RNA干擾技術(shù)的應用

綜述·200年11月第45卷第20期RNA千擾技術(shù)的應用應彩云1鐘鳴2(1南方醫科大學(xué)第一臨床醫學(xué)院2004級醫學(xué)影像學(xué)專(zhuān)業(yè);2南方醫科大學(xué)基礎醫學(xué)院2004級醫學(xué)檢驗(醫學(xué)實(shí)驗技術(shù))傳專(zhuān)業(yè)廣州520515)[摘要]RNA干擾是自然界生物中廣泛存在的一種保守的自我保護現象。隨著(zhù)對RNAi發(fā)生機制的深入研究RNA正作為一種成熟的技術(shù)被研究工作者廣泛應用于功能基因組的研究,如基因功能的檢測、基因治療腫瘤多藥耐藥研究、藥物開(kāi)發(fā)等。[關(guān)鍵詞]RNA干擾;雙鏈RNA;RNA降解;基因治療;腫瘤多藥耐藥中圖分類(lèi)號R392-3[文獻標識碼]A[文章編號]1673-9701(2007)20-152-03RNA( RNA interference,NAi)干擾是指在生物體細胞內由種ATP結合蛋白(ATP- binding cassette,Bc)轉運體有著(zhù)密切于外源性或內源性雙鏈RNA誘導體內產(chǎn)生序列特異的RNA關(guān)系。2006年, Parker等報道,RDE4是RNAi干擾產(chǎn)生過(guò)程降解的自然現象,是自然界生物中廣泛存在的一種保守的自我中的另一個(gè)必需蛋白,RDE4D的二聚體對細胞內出現的內源保護現象。RNA干擾技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種基因研究工性或外源性長(cháng)的dsNA具有高度的親和力并可以?xún)?yōu)先結合到具,被廣泛地用于功能基因組的研究,如基因功能的檢測、基因 dsrNa上。利用特異的抗體將RDE4進(jìn)行免疫沉淀,檢查治療腫瘤多藥耐藥研究和藥物開(kāi)發(fā)等。RNAi產(chǎn)生的主要原因RDE4的免疫沉淀復合物時(shí)發(fā)現,RDE4的免疫沉淀復合物是:在大多數的生物細胞內,由于外源性或內源性雙鏈RNA中只有dRNA的存在,并沒(méi)有檢查出 siRNA的存在,因此,( Double stranded RNA, dsrna)的存在,在多種酶的作用下,RDE4在 siRNA介導的基因沉默的后續過(guò)程中并非必須產(chǎn)生與dRNA的序列相特異的mRNA分子降解使目的基因的的,可能只起到優(yōu)先結合并傳遞 dsrNa給Dcer酶的作用,但表達量降低甚至消失,但并沒(méi)有破壞或改變原來(lái)的目的基因,關(guān)于RDE4如何去辨別長(cháng)的dRNA和iRNA的機制目前尚不即誘導產(chǎn)生轉錄后基因沉默( Posttranscriptional gene silencing,清楚。PTGS)。12RNA干擾誘導特異性基因沉默的特點(diǎn)作為一種新的功能基因研究工具,RNAi有著(zhù)傳統的基因研1RNA誘導特異性基因沉默的機制研究與特點(diǎn)究工具無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),傳統上對一個(gè)基因的功能研究主要是1.1RNAi誘導特異性基因沉默的機制研究通過(guò)向細胞內引入需研究的靶基因的反義寡核苷酸,誘導靶基1998年,Fme等呵研究證明利用已知序列的 dsRNa能夠特因的沉默,利用反義寡核背酸沉默目的基因不僅花費大操作復異性地阻斷秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)( Caenorhabditis elegans)體內的目的基雜而且周期長(cháng),不利于廣泛地被利用。而利用RNAi降解mRNA因表達,RNAi開(kāi)始廣泛引起研究工作者的注意,并被用于多領(lǐng)使靶基因沉默,不僅花費少周期短操作簡(jiǎn)單同時(shí)具備其特有域的科學(xué)研究中但對于RNA的發(fā)生機制目前仍沒(méi)有確切的報的優(yōu)點(diǎn)。(1)高效性大量的研究發(fā)現,極少量的 dsrna進(jìn)入細道普遍認為RNA現象的產(chǎn)生機制類(lèi)似于細胞的“免疫應答”胞內就可引起細胞內靶序列的高度的表達沉默,通過(guò)對其深入機制四。 