甲氧基聚乙二醇修飾改造RhD(+)血型的初步研究

654●中國實(shí)驗血液學(xué)雜志Journal of Experimetal Hemaology 2003; 11(6):654 - 658文章編號(Aricle ID):109 . 2137(2003)06 - 0654- os.●論著(zhù).甲氧基聚乙二醇修飾改造RhD( + )血型的初步研究李立立，王捷熙,檀英霞,章?lián)P培軍事醫學(xué)科學(xué)院輸血研究所,北京100850摘要Rh血型與ABO血型-樣是重要的血型 系統, Rh血型不符會(huì )引起嚴重的輸血反應及新生兒溶血病。中國.人群中RhD陰性血型的比例僅為0.2% - 0.5%,將RhD陽(yáng)性紅細胞改造成RhD朗性紅細胞在臨床輸血中有重要的意義。本研究用4種不同端基的甲氧基聚乙二醇(mPEG),修飾A型.B型.AB型和o型的RhD(+ )紅細胞,比較4種mPEG衍生物對RhD抗原的修飾效果。同時(shí)觀(guān)察mPEG修飾對紅細胞形態(tài)結構和功能的影響。結果表明，mPEG BTC(苯并三唑雞基PEC)較其他3種PEG的修飾效果好,在1 mmol/L時(shí)可以有效地遮藏紅細胞表面RhD抗原,而對紅細胞形態(tài)滲透脆性、自身溶血、乙酰膽堿酯酶、膽因醇、ATP.2, 3-DPG;含量以及變形性無(wú)影響。結論:初步實(shí)現了將RhD( + )紅細胞修飾改造成RhD( - )紅細胞的目的。關(guān)鍵詞甲氧基聚乙二醇; RhD血型;血型改造中團分類(lèi)號R457.11文獻標識碼Preliminary Study on Conversion of RhD Positive Red Blood Cells to RhDNegative by Modification with Methoxy Polyethylene Glycol1.I LiLi, WANG Jie-Xi, TAN Ying Xia, ZHANG Yang-PeiInstinte of Blood Transfusion, Academy of Military Medical Sciences, Bejing 100850, ChinaAhstractRh is a very important blood group like ABO blood system in transusion mdicine. It causes severetransfusion reaction and hemolytic disease of the newbom (HDN) if RhD blood group does not match between the donorand the reipient. The population of RhD negative is only about 0.2%一0. 5% in Chinese. Conversion of RhD pesitiveRBCs to RhD negative is very important in clinical transfusion. This study was to try to modify RhD antigen located onthe surface of A, B,0 and AB red blood cells in order to convert RhD positive to RhD negative by the modification of fourkinds of methoxypolyethylene glycol ( mPEG) derivatives and to observe the effect of mPEG modification on cellmorphology，structure and function. The result demonstrated that modification fficiency of mPEG-BTC ( mPEG-benzotriazole carbonate) was better than other three kinds of mPEG derivatives. It could camouflage RhD antigenefficiently when the concentration reached to 1 mmol/L. The result also showed that there were no harmnful efs ofmPEG modification on cell morphology, asmotic fragilty, hemolysis, AchE, cholesterol, ATP, 2, 3-DPG anddeformability. It is suggested that succes in convering RhD positive RBCs to RhD negative was preliminarily achieved.Key words nethoxy polyethylene glyool; RhD blood group; blood group conversionJ Exp Hemaol 2003; 11(6):654 - 658Rh血型系統自1939年被發(fā)現以來(lái),因導致新生兒.