非病毒基因載體聚乙二醇-聚乙烯亞胺的合成及其結合DNA能力的研究

羅昕等:非病毒基因載體聚乙二醇-聚乙烯亞胺的合成及其結合DNA能力的研究297_非病毒基因載體聚乙二醇聚乙烯亞胺的合成及其結合DNA能力的研究羅昕1.2,潘仕榮',馮 敏”,張 璇',張 未',溫玉婷1(1.中山大學(xué)附屬第一醫院廣東廣州510080;2.中山大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州510080)摘，要:以IPDI為偶聯(lián)劑,合成了PEG-PEI接枝共關(guān)鍵的問(wèn)題是如何將DNA轉人到靶細胞之中,進(jìn)而聚物,用FT-IR、H NMR對共聚產(chǎn)物進(jìn)行結構表征確進(jìn)人細胞核,從而實(shí)現基因的轉錄與表達。介導基因認,通過(guò)'H NMR計算出共聚物的分子量,并通過(guò)瓊傳遞的載體主要分為病毒型載體和非病毒載體,陽(yáng)離脂糖凝膠電泳試驗考察共聚物與DNA的結合能力。子聚合物是一類(lèi)常用的非病毒載體凹,其中聚乙烯亞結果表明,成功合成了PEG-PEI共聚物,當PEG接枝胺(PEI)是目前應用較有效的陽(yáng)離子聚合物基因載量為10% .25%時(shí),PEG-PEI結合DNA的能力沒(méi)有受體好。PEI的結構特點(diǎn)是分子中每隔2個(gè)碳原子就有到明顯影響;當PEG接枝量為50%時(shí),PEG-PEI結合一個(gè)氮原子,這些氮原子在生理條件下可以發(fā)生質(zhì)子DNA的能力有所下降?；鴰险姾?從而與DNA.上帶負電荷的磷酸基關(guān)鍵詞:非病毒基因載體;聚乙二醇;聚乙烯亞胺;異團通過(guò)靜電吸附作用而形成復合物。但PEI作為基因佛爾酮二異氰酸酯;瓊脂糖凝膠電泳載體的最大缺點(diǎn)就是細胞毒性太大,聚乙二醇(PEG)中圖分類(lèi)號: TQ316;Q523文獻標識碼:A是無(wú)毒無(wú)免疫原性的水溶性大分子,具有優(yōu)良的生物文章編號:1001-9731 (2008)02-0297-04相容性[] ,本文通過(guò)使用PEG修飾PEI,制成嵌段或接枝共聚物(圖1),以期改善其作為基因載體的性能,1引言并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳試驗考察PEG修飾后是否會(huì )基因治療是近年來(lái)新興的一種治療手段,其中最降低PEI結合DNA的能力。CHo-ECHCH20],CHCH2OHmPEGIPDINCODBTLCHChCHACHNCO70~75C/10hCHo-ECH2CH.o}].CH.CH20-t-NHmPEG-NCOPEINHzCHRkCHNCODBTUCHCIH2NE~NH}h;EN~ 子,Nh2| 65C/24hCH2o-FCH2CH.o].CH.CH2OC-NHPEG-PEICHxEKCH.NH- t NHE~NHJ,{N~ JINH2.圖1 PEG-PEI 的合成路線(xiàn)Fig 1 Synthesis of PEG-PEIBruker 公司) ,AVANCE AV 400超導核磁共振譜儀(瑞2材料與儀器士Brucker公司),DYY-6C型電泳儀(北京市六- -儀器聚乙烯亞胺(Mw25000,支鏈型,無(wú)水, AldrichrSig-廠(chǎng)),UVIpro凝膠成像系統(英國UVMtec公司)。ma公司),單甲氧基聚乙二醇(mPEG,M。= 750、.2000.3實(shí)驗方法5000,Fluka公司),異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI,進(jìn)口分裝,廣州市匯采涂料化學(xué)品有限公司),二月桂酸二丁基3.1 原料的預處理錫(DBTL,廣東麗寶涂料助劑公司),氯仿、乙醚.油醚3.1.1氯仿(30~60C)等均為分析純(廣州化學(xué)試劑二廠(chǎng))。