRⅡ和FyRⅢ還有A、B2個(gè)亞型。2如何提高抗體的效應功能FcyRⅡA有2個(gè)天然的同種異型,FyRⅢA有3個(gè)同種異型,不同的受體和它們的亞型與IgG的親治療性抗體的作用機制有多種,主要可歸為兩和力是不同的,觸發(fā)抗體的效應功能也是不同的個(gè)基本類(lèi)型:一類(lèi)是依賴(lài)于它們的抗原結合功能,FRI以高親和力結合lgG單體,而FRⅡ和例如抗體與抗原結合后阻斷或中和靶分子的生物學(xué)FcRⅢ與LgG的親和力較低,只能有效地與多聚活性、利用抗體的靶向性,將細胞毒性物質(zhì)導向到免疫復合物反應。ADCC效應是通過(guò)抗體結合到靶部位、抗體與細胞膜抗原結合后誘發(fā)信號轉導的NK、MΦ等效應細胞表面Fc受體上,激發(fā)吞噬作改變,引起細胞凋亡等;另一類(lèi)除與它們的抗原結用或靶細胞裂解。而IgG與FyRs的相互作用依賴(lài)合能力有關(guān)外,還與抗體的Fc結構有關(guān),如激發(fā)于Fe區域的寡糖及在鉸鏈區和CH2區的某些氨基ADC和CDC效應,因此改進(jìn)抗體與FcRs結合酸殘基。最近報道從Fe的N-糖基化核上除去巖藻或與補體的結合,可以提高它們的治療效果。針對糖,可以大大改善與FyRs的結合,促進(jìn)ADCC活上述作用機制,對治療性抗體進(jìn)行改造2。性。低巖藻糖化的lgC顯示增加與FcyRⅢA的1改變抗體分子大小結合,ADCC活性也提高。2001年, Shields等完整抗體的分子量在150ku左右,很難穿透對人 IgGI Fc與FyRs及各亞型的結合部位進(jìn)行了血管進(jìn)入實(shí)體瘤,而且從體內清除也慢,一些抗體突變分析,確定了在S298AE333AK334A3個(gè)位片段如Fab、單鏈抗體(ScFv)、 Dibody、 Minibody置上都突變的突變體與FcYRⅢA的結合增加,相由于去除了抗體的恒定區或Fe,因此在體內較快應的ADC活性也增加。該突變體去巖藻糖后被清除,有較好的腫瘤/血液比( tumor// blood rati-ADCC活性進(jìn)一步增加,但這些均為體外實(shí)驗結o),它們適合于放射免疫顯像或放射治療3。為果,尚未被體內實(shí)驗證實(shí)。了增加抗體片段的穩定性,往往在輕、重鏈間引人CDC效應是依賴(lài)于補體成分Clqs與抗體鉸鏈連接肽( linker)或二硫鍵。連接肽的長(cháng)度和組成、區和CH2的結合,激發(fā)細胞的補體級聯(lián)反應系統二硫鍵的位置需要通過(guò)計算機輔助設計確定,以減殺死靶細胞。lgG恒定區的定點(diǎn)突變和結構域轉換少對抗體特異性、親和力和表達量的影響。最近,研究結果表明:CH2結構域對CDC的功能是非常ablynx公司提出納米抗體( Nanobody)的概念,重要的。據此, Indusogie等03用丙氨酸掃描突這是以駱駝抗體重鏈可變區為框架的抗體。它是人變技術(shù)研究了美羅華( Rituxan)的CDC功能,找gG分子的十分之一,穩定性好,制備容易。目前到CH2結構域中與Cq結合的位點(diǎn)Asp20,Lys2,已有3種納米抗體正在進(jìn)行臨床試驗23它們在空間結構上非常接近,進(jìn)2.2增加抗體親和力步又確定Clq結合區邊緣的二個(gè)氨基酸Lys和對于治療性抗體來(lái)說(shuō),抗體親和力的提高有助Gu3,經(jīng)改造可以增加與Clq的結合和CDC效于降低用量和毒副作用,此外也降低治療費用?？