薩克族、錫伯族、烏孜別克族和柯?tīng)柨俗巫逯?，Rh陰溶血病(HDN)、溶血性輸血反應而成為紅細胞中僅性約占5%,高于國內其他民族;而漢族人Rh陰性次于A(yíng)BO血型的重要血型系統。Rh血型系統主要僅占0.2% -0.5% 2]由此可以看出,我國漢族人抗原有RhD, RhCe, RhEe, 其中RhD抗原性最強，Rh陰性血的比例遠小于白種人和黑人。Rh陰性血50% - 75% Rh陰性個(gè)體通過(guò)輸血和妊娠,可受D的供應長(cháng)期存在不足,在出現大量傷員(如災害、戰抗原紅細胞免疫而產(chǎn)生抗D。給RhD陰性人輸用爭)及一些大型的國際交流活動(dòng)(如奧運會(huì ).世博會(huì ))D陽(yáng)性血200ml,85%產(chǎn)生抗D"。如果將RhD陽(yáng)時(shí),對Rh陰性血的需求會(huì )大大增加。因此,將RhD性血輸給已產(chǎn)生抗D的人,可能產(chǎn)生危及生命的溶(+ )血改造成RhD(- )血有重要的政治、軍事意血性輸血反應。義。Rh血型中的D抗原具有較大的臨床意義,因此在常規檢查中一般只鑒定RhD陰性和陽(yáng)性。在基金項目:國家973課題，編號202CB713804白種人中, Rh陰性約占15%;在黑人中約占4%;在通訊作者;章?lián)P培,教授,博土生導師.電話(huà): (010)66931545. Enail: zhaneyp@nic.' bmi. a. cn蒙古人種中不到1%。居住在新疆的維吾爾族、哈2003中國煤化工YHCNMHG甲氧基聚乙二醇修飾改造RhD(+ )血型的初步研究在本課題中研究了4種攜帶不同端基的甲氧基mPEG修飾對紅細胞結構功能的影響聚乙二醇(mPEG)對RhD( + )血型抗原的修飾效果取mPEG修飾前后的紅細胞, 37保溫48小時(shí),檢及其對紅細胞形態(tài)、結構、功能的影響,以期將RhD測上清液在540nm處的光吸收值,計算紅細胞的(+)改造成RhD(-),從根本上解決臨床輸血對自身溶血率;紅細胞懸液10 μl加入1.25 m!的RhD( - )血型紅細胞的需求。0.32%-0.64%的NaCl梯度溶液,判斷紅細胞的滲透脆性是否發(fā)生變化;乙酰膽堿酯酶(AchE)活性材料與方法用微量羥胺比色法檢測;異丙醇氯仿抽提紅細胞膜脂質(zhì)，膽固醇與FeCl,可生成紫紅色膽固醇~鐵復合血液標本采A型RhD(+),B型RhD(+),AB型RhD(+),0.物，在560nm處比色,確定紅細胞膜膽固醇含量;型RhD( + )志愿獻血者外周靜脈血,肝素抗凝,生紅細胞ATP用試劑盒(Stock no. fl-asc blolumines-理鹽水洗旅,獲取紅細胞, CPDA-1保存液4C保存。cent somatic cell assay kit, Sigma) 測定;紅細胞2, 3-DPG含量用試劑盒(Diagnostics, 2, 3-dpg, proce-不同端基PEG衍生物dure no. 665, Sigma) 測定;紅細胞懸浮于4%聚乙烯mPEG BTC( mPEG benzotriazole carbonate)(苯并三吡咯烷溶液中,用紅細胞變形儀(techiconekta.唑端基PEG)(20 kD); mPEG ALD (mPEG propi-cytometer)測定紅細胞變形性。onaldehyde)(丙醛端基PEG)(20 kD); mPEG2-NHS統計學(xué)方法(mPEG2-N-hydroxysuccinimide) (N羥基琥珀酰胺應用SAS6.0統計軟件進(jìn)行方差分析,數值以平均酯端基PEG)(20 kD); mPEG-MAL( PEG maleim-值土標準差(元士s)表示。ide)(馬來(lái)酰亞胺端基PEG)(20 kD)。上述衍生物均購自Shearwater公司(USA)。結果PEG修飾紅細胞生理鹽水洗滌紅細胞3次,用PBS等滲液(pH 8.0)mPEG修飾紅細胞RhD抗原性調整壓積到12%。加入不同濃度mPEG,其中人RhD(+)的A型B型、AB型和0型紅細胞與抗mPEG BTC(用pH 8.0的PBS溶解)終濃度分別為_(kāi)D單抗反應發(fā)生凝集。mPEG BTC修飾后的紅細0,0.2,0.5, 1.0 mmol/L, 25C反應1小時(shí); mPEG-胞隨著(zhù)mPEG濃度增加,凝集反應逐漸臧弱,依度ALD(用pH 8.0的PBS溶解)終濃度分別為0,0.5,達到0.5 mmol/L時(shí)與抗_D單抗反應消失。