dsRNA進(jìn)人細胞內被一種具有類(lèi)似RNaeⅢ活性的核研究發(fā)現,細胞內存在著(zhù)類(lèi)似于“聚合酶鏈式反應”的機制。在細酸內切酶Dier結合,并被酶切成19~23nt的小干擾RNA胞內存在著(zhù)一種可以在無(wú)需引物存在的情況下,直接以RNA為模( small interference RNA,iNA),在A(yíng)TP的作用下,iRNA與由板指導RNA合成的RNA聚合酶( RNA-directed RNA polymerase,多種蛋白質(zhì)結合形成且具有活性的RNA沉默復合物(RNA- - in- RdRP),當結合有 SiRNA反義鏈的RSC根據 Watdon-Crick的duced silencing complex,RIsC)結合,RC具有解螺旋酶的功基配對原則結合與反義鏈特異性互補的mNA后在降解能使與其結合的siNA雙鏈解螺旋成單鏈釋放正義鏈,保留NA的同時(shí)激活RdRP,激活的RdRP以RNA為模板合成新的反義鏈,隨后識別并結合細胞內與其反義鏈相互補的 mrna dsrNa,新合成的 dsRNA再次被Dcer酶剪切成 siRNA, siRNA鏈。RSC將mRNA剪切成sRNA雙鏈降解mRMA,使靶基因重復著(zhù)上一過(guò)程,使sRNA的降解mRNA的效應起到放大的作表達沉默隊。最近在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)研究中發(fā)現RNA的發(fā)生與用大大增強了sRNA沉默目的基因的效率。(2)高特異性Brj Nurs,2005,14{4):205-210.中國煤化工阿宗土香老年患者失眠的護理措施及體會(huì )臨床誤診誤治,2000{8孫CNMHG失眠因素調查分析及護理19(5):84-85.對策生休健,以,3):38-59Birkholz G, Gibson JM, Clements PT. Dying patients' thoughts of ending(收稿日期:2007-09-30)lot study of rural New MexicoU]. J Psychosoc NursMent號獸生2007年11月第45卷第20期綜述種 siRNA分子只對與其反義鏈特異性互補的mRNA起降解作后用Der或 RNaseⅢ體外消化長(cháng) dsRNA,得到各種不同的siR用如果去除 siRNA分子,基因沉默也隨即消失。(3)可傳遞性NA片段混合物除掉未被消化的 dsRna后,混合物可以直接轉RNA的效應可在生物體內不同的細胞之間傳遞甚至可隨細胞染細胞。但利用Dier或RNaeⅢ消化體外轉錄形成的 siRNA轉的分裂而傳給子代細胞,使子代細胞同樣具有對靶基因沉默的染細胞后較容易引起細胞內干擾素樣反應,引發(fā)細胞內非特異的效能叫?；虺聊?導致細胞凋亡。(4)DNA載體體內制備 SiRNA目前,用于RNA干擾研究的質(zhì)粒載體有很多種,但它們驅動(dòng)2 siRNA的設計與產(chǎn)生方法shRNA表達所用的啟動(dòng)子大多相同,一般為 RNA polymeraseⅢ2.1 SiRNA的設的某些基因啟動(dòng)子如H和U6啟動(dòng)子,啟動(dòng)子的自身元素均位正確的設計和選擇 siRNA靶序列可以有效地提高 siRNA沉于轉錄區的上游,且有明確轉錄的起始點(diǎn)、終止點(diǎn),轉錄出的默目的基因的效能。目前sRNA靶序列設計主要是以Tuch的RNA無(wú)pyA尾,DNA載體可以帶有cF、RF的報告基因,以siRNA用戶(hù)指南以及 Ambion公司的 siRNA設計手冊為指導的:監測轉染效率同時(shí)可以帶有表達抗生素的抗性基因,以篩選穩(1)在目的基因DNA中選擇以AA(包括AA)起始的2nt序列,定轉染細胞株DNA載體一次制備可多次使用,實(shí)驗主要是在因為實(shí)驗研究發(fā)現3'端帶有UU的sRNA沉默目的基因的效率DNA水平上操作,對 RNase free的環(huán)境要求相對較寬但實(shí)驗一更高而且可以更好地抵抗 RNase的降解;(2)避免選擇起始密般需要較長(cháng)的時(shí)間,且轉染效率低。