聚乙二醇修飾對二聚β肽抗腫瘤轉移生物活性的影響

腫瘤2000年12月第27卷第12期Tumor Vol.27, No. 12, December ,2007●931●Basic Research.基礎研究聚乙二醇修飾對二聚β肽抗腫瘤轉移生物活性的影響朱瑞'4, 王松梅”,沈煒明'，劉銀坤‘(1.上海交通大學(xué)附屬胸科醫院藥劑科,上海200030; 2.復旦大學(xué)上海醫學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗室,上海200032;3. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫院藥劑科,上海200233; 4.復旦大學(xué)附屬中山醫院肝癌研究所,上海200032)[摘要]目的:比較聚乙二醇( plyethylene glycol ,PEG)修飾對二聚β肽(β2)抗腫瘤轉移活性的影響。方法:采用纖連蛋白(fronetin, FN)包被細胞培養板作為細胞外基質(zhì)成分( etracellular matrix, ECM) ,觀(guān)察β2和PEG修飾物(β 2-PEG)對肝癌細胞株與FN黏附能力的影響;采用Marigel法觀(guān)察β2肽和β2-PEG對腫瘤細胞侵襲重組基底膜能力的影響。結果:β2和β 2-PEG對SMMC-7721和HCCLM 6細胞與FN黏附均有明顯的抑制作用(P<0.05),且呈劑量與時(shí)間相關(guān)性;PEG修飾物對2種腫瘤細胞的黏附抑制作用均較未修飾的β2肽明顯增強(P<0.05)。β2和β2-PEG對HCCLM 6細胞遷移和侵襲均:有明顯的抑制作用( P<0.05),遷移抑制率分別為54.6%和56.3% ,侵襲抑制率分別為36.8%和46.6% ,PEG修飾前后差異無(wú)統計學(xué)意義;β2和β2-PEG對SMC-7721細胞也有顯著(zhù)的抑制作用,遷移抑制率分別為43.6%和45.7% ,侵襲抑制率分別為33.6%和35.9% ,修飾前后差異無(wú)統計學(xué)意義。結論:β2肽和β2-PEG對腫瘤細胞與FN的黏附具有特異的抑制作用,呈劑量與時(shí)間相關(guān)性,PEG修飾后抗黏附作用增強。β2肽和β2-PEG對2種腫瘤細胞的遷移和侵襲均有明顯的抑制作用,但修飾前后差異無(wú)統計學(xué)意義。[關(guān)鍵詞]癌,肝細胞; 聚乙二醇類(lèi);細胞黏附分子;腫瘤侵襲;二聚β肽[中圖分類(lèi)號] R73-362 [ 文獻標識碼] I[文章編號] 100-7431(2007)12-0931.04The influence of β peptide dimmer modifned by polyethylene glycol on anti-metastasis activityZHU Jun'4, WANG Song-mei2 , SHEN Wei-ming' ，LIU Yin-kun* (1. Department of Pharmacy, Chest Hospital Afiliated toShanghai Jiaotong Universily, Shanghai 200030 , China; 2. Laboratory of Molecular Biology , Shanghai Medical College ,Fudan Uni-versity, Shanghai 200032 ,China; 3. Department of Pharmacy , 6th People 自Hospital ffliated to Shanghai Jaotong University,Shanghai 200233; 4. Liver Cancer Institute , Zhongshan Hospital Afiliated to Fudan University, Shanghai 200032 , China)[ ABSTRACT] Objective:To observe the infuence of β peptide dinmer mdifed by PEG on anti metastasis activity. Methods:Cellculure plates were coated with fibronectin (FN) as extaellular matrix (ECM). The influence of β 2 and β 2-PEC peptides on the ad-hesion of tumor cells to FN were observed. The efects of β 2 and β 2-PEG peptides on migration and invasion ability of tumor cells inreconstituted basement membrane were measured by using Transwell Boyden and Matrigel method. Results:Compared with negative con-trol, β2 and β 2-PEG peptide signifcantly inhibited the adhesion of SMMC-7721 and HCCLM 6 tumor cells to FN in a time- and dose-dependent manner (P <0. 