mPEG-1.0, 3.0 mmol/L,并加入占反應體積1:10的硼氰化ALD, mPEG2-NHS, mPEG-MAL雖然隨著(zhù)濃度增鈉(NaCNBH3), 25個(gè)分別反應1, 6, 12小時(shí);加，凝集反應也逐漸減弱,但直到4.0, 6.0 mmol/LmPEG2-NHS(分別用pH8.0的PBS和pH8.0的.時(shí),凝集反應仍未完全消失(表1)(顯微鏡觀(guān)察xHEPES溶解')終濃度分別為0,2,4, 6 mmol/L,10),提示mPEG BTC對RhD( + )的修飾效果最好,25C和4C分別反應1, 6, 12小時(shí);mPEG-MAL(pH可以有效遮蔽RhD(+)抗原，將RhD(+)血型改造8.0的PBS溶解)終濃度分別為0, 2, 4, 6 mmol/L,成RhD(- )血型。25C和4C分別反應1,6,12小時(shí)。反應完后,用生抗_D單抗( Immucor, USA)為IgM類(lèi)抗體,而理鹽水洗滌3次,并調整壓積到45%,4C放置。天然的RhD抗體為IgG類(lèi)抗體,用IgG類(lèi)抗ID多mPEG修飾對紅細胞RbD抗原性的影響克隆抗體( Immucor, USA)及羊抗人lgG( Immucor,mPEG修飾紅細胞后對紅細胞RhD血型抗原的遮USA)與上述0.5, 1.0 mmol/L mPEG-BTC修飾的蔽效果通過(guò)凹形血型鑒定卡、間接抗人球蛋白實(shí)驗紅細胞及對照組紅細胞進(jìn)行間接抗人球蛋白(IAT)(IAT)來(lái)檢測(1。實(shí)驗,以檢測修飾后的紅細胞表面是否還存在弱滴度的RhD抗原。顯微鏡觀(guān)察(X 40)說(shuō)明, 0.5mPEG修飾對紅細胞形態(tài)的影響在顯微鏡下觀(guān)察mPEG修飾紅細胞。用戊二醛固mmol/L時(shí)仍有凝集發(fā)生, 1. 0 mmol/L時(shí)無(wú)凝集。.定紅細胞,原子力顯微鏡( SPM-9500J3, SHIMAD-這表明經(jīng)1.0 mmol/L mPEG-BTC修飾的紅細胞表面已檢測不出RhD抗原(圖1)。zU, JAPAN)觀(guān)察紅細胞形態(tài)S。中國煤化工MYHCNMHG656中國實(shí)驗血液學(xué)雜志J Exp Hemutol 2003; 11(6)Table 1 Comparison of the mditication efets of four kindsmPEG on RhD antigenmPEG對紅細胞結構功能的影響mPEGreaction conditionconcentration對mPEGBTC修飾后的紅細胞進(jìn)行結構功能檢測(mmoVL)Anti-D表明:修飾前后,紅細胞的滲透脆性、自身溶血、乙酰膽堿酯酶活性、膽固醇含量、ATP、2, 3-DPG以及變mPEG-BIC25t 1h4+pH 8.0 PBS dsolutio0.2+形性均無(wú)顯著(zhù)改變,說(shuō)明mPE(- BTC修飾對紅細胞的結構及攜氧功能、變形力沒(méi)有影響(表2)。0.51.00討論mPEG-ALD 25T 1- 12h"0.PEG的基本結構是HO (CH2(H2O)。CH、CH2OH,plI 8.0 PBS disolution是一種無(wú)毒、低免疫原性的化合物，可用于體內,NacCNBH3PEG修飾的白蛋白己經(jīng)被美國FDA批準用于臨mPEG2-NIS 25t: 1- 12h'床[6]。Jeongh'" 及Hortinl 等在1996年首次報道pH 8.0 PBS dssolution了將PEG用于修飾紅細胞以遮蔽紅細胞表面血型σr4C 1-12h"抗原。隨后,不少作者進(jìn)行了PEG修飾紅細胞的實(shí)pH8. 0 IEPES dssdus驗[9 14)。 大部分實(shí)驗結果表明PEG修飾紅細胞以mPEG2-MAL 25t 1- 12h'后,可以遮敞紅細胞的血型抗原。Hortin["4I 和Hu-pH 8.0 PBS dssalutioangl5]的實(shí)驗表明，紅細胞經(jīng)過(guò)修飾以后在小鼠體or4C 1- 12h*內的存活時(shí)間減短,紅細胞離心容易破碎及溶血。pH8.0 PIS dsuionnFisherl31的實(shí)驗又顯示PEG修飾后并沒(méi)有完全遮蔽紅細胞的血型抗原。作者的實(shí)驗室曾用氰脲酰氯* ; 12 hours incubation resulus. 4 + : complete agglutinabiliy. 2 +50% aglulinabiliy. 1 + ": less than 5% aglutinobility. 0: no agglu-活化的PEG(C-mPEG)(5 kD)修飾AB型RhD( + )tinabilits紅細胞,當CmPEG濃度達到12. 