臨200"^千慍外棚后的干水氯化鈣加人氯仿,放EQUINOX 55型傅里葉變換紅外光譜儀(德國置過(guò)中國煤化工濾除去氯化鈣,將濾IYHCNMHG_●基金項目:國家 自然科學(xué)基金資助項目(30570500)收到初稿日期:2007-07-25收到修改稿日期:2007-10-08通訊作者:潘仁榮作者簡(jiǎn)介:羅昕(1978-),男,廣 西梧州人,在讀博士,師承潘仁榮教授,主要從事生物材料的研究。_298功村料2008年第2期(39)卷液與IPDI在60C下回流4h,以除去微量的水分和乙(含 0. 2pug/ml澳化乙錠作為顯色劑),1XTBE作為電.醇,最后將氯仿蒸出,干燥器中保存備用。泳緩沖液,電壓90V,電泳時(shí)間50min.電泳結束后于3.1.2單甲氧基聚乙二醇凝膠成像系統中觀(guān)察并拍照。將mPEG加入三頸瓶,油浴加熱使之熔融,升溫4結果與討論至110C ,攪拌下抽真空,脫水處理4h,干燥器中保存備用。4.1共聚物的合成3.2單甲氧基聚乙二醇的活化mPEG分子上有活性基團-OH,PEI分子上有活稱(chēng)取mPEG于恒壓滴液漏斗中,加人適量氯仿，性基團-NH2,IPDI分子具有兩個(gè)活潑基團異氰酸酯振搖使之溶解;另量取8~30倍摩爾量過(guò)量的IPDI于基,可以分別與PEG的一OH及PEI的- -NH2反應。三頸瓶中,加入適量氯仿，攪拌以分散均勻;在攪拌的本文利用IPDI作為偶聯(lián)劑將PEG與PEI通過(guò)共價(jià)鍵情況下將mPEG滴人IPDI中,并加入0. 6%~0. 7%連接成為接枝共聚物。IPDI 的兩個(gè)異氰酸酯基,一個(gè)的DBTL作為催化劑。滴加完畢后用水浴加熱至70直接接在環(huán)己烷體系的環(huán)上,另一個(gè)接在環(huán)，上側鏈的~75C回流反應10h,回流結束后將反應液倒人10倍亞甲基上,它們的反應活性并不相同,在許多情況下，量的石油醚中以析出沉淀，沉淀物用石油醚洗滌多次接在環(huán).上的一NCO的活性比側鏈上的一NCO的活性.后用少量氯仿溶解,再用10倍量的石油醚沉淀,如此大的,因此mPEG優(yōu)先與環(huán)上的一NCO反應,使得反復操作多次以去除過(guò)量的IPDI.最后將沉淀物抽IPDI不會(huì )同時(shí)接上兩個(gè)mPEG,此外我們通過(guò)控制反真空干燥,得白色粉末(mPEG5000-NCO、mPEG2000-應條件,即IPDI大大過(guò)量并采用mPEG逐滴滴人IP-NCO)或淡黃色粘稠液體(mPEG750-NCO)。DI的加料方式,進(jìn)-步減少了mPEG-IPDI-mPEG的3.3共 聚物的合成產(chǎn)生。Petersen等[5]采用六亞甲基二異氰酸酯(HD-稱(chēng)取定量的mPEG-NCO于恒壓滴液漏斗中,加MI)作為偶聯(lián)劑，由于HDMI的兩個(gè)- -NCO是對稱(chēng)結人適量氯仿,振搖使之溶解;另定量稱(chēng)取PEI于三頸瓶構，活性相同，因此有可能同時(shí)與兩個(gè)mPEG反應而中,加人適量氯仿,攪拌以分散均勻;在攪拌的情況下無(wú)法再與PEI反應。第一步的活化反應結束后必須將將mPEG-NCO滴人PEI中,并加人0. 6%~0.7%的過(guò)量的IPDI除去,否則殘余的IPDI的兩個(gè)一NCO可DBTL作為催化劑。滴加完畢后用水浴加熱至65C導致PEI分子間發(fā)生交聯(lián)反應。IPDI 可溶于石油醚回流反應24h,回流結束后蒸去部分氯仿濃縮反應液，而mPEG-NCO不溶于石油醚，因此我們通過(guò)用大量將余下的濃縮液倒人20倍量的乙醚中以析出沉淀,沉的石油醚反復沉淀和洗滌mPEG-NCO以除去殘余的淀物用乙醚洗滌后真空干燥，得白色蠟狀固體. IPDI. 在第二步的共聚反應中,每個(gè)PEI分子上都有(mPEG5000-PEI .mPEG2000-PEI)或淡黃色粘稠液體多個(gè)氨基- - NH2 ,都可以與mPEG-NCO反應,為避免(mPEG750-PEI).分別制備PEG接枝量為10%、一個(gè) PEI分子接上過(guò)量的PEG,我們采用在攪拌的情25%、50%(質(zhì)量比)的PEG-PEI共聚物一共9種,分況下 將mPEG NCO逐滴滴入PEI 的方式來(lái)加料,以別記作750-10、750-25 、750-50、2K-10、2K-25、2K-50、保證共聚產(chǎn)物分子的均勻性。