(5)慢病毒制備 siRNA碼下游50-1004終止密碼上游100以?xún)鹊膮^域,避免選擇( shrNA)a2目前主要是由 lentivirus介導的RNA干擾。5’或3非編碼區域以及避免選擇內含子區域;(3)避開(kāi)4個(gè)或以 Lentivirus是一種逆轉錄病毒,可以整合入宿主細胞并長(cháng)期表達,上的多囊A或多聚T的連續序列,以免轉錄過(guò)程的提前中斷;但比一般的逆轉錄病毒擁有更高的滴度,不僅可以感染分裂期(4)針對目的基因選擇2~4個(gè)的靶sRNA序列以便篩選能高細胞還能感染非分裂期細胞。利用 lentivirus構建的 shrNA表效沉默目的基因的sRNA序列,并盡量控制sRN序列中GC達載體,可以代替瞬時(shí)表達載體使用,而且 lentivins-shRNA載的含量在35%~55%;(5)選擇合適的實(shí)驗對照。最后,利用體經(jīng)過(guò)包裝系統包裝成假病毒顆粒后,可以用于感染依靠傳統BLAST對所選擇的序列進(jìn)行特異性分析圍目前已經(jīng)有許多轉染試劑難于轉染的細胞如原代細胞、懸浮細胞等,并且在感染網(wǎng)站可以提供 siRNA序列設計的免費在線(xiàn)服務(wù)如Ami公司的后可以整合到受感染細胞的基因組中進(jìn)行長(cháng)時(shí)間的穩定表達,在線(xiàn)分析軟件?？梢酝ㄟ^(guò)NCB網(wǎng)站查找感興趣的目的基因的是目前制備穩定表達 shRNA細胞株和進(jìn)行體內實(shí)驗最為理想的mRNA序列登錄 Ambion公司網(wǎng)站按照網(wǎng)站的指示操作,網(wǎng)手段站可設計出多個(gè) BiRNA序列可供選擇,最后可根據設計原則選擇最合適序列3RNAi技術(shù)的應用與應用前景22sRNA的產(chǎn)生當病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合研究發(fā)現, siRNA直接轉染動(dòng)物細胞后通?？梢哉T導細胞內到宿主細胞基因組內,并利用宿主細胞進(jìn)行轉錄時(shí),宿主細胞內目的基因產(chǎn)生3~7d的高度的沉默,隨后 siRNA隨時(shí)間的延長(cháng)常產(chǎn)生 dsrNa,隨即引發(fā)RNA沉默現象。最初RNA沉默現象是逐漸地被降解靶基因的沉默現象逐漸得到恢復基因沉默的效從植物的轉基因研究中發(fā)現的,被稱(chēng)為“共抑制(co- upper-率主要取決于細胞增殖速度和 SiRNA的效能叫。目前, siRNA主simn)”現象。后來(lái)研究發(fā)現“共抑制”現象主要發(fā)生在轉錄后的要是通過(guò)下面的五個(gè)途徑來(lái)獲得:(1)化學(xué)合成 SiRNA目前,RNA水平四。在研究粗糙紅色鏈孢霉菌時(shí)也發(fā)現類(lèi)似的現象,被以化學(xué)合成方法合成的 sirnA主要被用于體外培養細胞的短暫命名為阻抑作用( quelling)"。在研究線(xiàn)蟲(chóng)的特異性基因時(shí)發(fā)現實(shí)驗。直接通過(guò)化學(xué)方法合成兩條互補的21~23mRNA單鏈,突也具有同樣的RNA沉默現象被命名為“RNA干擾”現象。隨后出端為DNA堿基,增加了 siRNA對RNae降解的耐受性,兩條RNA干擾倍受關(guān)注,廣泛的被研究應用。在正常的生物體內互補單鏈經(jīng)過(guò)退火形成雙鏈 siRNA或發(fā)夾結構RNA,通過(guò)電轉RNA干擾起到抗病毒、抑制基因過(guò)量表達的作用。目前,RNA導或質(zhì)脂體的方法轉染給細胞,擁有效率高和對細胞毒害作用干擾技術(shù)被廣泛地用于功能基因的研究、腫瘤基因研究、藥物小的優(yōu)點(diǎn)轉染率通?？梢猿^(guò)70%,且實(shí)驗操作簡(jiǎn)潔,利用化篩選等領(lǐng)域。對一個(gè)感興趣的基因的研究目前通常是通過(guò)兩種學(xué)合成 siRNA對靶基因沉默的維持時(shí)間也較為短暫,一般72h途徑:觀(guān)察感興趣基因的突變株的表型的變化或通過(guò)敲除或沉之內,但合成費用高,同時(shí)RNA較易被環(huán)境中的RNA酶所降默感興趣的目的基因觀(guān)察細胞表型的改變。