0 mg/ml時(shí)，紅細胞抗原性大大減弱,形態(tài)、結構.功能不受影響,但濃mPEG修飾對紅細胞形態(tài)的影響度較高會(huì )使小鼠紅細胞壽命明顯縮短"61。1.0 mmol/L mPEG-BTC修飾紅細胞形態(tài)正常,進(jìn)一為了降低修飾紅細胞所需的濃度,尋找更適合步用原子力電鏡觀(guān)測mPEG-BTC修飾的紅細胞呈用于人體的PEG,我們選擇了mPEG-BTC, mPEG-典型的雙凹圓盤(pán)狀(圖2)。0 mmol/L0.5 mmoLL1.0 mmol/L.Figure 1 IAT test of mPEG-BTC-modifhed RhD(+ ) RBCs中國煤化工MHCNMHG甲氧基聚乙二醇修飾改造RhD( + )血型的初步研究657●的1010201.00001博00.001.期017開(kāi)D網(wǎng)INm 5相明0.000 mmol/L1.0 mmol/LFigure 2 Morphology of RBCs before and after mPEG-BIC moditication obsered by Atomic Force microscopeTable2 Eftetes of mPEG-BTC modincation on cell sructur, function and deorombillyParameter0 mmol/I.0.5 mol/L1.0 mmol/I.Osnotic fraglit( %)0.460.44Hemolysis( %)2.45士0. 377#1. 91 +0.0361. 52+0.071AchE( umol)0.754土0.0220.789土0.0570.782士0.146Cholesterol° (%)100110.33+ 18.23103.73土15.736ATP( x 10-8 mo/50 μl RBC)2.55+0.211.72+0. 19.2.04土0.252,3-0PG*(%)110.72土13.9599.43+5.89 .DhMux0. 6413 t 0.0170.6852土0.0070.6607 t 0.025#: Nornal range +SD. * : Relative contentAI.D, mPEG2- NHS, mPEG MAL,其中mPEG-BTC驗結果說(shuō)明mPEGBTC修飾對紅細胞結構和功能與紅細胞膜上的氨基反應,形成氨基甲酸酯的穩定均無(wú)影響,我們初步實(shí)現了將RhD(+)血改造成連接;mPEGALD是醛基的mPEG術(shù)生物,與胺類(lèi)RhD( - )血型的目的。反應; mPEG2-NHS 是分枝的mPEG衍生物;mPEGMAL與紅細胞膜上的巰基反應。4種參考文獻mPEG衍生物分子量均為20 kD。實(shí)驗表明, 4種不.同端基的mPEG以mPEGBTC遮蔽紅細胞表面. 李勇,楊貴珍. RH血型系統.見(jiàn)李勇,楊貴珍主編.人類(lèi)紅RhD抗原的效果最好，可將RhD( + )紅細胞改造成細胞血型學(xué)實(shí)用理論與實(shí)驗技術(shù).北京:中國科學(xué)枝術(shù)出版社，1999:73-92RhD(- )。我們還對mPEG BTC修飾的紅細胞進(jìn)行了形2趙桐茂RH血型.見(jiàn)趙桐茂主編.人類(lèi)血型遺傳學(xué)。北京;中國科學(xué)技術(shù)出版社, 1987:91- 109態(tài)及結構功能的檢測。滲透脆性、自身溶血和膽固醇指標反映了紅細胞膜完整性。其中滲透脆性是觀(guān)3 Hortin GL, Iok HT, Huang sT. Progres towerd preparation ofuniversal donor red cells. Arif Cells Blod Substit Immcbi Biotcch.察紅細胞在不同濃度鹽水中的溶血程度,判斷其對nol, 1997; 25: 487 - 491低滲鹽水的抵抗力，與紅細胞表面積和體積比值有4童軍,楊明.紅細胞血型鑒定.見(jiàn)李勇,楊貴珍主編.人類(lèi)紅關(guān);自身溶血說(shuō)明紅細胞膜是否有缺陷,如果膜缺陷細胞血型學(xué)實(shí)用理論與實(shí)驗技術(shù).北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社,會(huì )表現為溶血程度增加;膽固醇含量是膜的流動(dòng)性1999:279 - 288的重要指標,膽固醇含量增加則膜流動(dòng)性降低;ATPs Ouerghi O, Toohani A, Othnane A. et al. Investigting specilice和2,3 DPG是紅細胞代謝中間產(chǎn)物,也是反映RBCantigen/antibody binding with the atormic force microscope. Biomol攜氧能力最重要的指標;DImx反映紅細胞的最大變Eng, 2002; 19:183- 188形指數,說(shuō)明紅細胞變形通過(guò)毛細血管的能力。