箲?。人Igl亞類(lèi)在A(yíng)DCC和CDC反應中是最有效體親和力成熟常利用噬菌體展示( phage display)的,因此適合構建針對病原體和腫癬細胞的治療性或酵母展示( yeast display)技術(shù),基本上可以分抗體。而人IgG4不能激活ADCC和CDC,適用于為兩大類(lèi):一類(lèi)是通過(guò)構建CDR或可變區隨機突顯像診斷和阻斷分子間相互作用。變的大容量庫,然后篩選出高親和力的突變體。也2.4改變抗體的藥代動(dòng)力學(xué)可以通過(guò)DNA改組( DNa shuffling)、鏈改組中國煤化工它與FeRn的結合( chain shuffling)).錯配PCR等方法提高抗體親和般CNMHG.4(血漿pH)時(shí)力;另一類(lèi)是模擬體內親和力成熟,構建集中突變不結合。通過(guò)對兩者結合位點(diǎn)的研究,改造lgG上或熱點(diǎn)突變的小容量庫,也可以在6個(gè)CDR每個(gè)與FcRn結合的部位,使之在pH6.0時(shí)結合增加位置上進(jìn)行單點(diǎn)突變,或在可變區的某些位置上進(jìn)而不是在pH7.4。此外,Dl' Acqua等發(fā)現在Fe248沈倍奮.治療性抗體的改造FcRn結合界面上252,254,256,433,434和436增加抗腫瘤效應。為了增強抗腫瘤作用,最近報道位引入突變能改善結合。Hnon等也發(fā)現TQ同時(shí)用2個(gè)不同的細胞因子,如I2和I-12,或和ML2個(gè)突變體分別使與FRn的結合增加3I4和GM-CSF,它們可以串聯(lián)在抗體重鏈的C和7倍。同時(shí)突變2個(gè)地方,則結合增加28倍。端,或一個(gè)細胞因子融合在抗體重鏈或輕鏈的C在恒河猴體內,ML或TQML突變體顯示血端,另一個(gè)融合在N端。體內外實(shí)驗模型上顯示漿半壽期增加2倍。改變抗體藥代動(dòng)力學(xué)的另一種出增加了抗腫瘤效果,但這么大的分子在體內能否方法是PEG修飾,它可以降低免疫原性、增加抗進(jìn)人實(shí)體瘤還需要評價(jià)。最近報道細胞因子-抗體在體內的半壽期、提高穩定性、改變抗體的分布HER2融合蛋白在體內可以提高HER2胞外段蛋白(如:從血漿進(jìn)入間質(zhì))組成的疫苗的反應,提示融合蛋白的一種新用2.5引入新的效應功能途裸抗體的效應功能是有限的,而且有些個(gè)體由于FyRs的多態(tài)性,對ADCC效應不敏感,因此需3抗體改造中幾個(gè)有爭議的問(wèn)題要考慮通過(guò)交聯(lián)或融合引人細胞毒性物質(zhì),例如:31鼠抗體人源化放射性同位素、藥物、毒素、細胞因子等。已被治療性抗體的免疫原性是影響它廣泛應用和重FDA批準的 Mylotarg就是抗CD33抗體與 caliche-復應用的主要問(wèn)題,但人源化程度達到多少算可mycin的交聯(lián)物,用于白血病治療,這種情況下抗以?全人抗體一定優(yōu)于人源化抗體或嵌合抗體嗎?體分子僅起靶向作用對此有不同的看法。 Clark等3對一些人源化抗體2.6雙特異性抗體和全人抗體的序列進(jìn)行分析,發(fā)現兩者沒(méi)有明顯差雙功能抗體可以結合2個(gè)不同的抗原表位,大異,而對人體的免疫原性是受很多因素影響的。除多數情況下是2個(gè)不同的抗原。