在RNA被提出前,解所以對合成的條件和轉染時(shí)的操作有嚴格的要求,目前主要對感興趣的基因的沉默主要是通過(guò)反義技術(shù)來(lái)進(jìn)行,但利用反用于已找到最有效的 siRNA情況下的實(shí)驗研究。(2)體外轉錄合義技術(shù)對目的基因進(jìn)行沉默,不僅操作復雜、特異性差效率成 siRNA在體外,利用RNA聚合酶的T3或T7啟動(dòng)子轉錄低。使用RNA技術(shù)沉默目的基因不僅操作較簡(jiǎn)單,且有特異性合成兩條互補的21-23mRNA單鏈經(jīng)過(guò)退火形成雙鏈 siRNA,強效"發(fā)展,利用DNA載體和再轉染給細胞,同樣具有維持時(shí)間短暫的缺點(diǎn),但較化學(xué)合成慢病中國煤化工建靶基因沉默穩定株方法的費用較低,目前主要被用于最有效的 SiRNA的篩選。成為CNMH數2在腫瘤的研究方(3)用Dcer或RNaⅢ消化體外轉錄形成的dRNA選擇面RNA技術(shù)被廣泛地用于新的腫瘤治療靶基因的尋找新的200~1000mt的靶mRNA序列,體外轉錄制備長(cháng)片段 dsrNa,然腫瘤藥物的研發(fā)、新的腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)尋找和提高腫瘤細CHINA MODERN DOCTOR中國現代醫生153綜述·年11月第45卷第20期胞對抗腫瘤藥敏感性研究等口測。RNAi在抗病毒的研究中也有short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells[JI Proc著(zhù)重要的意義目前RNA技術(shù)已被廣泛地應用于HⅣV研究和肝 Natl Acad Sci USA,20029996047-6052炎研究到。在藥物篩選方面,RNA被用于尋找新的藥物粑7 Yang D, Buchholz F, Huang Z et al. Short RNA duplexes produced by點(diǎn)和研發(fā)新的藥物等。隨著(zhù)對RNAi的深入研究,RNAi的強hydrolysis with Escherichia coli RNase l mediate effective RNA inter-大的潛能正在被逐漸地發(fā)現和認識,盡管其目前仍存在較多ference in mammalian cells[]. Pmc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(15):的問(wèn)題,如轉染效率低、穩定性不高等,但隨著(zhù)對其研究的深人,RNA技術(shù)將必定成為人類(lèi)戰勝胂瘤、HV等疾病的強有18DhmE. Silver PA. Retrovinug-delivered siRNAJ)力的武器。2002,2(1:15.[19] Tiscomia G. Singer 0, Ikawa M, et al. A general method for gene參考文獻interfering RNA[. Proe Natl Acad Sci USA, 2003, 100(4): 1844-1848,[I] Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interfer- [20]Li M, Rossi JJ. Lentiviral vector delivery of siRNA and shRNA encodingce by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[]. Nature, 1998.genes into cultured and primary hematopoietic cells[]. Methods Mol Bi-391(6669)806-81ld,2005,309(1)261-2722]Plasterk RH. RNA silencing: thestem/Jl Science, [21] Fish R, Kruithof EK. 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