5K-10 ,5K-25、5K-50。3.4共聚 物的表征原料、預聚體及共聚物的IR圖譜如圖2所示。在3.4.1 IR 分析圖2(a)中,3482cm-1左右的寬峰是mPEG羥基的取mPEG .mPEG NCO、PEI、PEG-PEI,用其氯仿0- -H伸縮振動(dòng),2886cm~的吸收峰是長(cháng)鏈上亞甲基溶液涂硅片制備樣品,掃描范圍4000~400cm-.的C-H伸縮振動(dòng),1109cm-1的吸收峰是醚鍵C-3.4.2 'H NMR測定0- C的伸縮振動(dòng)。圖2(b)為mPEG-NCO,保留有以氘代氯仿為溶劑,在室溫25C下進(jìn)行。mPEG長(cháng)鏈上亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)(2876cm-1)3.5瓊脂糖凝膠電泳試驗及醚鍵C-0-C的伸縮振動(dòng)(1107cm-1),與圖2(a)DNA分子由于磷酸基團帶負電荷,在電泳槽中會(huì )相比,多了1716cm-'(mPEG的一0H與IPDI脂環(huán)上向陽(yáng)極遷移,帶正電荷的PEI與DNA結合形成復合的一NCO反應生成的氨酯羰基的伸縮振動(dòng))和物后可以阻滯DNA在電場(chǎng)中的遷移。PEI 與DNA2267cm“'(未參加反應的另一個(gè)一NCO的伸縮振動(dòng))的相對比例可以用N/P比(即PEI,上氨基氮與DNA兩個(gè)強吸收峰,表明mPEG與IPDI發(fā)生了化學(xué)反應，上磷酸基1團的摩爾比)來(lái)表示,完全阻滯DNA在電泳成為帶有活性基團-NCO的預聚體mPEG-NCO.在槽中遷移時(shí)的N/P比可以作為評價(jià)聚合物載體結合圖2(d中國煤化工PEI氨基的N- -HDNA能力的指標。伸縮拆MHCNMHG二峰是PEI鏈上亞甲將質(zhì)粒DNA(pEGFP-CI)與PEI、PEG-PEI按N/基的 d共聚產(chǎn)物PEGPEI,P比分別為0、0. 5、1.2、3.4、5、6混合,室溫靜置保留了PEI的N-H伸縮振動(dòng)(3285cm-1).PEG和30min,使之形成復合物。電泳條件;0.8%瓊脂糖凝膠PEI 鏈上亞甲基的C- -H伸縮振動(dòng)(2872cm-')、以及羅昕等:非病毒基因載體聚乙二醇-聚乙烯亞胺的合成及其結合DNA能力的研究_299預聚體中氨酯羰基的伸縮振動(dòng)(1712cm-1),與圖2(b)亞胺單元質(zhì)子的化學(xué)位移。在圖3(b)中,8.42的峰為相比,2267cm-1處- NCO 的吸收峰消失,表明一-NCOmPEG長(cháng)鏈上乙二醇單元質(zhì)子的化學(xué)位移,8.378的峰參加了化學(xué)反應，同時(shí)增加了1651cm-1的吸收峰(預”為鏈端甲氧基質(zhì)子的化學(xué)位移,82.002的峰為鏈端羥基聚體的一-NCO與PEI的一-NHz反應生成的脲羰基的質(zhì)子的化學(xué)位移,83.817的峰是與端羥基相連的亞甲基伸縮振動(dòng)),表明mPEG-NCO與PEI發(fā)生了共聚反質(zhì)子的化學(xué)位移。在圖3(c)中,83.ou9和8.s22的多重峰應,生成了共聚物PEG PEI.為IPDI上與脂環(huán)-NCO相連的次甲基質(zhì)子的化學(xué)位移(分別對應IPDI順、反兩種異構體),8.ou6(單峰)和8, 194~3.378(四重峰)為IPDI上與脂環(huán)側鏈- -NCO相連的亞甲基質(zhì)子的化學(xué)位移(分別對應IPDI順、反兩種異構體),8.07_1.1的峰是與脂環(huán)相連的甲基質(zhì)子的化學(xué)位移,81-1.256和81.7u9-1.026 的峰為脂環(huán)上亞甲基質(zhì)(C)PE2267/子的化學(xué)位移[時(shí)。