05). The inhibitory ffects of β 2-PEG were stronger than β 2 peptides (P <0.05). The mobility and inva-sion of HCCLM 6 and SMMC-7721 cells were obviously inhibited by β2 peptide and β 2-PEG (P<0.05). For HCCLM 6 cll, β2peptide and β 2-PEG inhibited ell migration were 54. 6% and 56. 3% and suppressed cell invasion 'were 36.8% and 46. 6% , respec-tively. For SMMC-7721 cells, the migration inhibitory rate were 43. 6% and 45. 7% and invasion inhibitory rate was 33. 6% and35.9% by β2 and β 2-PEC peptide, respetively. The dfferenre were not significant before and after PECylation. Conclusions:Theβ2 and β 2-PEC peptides secifically inhibite the adhesion of tumor cells to FN in a time- and dose-dependent manner. The anti-adhe-sion efeetse are enhanced after PEG mdifcation.n The β 2 and β 2-PEG peptides obviously suppress migration and invasion of the twokinds of tumor cells. The diference is not significant before and aftler PEG modification.[KEY WORDS] Careinoma , hepatocellular; Polyethylene glycols; Cell adhesive molecules; Neoplasm invasiveness; Dimmer of βpeptide[Tumor ,2007 ,27(12) :931-934]本課題組根據整合蛋白β亞基的保守序列，自[基金項目] 1. 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(八六三計劃)項目(編行設計了具有抗黏附能力的β肽(DLYYLMDL-號:2001A215411 2004A215201)2.上海市現代生物與新藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展基金項目(編號:SYSMK)[0]和二聚β肽(β2),實(shí)驗證實(shí)這2種肽024319212)均能阻斷腫瘤細胞與基質(zhì)之間的黏附性'”。但仍[作者簡(jiǎn)介]朱明(1964--),女(漢族),博 士,主任醫師,碩士生存在中國煤化工相當低，在體內的導師半衰Conespondence to:LIU Yin-kun(劉銀坤)MHCN MH G術(shù)后的預防用藥。Tel:021-64041990-2501根據已有報道策乙一酵( polyetnylene glycol, PEG)E-mail:ykliu@ zshoepital. com修飾多肽能改善其理化性質(zhì)[8],且采用PEG修飾●932●腫瘤2007年12月,第27卷β 2肽(β 2-PEG)也已獲得成功9。因此本實(shí)驗以的影響在10%FCS-DMEM培養液中培養的腫瘤纖連蛋白( fibronectin, FN)包被細胞培養板作為細細胞鋪滿(mǎn)培養瓶底后,收集細胞培養.上清液,加入胞外基質(zhì)成分( extracellular matrix, ECM),觀(guān)察β 2FN至終質(zhì)量濃度為5 μg/mL,作為條件培養基。將肽及其PEG修飾物對人肝癌細胞株SMMC-7721及腫瘤 細胞消化后用無(wú)血清DMEM稀釋成2 x 10°人肝癌高轉移細胞株HCCLM6細胞與FN黏附作個(gè)/mL細胞懸液,在Transwell上室中加入100 μL用的影響;利用Transwell 細胞培養小室和Matrigel細胞懸液,分別加入用無(wú)血清DMEM稀釋成200法觀(guān)察β2肽和β2-PEG對腫瘤細胞侵襲重組基底μmolL的β2肽和β2-PEG以及GRGDS各100膜能力的影響,比較PEG修飾前后β2肽抗腫瘤轉μL,對照組加入無(wú)血清DMEM 100 μL。