實(shí)5 Se中國煤化工er b sbsiurte amYHCNMHG658●中國實(shí)驗血液學(xué)雜志J Exp Hemaol 2003; 11(6)tigenically inert erythroeytes. In: Winslow RM，Vandegriff KD,tional consequences of antigenic modulation of red cells with me-Intagletta M (eds). Advances in Blood Substitutes: Industrial Opthoxypoly (ethylene giycol). Blood, 1999; 93:2121 - 2127portunities and Medical Challengcs. Boston: MA Birkhauser, 1997:133-15012 Scott MD, Murad KL, Koumpours F, et al. Chemicel eamoulgeof antigenic detemninants: tealth erythrocytes. Proc Natl Acad Sxi7 Jeong ST, Byun SM. The derase of egutinablity of buman ABUSA, 1997; 94:7566 - 7571type red blood cell by attechment of methoxy-polyethylene glyool.Art Cells Blood Substit Immobiol Biotechnol, 1996; 24: 358 (ab-13 Fisher TC, Arnstong JK, Miselman HU, et al. Polyethylene gly-col coating of red blood clls strongly inhibis agglutination but doesnot produce clls that are antigenically "slient" Transfusion, 1997;8 Hortin GL, Lok HT, Huang sT. Progress toward preparation of37: 885 (abstract)universal donor red ells. Artif Cels Blood Substit Immobil Biotech-nol, 1996; 24:351(abstract)14 Hortin GL, Huang ST: Surface-pegylaied red cells as potential uni-versal donor red cll. Blood, 1996; 88; 181a(S1), part 1 (ab-9 Jeng ST, Byun SM. Decreased agglutinability of methoxy polyeth-stract)ylene glycodl atached red blood ells: Significance as a blood sub-stitue. Art Cells Blod Substit lmmobiol Biotechnol, 1996; 24:50315 Huang ST. Hortin GL, Huwng 2. Coating of red blood cells with- 511cosslinked polyethylene glyol (XPEG ) inhibits agglutination andshows faworable red cell survival. Transfusion 1998; 38; 62S (ab-10 Armstrong JK, Meiselman HJ, Fisher TC. Covalent binding of poly(ethylene glyco) (PEG) to the surface of red blood clls inhibits嘔gregation and reduces low shear blod viscosity. Am J Hematol,16季守平,劉澤澎,任會(huì )明等，甲氧基聚乙二醇遣蔽紅細胞表面抗1997; 56:26 - - 28原制備通用型血液的初步研究.中國輸血雜志，2000; 13.223 -2611 Murad KI. Mahany KL, Brugnan C, et al. Structural and func-中國煤化工MYHCNMHG