圖3(d)為mPEG-NCO,與圖3(b)PEGPEMWi相比,82.002處mPEG鏈端羥基質(zhì)子的峰消失,表明mPEG的一OH與IPDI發(fā)生了反應;與圖3(c)相比，保留有83.0處與IPDI脂環(huán)側鏈- -NCO相連的亞甲基4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500質(zhì)子的峰,表明mPEG活化成功,成為帶有活性基團圖2原料及共聚物的IR圖譜-NCO的預聚體mPEG-NCO,且表明與mPEG羥基Fig 2 IR spectra of materials and copolymers反應的是脂環(huán)上的-NCO而非脂環(huán)側鏈上的一NCO.4.3 H NMR的測定圖3(e)為PEG-PEI,與圖3(d)相比8.09處與-NCO原料、預聚體及共聚物的'H NMR圖譜如圖3所相連的亞甲基質(zhì)子的峰消失,表明預聚體mPEG-NCO示。在圖3(a)中,8545-2.78之間的峰為PEI鏈上乙烯與PEI發(fā)生了反應,生成了共聚物PEG-PEI.間)陽(yáng)向mPEG(C) IPDI4.00 3.503.00 2.50 2.00 1.501.00 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.004.003.503.002.502.001.501.00間) mPEG-NCO(@)PEGPE|5鼎4.003.50~3.002.50-2.00 1.501.00 4.00 5.50 3.00 250 2.00 1.50 1.00x10*圖3原料及共聚物的'H NMR圖譜Fig 3 'H NMR spectra of materials and copolymers根據共聚物的'H NMR圖譜(圖3(e))中乙烯亞Wra% =Wrc, x100% .胺單元(82.s-s.o)與乙二醇單元(83.。)中質(zhì)子峰積分面’WPeG+WPe積之比,可以計算出共聚物中PEG與PEI兩組分的質(zhì)分子量:量比以及共聚物的分子量,結果見(jiàn)表1.MmWPc= ApEc/4X 44中國煤化工%Wret Ape/5X 43YHCN M H子的數目,接枝數:其中4、5和44、.43分別表示上述兩個(gè)單元的質(zhì)子M。二Mre數和分子量.”=一Mro接枝量:對于分子量較小的PEG750來(lái)說(shuō),偶聯(lián)劑IPDI的_300料2008年第2期(39)卷分子量(222.28)對共聚物分子量的計算影響較大,在為 N/P=0即裸DNA,可以看到跑出的條帶熒光很計算過(guò)程中必須予以扣除.亮,表明DNA在電場(chǎng)中發(fā)生了遷移。第2~8泳道分表1 PEG-PEI 共聚物的組成及分子量別為N/P=0.5.1.2.3、4、5、6的聚合物與DNA的復Table 1 Compositions and molecular weights of PEG-合物，從圖中可見(jiàn),隨著(zhù)聚合物載體的量逐漸增加，PEI copolymersDNA的電泳遷移逐漸受到阻滯，條帶的熒光逐漸變剛得接桂量接枝數分子董弱,甚至消失,直至完全被阻滯在點(diǎn)樣孔里. PEI 在樣品名投料比Wrc/Wru(%)n|M。N/P=3時(shí)就可以完全阻止DNA的遷移,共聚物750-750-10 f mPEG750: PEI=1+9| 13.86 T 4. 1429. oK10、750-25、2K-10、2K-25、5K-10、5K-25在N/P=3時(shí)750-25 mPEG750s PE1=1↑319.91| 6. 3931. 2K都可以完全阻止DNA的遷移,表明PEG的接枝量在750-50 mPEG750: PEI=1 : 144. 9821. 0245.4K2K-10mPEG2K: PEI=1 :910.47 1. 32 27.9K .10%和25%時(shí)并沒(méi)有削弱PEI結合DNA的能力;共2K-25| mPEG2K: PEI=1*3| 26.96| 4. 1534.2K聚物750-50、2K-50、5K-50在N/P=4時(shí)才可以完全2K-50 mPEG2Ks PEI=11 153. 1212. 75|53.3K阻止DNA的遷移,表明PEG的接枝量過(guò)大時(shí)會(huì )削弱5K-10| mPEG5K: PEI=1 :911.26 0. 