下室加入移活性的變化。600 μL條件培養基,置于體積分數5%的CO2培養箱中培養16h。從雙室培養板中取出Transwell小1材料與方法室,吸棄液體,用棉簽擦凈未穿透聚碳酸酯微孔濾膜1.1 材料β2肽β 2(DLYYLMDLSYSMKGGD-的細胞,PBS漂洗后10%甲醛固定,Giemsa染色30LYYLMDLSYSMK)由復旦大學(xué)附屬中山醫院肝癌研min,ddH2O沖洗。取下微孔濾膜,在200倍顯微鏡究所自行設計,上海生工生物工程公司合成;GRGDS下計數上下左右中5個(gè)不同視野的遷移細胞數,取(甘-精-甘-天冬-絲)、無(wú)關(guān)肽( MKGGDLYYLMDLS)由平均值,計算遷移抑制率。遷移抑制率=[1-(處上海生工生物工程公司合成;β 2-PEG由本實(shí)驗室理組遷移細胞數對照組遷移細胞數)] x 100%。自行制備。1.2.4 β2 肽和β 2-PEC對肝癌細胞株侵襲能力1.2方法的影響Matrigel 用無(wú)血清DMEM稀釋10倍,以每1.2.1 β2 肽和β2-PEG對肝癌細胞株與FN黏附孔75 μL包被Transwell上室,37C放置2 h使其成能力影響的劑量關(guān)系將1 x10'個(gè)/mL以10%膠。細胞和藥物的加入方式同1.2.3節,體積分數為BCS-RPMI1640培養的SMMC-7721細胞懸液或5%的CO2培養箱中培養48 h。取出Transwell小室,10% FCS-DMEM培養的HCCLM 6細胞懸液加入FN吸棄液體,用棉簽擦凈基底膜膠, PBS漂洗后10%甲包被的96孔板中,每孔100μL。以GRGDS作為陽(yáng)醛固定,Giemsa染色30 min , ddH20沖洗,200倍顯微性對照,無(wú)關(guān)肽作為陰性對照,β2肽和β 2-PEG為鏡下計數上下左右中5個(gè)不同視野的侵襲細胞數,取實(shí)驗組,將4種肽稀釋成20、40.100和200μumol/L,平均值,計算侵襲抑制率。侵襲抑制率=[1-(處理每孔加人100 μ,終濃度為10 、20、50和100 μmo/L，組侵襲細胞數/ 對照組侵襲細胞數)] x 100%。同時(shí)設空白組(200 μL細胞培養液)及對照組(加入1.2.5統計分析 不同多 肽濃度或作用時(shí)間對細100 μuL 細胞及100 μL培養液) ,每組設5個(gè)復孔。胞黏附的抑制,采用線(xiàn)性相關(guān)( linear correlation)分37C、體積分數為5%的CO2共培養3 h后洗去未黏析,并計算相關(guān)系數r,顯著(zhù)性水平為0.05。遷移和附細胞,噻唑藍( thiazolyl blue , MTT)法檢測96孔板侵襲實(shí)驗結果采用t檢驗,以P <0.05認為有遷移上細胞濃度,觀(guān)察劑量關(guān)系,同時(shí)比較PEG修飾的抑制作用或侵襲抑制作用。統計軟件為SAS 8.2影響。細胞黏附抑制率= (對照組平均D值-處理(SAS Institute Inc.，Cary, NC, USA)。組平均D值)/(對照組平均D值一空白組平均D2結果值)x100%.1.2. 2 β2肽和β 2-PEG對肝癌細胞株與FN黏2.1β2肽和β2-PEG對腫瘤細胞與FN黏附的抑.附能力影響的時(shí)間關(guān)系將β 2、β 2-PEG、GRGDS制作用不同濃度的β2肽和β2-PEG對HCCLM6和無(wú)關(guān)肽分別稀釋成200μmol/L,以每孔100μL加和SMMC-7721細胞與FN黏附的抑制率見(jiàn)表1;β 2人到FN包被的96孔板中,加入100μL細胞(1x肽和β 2-PEG作用不同時(shí)間對HCCLM 6和SMMC-10'/mL),同時(shí)設空白組及對照組,每組設5個(gè)復7721細胞與FN黏附的抑制作用見(jiàn)表2。與無(wú)關(guān)肽孔。379C、體積分數為5%的CO2分別培養0.5.1、組相比較,β 2肽、β 2-PEG以及GRGDS對1.5、2.3 h,洗去未黏附細胞,MTT法檢測96孔板上HCC中國煤化工泡與FN的黏附均細胞D值,觀(guān)察時(shí)間關(guān)系，同時(shí)比較PEG修飾的影有顯fYHCN M H逋著(zhù)多肽依度的升響。細胞黏附抑制率計算同1.2.1節。高,黏剛抑利華也增向,全現刑重相關(guān)關(guān)系,差異有1.2.3 β2肽和β 2-PEG對肝癌細胞株遷移能力統計學(xué)意義。與細胞共培養不同時(shí)間,β2肽、β 2-第12期.朱珺,等 聚乙二醇修飾對二聚β肽抗腫瘤轉移生物話(huà)性的影響●933●PEG和GRCDS對HCCLM 6細胞及SMMC-7721細現時(shí)間相關(guān)關(guān)系,差異有統計學(xué)意義。而無(wú)關(guān)肽無(wú)胞與FN的黏附都表現出顯著(zhù)的抑制作用,且隨著(zhù)此現象,且β 2-PEG對2種腫瘤細胞與FN黏附的作用時(shí)間的延長(cháng),對細胞黏附的抑制作用越明顯,呈抑制作用均強于β2。