早期的雙功能抗體了可變區序列、I類(lèi)型、抗體的糖基化情況外,抗原結合部位是針對腫瘤相關(guān)抗原,另一個(gè)是還有一些因素,如給藥方式(靜脈、皮下、肌肉靶向T細胞上的CD3分子或FcYR,促使免疫系統注射)、給藥次數、給藥劑量、患者狀態(tài)、抗體特的效應細胞殺傷腫瘤細胞,例如:抗CD30×抗異性和靶抗原的性質(zhì)等。這些影響抗體免疫原性的FeyRⅢ、抗CD30×抗FyRI雙功能抗體治療非因素要比Ⅴ區序列更重要。 Clark等同時(shí)指出,何杰金氏淋巴瘤,抗HER2×抗FyRI雙功能抗身免疫病的存在說(shuō)明人體免疫系統能對自身蛋白體治療乳腺癌。最近又有一些新的雙功能抗體出產(chǎn)生免疫反應,所以全人抗體完全不會(huì )產(chǎn)生免疫反現,它們一個(gè)結合部位是針對高親和力的IgA應的推斷是不正確的。 Hwang等收集了44個(gè)鼠FcaRⅠ,CD89),體內外實(shí)驗結果顯示:靶向抗體、15個(gè)嵌合抗體、22個(gè)人源化抗體和3個(gè)全FcRI不僅抗腫瘤的效果與FyRI雙功能抗體一人抗體在人體上的免疫反應,以小于2%的人有反樣好,而且對某些效應細胞(如粒細胞),FcRI應為可忽略( negligible)的免疫原性,以2%-15雙功能抗體更有效3。%有反應為可耐受( tolerable)的免疫原性,大于2.7抗體-細胞因子融合蛋白15%有反應為顯著(zhù)( marked)免疫原性。接受鼠細胞因子能有效激活免疫細胞,如:單核細抗體的44人中84%有顯著(zhù)HAMA反應,7%的人胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹(shù)突狀細胞、T細出現可耐受的免疫反應,9%的人不出現免疫反胞和B細胞。但同樣會(huì )引起嚴重的副作用。如果應。在接受嵌合抗體治療的15名患者中,有顯著(zhù)能將它們集聚在靶部位,就可以降低細胞因子治療免疫反應是40%,可耐受的免疫反應是27%,33時(shí)的系統性毒副作用?？贵w-細胞因子融合蛋白就%的患者沒(méi)有免疫反應。在接受人源化抗體治療的是利用抗體的靶向性達到上述目的的。各種細胞因22名患者中,9%有顯著(zhù)免疫反應,36%有可耐子可以連接到完整抗體或單鏈抗體的N端或C端。受的免疫反應,55%沒(méi)有免疫反應。目前上市的抗體-Ⅱ2融合蛋白在小鼠模型上顯示出抗各種腫全人抗體只有1個(gè).但已經(jīng)觀(guān)察到有免疫反應出瘤的效果,不僅腫瘤縮小,而且能降低腫瘤轉現中國煤化工非完全沒(méi)有免疫原移。它們的抗腫瘤效應可能來(lái)自于浸潤的效應性,CNMH例減少細胞的激活,如果存在 IgG Fc,則有可能通過(guò)細胞3.2抗體親和力因子受體和FcYR,這樣不僅細胞因子激活免疫細抗體親和力是抗體的特性參數,從應用角度人胞,而且可同時(shí)提供FYR引起的ADCC,進(jìn)一步們更關(guān)注抗體的親合力( avidity)。親合力很大程醫學(xué)分子生物學(xué)雜志,2006,3(4):245249 J Med Mol Biol,2006,3(4):245-249249度與靶組織上抗原的性質(zhì)、密度有關(guān),也與抗體治hol,2001,12[19 HANES J, JERMUTUS L, WEBER-BORNHAUSER S, et al. 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