表1不同濃度的多肽對腫瘤細胞的抑制率Table 1 The effect of different concentrations of peptides on tumor cell adhesion to FN(%,n=5)Inhibitory rate of adhension ep/( pumol. L-I)Cell linePeptide1205(00HCCLM 6β211. 8021.7028.5048. 700.97<0.05β2-PEC13.60 .24.9039.8060.90<0. 05GRCDS11. 1018.2023.3049.200.98Irrelevant0.21.110.180.31SMC-7721β8.50 .16.2020. 7028. 700.92β 2-PEG10.2019.5025.9035.900.93CRCDS6.80.11. 4025. 6033.' 700.960.120. 160.210.170.69表2多肽作用不同時(shí)間對腫瘤細胞與FN黏附的抑制率Table 2 The effect of peptides on tumor cell adhesion to FN at different times(% ,n=5)Inhibitory rate of adhension /h1.523.610.216.829.50.9949.814.118.422.733.70.99711.410.919.327.548.60. 9675.43.80.40.358SMMC-77214.97.89.112.60.9426.810.413.224. 134.20.984GRGDS7.111.723.424.80.913Irelevant2.50.11.70.32.2 β2 肽和β 2-PEG對腫瘤細胞遷移能力的影比,細胞數明顯減少(P<0.05),抑制率分別為響HCCLM 6細胞加入100 umol/L的β2或β2- 33. 6%和35.9% ,但PEG修飾前后差異無(wú)統計學(xué)意PEG后,細胞的遷移均受到抑制，與對照組相比,細義,表明PEG修飾后不影響β2肽抑制細胞侵襲的胞數明顯減少(P <0.05) ;抑制率分別為54.6%和功能,見(jiàn)表4。56.3%,但PEG修飾前后差異無(wú)統計學(xué)意義。表3 β2 肽和β2-PEG對腫瘤細胞遷移SMMC-7721細胞加人100μmoVL的β2或β2-能力的影響PEG后,細胞的遷移均受到了抑制,與對照組相比,Table 3 The efets of β2 and β 2-PEG peptides細胞數明顯減少(P <0. 05) ;抑制率分別為43. 6%on migration of tumor cells(n=5)和45.7% ,但PEC修飾前后差異無(wú)統計學(xué)意義。結果表明PEG修飾后不影響β 2肽抑制細胞遷移的GroupNumber of migrated Inhibitorycells(示士s)rate/%功能，見(jiàn)表3。16. 90 +S. 624.62.3 β2肽和β 2-PEG對腫瘤細胞侵襲能力的影β 2-PEC16.27 46.346.3響HCCLM6細胞在加入100pumoVL的β2或CRGDS15. 38 t5.3658.7β2-PEG后,細胞侵襲均受到了抑制,與對照組相37.24 +8. 59比，,細胞數明顯減少(P<0.05),抑制率分別為SMMC中國煤化工13.636.8%和46.6%,但PEG修飾前后差異無(wú)統計學(xué)意YBCNMHG45.7義。SMMC-7721細胞在加入100 μmol/L的β2或Control64.23 t9.50●934●腫瘤2007年12月,第27卷表4 β2和β 2-PEG修飾物對腫瘤細胞飾物對腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響與未修飾多侵襲能力的影響肽基本相似,說(shuō)明β2肽經(jīng)PEG修飾后主要影響了Table 4 The effects of β2 and β 2-PEG peptides on腫瘤細胞與FN的黏附。invasion of tumor cells(n=5)生物學(xué)研究結果證實(shí),β2肽經(jīng)PEG修飾后,仍Cell lineCroupNumber of invasion Inhibitory1具有明顯的抗黏附和抗遷移、侵襲能力,與未修飾多ells(i+s) rale/%'肽相比,作用增強或基本相似，說(shuō)明PEG修飾β 2HCCLM 612. 20 +6.236.8<0.05肽可能為腫瘤轉移的預防性治療提供新的手段。β 2-PEG10.30+5.446.6GRCDS9.54 44.350.6PEG修飾的最大優(yōu)點(diǎn)是能使多肽體內的半衰期延SMMC-7721Control19. 30+9.3長(cháng),因此對于其整體實(shí)驗和藥代動(dòng)力學(xué)參數,有待進(jìn).β217.01 +7.533.616.44 +6.435.9-一步深人研究。15.67 +5.838.9<0. 0525.64 +6.3[參考文獻][1] LIU YK, YANF, UEMURA T. The binding ability to matrix pro-teins and the inhibitory eets on cell adhesion of eynthetic pep-3.討論tides derived from a conserved sequence of integins[J]. J Biochem, 1997 ,121(5) :67-74.FN是細胞外基質(zhì)中的細胞黏附分子,在腫瘤的2] 孫婧驟，周信達，賀建宇,等β肽對棵鼠人肝癌切除術(shù)后轉移侵襲轉移過(guò)程中起著(zhù)重要作用10-14]。腫瘤細胞與復發(fā)的阻斷作用[J].中華實(shí)驗外科雜志，200,17(5):418-FN黏附的測定已成為人們研究腫瘤細胞轉移常用420.方法之一。本實(shí)驗以FN包被細胞培養板模擬[3] UEMURA T, NEMOTO A, LIU Y K. Synhetic peptide derivedfrom a conseved sequence of integrin β subunit[J]. Res Adu Bio-ECM,以GRGDS作為陽(yáng)性對照,同時(shí)用無(wú)關(guān)肽作為sei Bioeng, 2000 ,20(1): 65-83.陰性對照,研究了β2肽和β2-PEG對肝癌細胞與[4]孫婧珊,周信達 ,劉銀坤,等抗黏附藥物對裸鼠人肝癌轉移復FN黏附抑制作用的影響。結果表明其抗黏附作用發(fā)防治的實(shí)驗研究[J].中華消化雜志, 2000 ,20(1) :53-54.特異,且呈現劑量效應和時(shí)間效應相關(guān)關(guān)系,同時(shí)發(fā)[5]孫婧珊,周信達,劉銀坤,等. β肽防治肝癌轉移復發(fā)的研究[J].中華普通外科雜志，2000,15(1):27-31.現PEG修飾后抗黏附作用明顯增強。6] SUN JI, ZHOU XD, uU YK, et al. Inhibitory efets of synthetice腫瘤細胞的遷移能力和侵襲能力在轉移中也起β peptide on invasion and metatasis of liver caner[J]. CancerRes Clin 0ncol, 2000 ,126(2) :595-600.重要作用。采用Transwell培養小室來(lái)研究腫瘤細[7] 王松梅,朱瑪,李巖,等β肽及其多聚物對人肝癌細胞胞的遷移能力是較常用的方法。通過(guò)觀(guān)察穿越濾膜株與基質(zhì)黏附的抑制作用[J].實(shí)用腫瘤雜志, 2006 ,21(3):細胞數量的變化可了解腫瘤細胞遷移的能力。在278-281. .Transwell培養小室微孔濾膜上鋪就人工基底膜膠,[8] VERONESE FM,SACC A B,SERQI M, et al. New PECs for peptide and proein modifcation,sutable for inifcatioin of PECyla-模擬了腫瘤細胞在機體內侵襲基底膜的過(guò)程。結果tion site[J]. Bioconjug Chem ,2001 ,12(1) :62-70.表明,β2肽和β 2-PEG對兩種細胞遷移和侵襲均[9] 朱珊，王松梅，沈煒明,等.抗腫瘤轉移多聚β肽聚乙二醇有明顯的抑制作用，而且PEG修飾并不影響β2肽化的研究[J].中國新藥與臨床雜志,2005 ,24(9) :723-726.[10] OKEGAWA r, uU YK, PONG R, et al, Cell adhesion proteins的抗遷移和侵襲能力。as tumor sppesors[J]. Inuest Urol, 2002 ,167(4) :1836-1843.在黏附實(shí)驗中,β2肽和β 2-PEG可能通過(guò)以.[11] GIANCOTTI F G. Integin signaling[J]. Science, 1999, 285下兩種途徑抑制腫瘤細胞與FN的黏附:(1)β2肽(5430) :1028-1032.和β 2-PEG與含有RGD序列的所有基質(zhì)蛋白結合，[12] AZNAVOORIAN s, STETIER-STEVENSON W, LIOTT L A.Molecular aspects of tumor cell invasion and metastais[J]. Canc競爭性地結合了整合蛋白的結合位點(diǎn);(2)由于β2er,1993, 71(2):1368-1383.肽和β 2-PEG來(lái)源于整合蛋白的保守序列，所以也[13]劉銀坤,吳偉忠,吳欣,等 肝癌轉移與信號傳導[M]/湯釗能和整合蛋白結合,從而抑制整合蛋白的黏附活性。猷.肝癌轉移復發(fā)的基礎與臨床.上海:上?？萍季扔霭嫔?，體外試驗結果顯示,修飾物的抑制作用明顯高于未2003 :93-104.修飾物?？赡茉蚴?修飾物的水溶性明顯增加,使[14]周信達,劉銀坤.原發(fā)性肝癌復發(fā)轉移防治的臨床與基礎研究其更容易與含有RGD序列的基質(zhì)蛋白結合,也更容[收稿中國煤化工修回日期] 200704-19易與整合蛋白結合。在遷移和侵襲試驗中, PEG修[本文HCNMHG