6128. 2K5K-25 mPEG5Ks PEI=1 1325.081.6033.4KPEI結合DNA的能力。在PEG接枝量相同時(shí),不同_5K-50 mPEG5K PEI=1; 152.00 5. 19 52.0K分子量的PEG對PEI結合DNA的能力并沒(méi)有明顯#由NMR法計算求得。的影響。4.4瓊脂糖凝膠電泳試驗各樣品的電泳圖譜見(jiàn)圖4.每塊凝膠的第1泳道PEI750-10750-25750-5012345678 12345678 12345678 12345678 123456782K-252K-505K-105K-255K-50圖4聚合物/DNA 復合物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig 4 Agarose gel electrophoresis of polymer/DNA complexes72; 115-125.5結論[2] Godey WT, Wu KK, Mikos AG. [J]. J Cotolled Re-以IPDI為偶聯(lián)劑,合成了PEG-PEI接枝共聚物，lease, 199, 60; 149-160.經(jīng)FT-IR,'HNMR對共聚產(chǎn)物進(jìn)行結構表征確認生[3] Kakizawa Y. Katoka K. []. Adv Drug Delivery Re-views, 2002, 54; 203-222.成了PEG-PEI共聚物,并通過(guò)'H NMR計算出共聚物[4]尹偉,儲玖龍. [J].徐料工業(yè)，1999, 2; 34-36.的分子量。瓊脂糖凝膠電泳試驗結果表明,當PEG接[5] Petersen H, Kunath K, Martin AL, et al, [J]. Biomacro-枝量為10%、25%時(shí),PEG PEI結合DNA的能力沒(méi)有molecules 2002, 3(5) :926-36.受到明顯影響;當PEG接枝量為50%時(shí),PEG-PEI結[6]汪雷敏， 播鐵英，史新梅，等.[J]. 波譜學(xué)雜志，2005,合DNA的能力有所下降。22(1): 79-84.參考文獻:中國煤化工MHCNMHG[1] Godey wT, Mikos A G. [J]. J Controlled Release, 2001,(下轉第304頁(yè))304功能材料2008年第2期(39)卷WC-12%Co層梯度過(guò)渡層長(cháng)了模具使用壽命,降低了產(chǎn)品成本,對提高我國模具制造業(yè)的國際競爭力具有重要的戰略意義。參考文獻:[1] 新野正之,平井敏雄,渡邊龍三.[J].日稻復合材料學(xué)會(huì )冷卻管Zn合金層環(huán)倒樹(shù)脂+鋁粉NiCrAIA志,1987 ,13(6) :257-264.[2] Koizumi M,Nino M. []. MRS Bulletin, 1995,20(1), 19-(低熔點(diǎn)合金)21.圖6 FGM模具斷面結構簡(jiǎn)圖[3] 郭成,朱維斗,金志浩.[J].稀有金屬材料與工程,1995 :Fig 6 Structural diagram of the FGM mould cross-sec-(3);18-25.tion[4]金卓仁,毛樣武,程繼 貴. [J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001,1.60-63.5結論[5] Pan Chunxu, Xu Xiaorong. [J]. Surface and CoatingsTechnology，2003.162;194-201.熔射成形制備梯度功能材料工藝簡(jiǎn)單、效率高,可[6] Gu Y W,Klor K A.Fu Y Q,et al. [J]. Surface and Coat-以得到大厚度優(yōu)質(zhì)涂層,改善了不同材料間的界面結ings Technology,1997 ,96(2-3) :305-312.合性能,解決了復合材料界面突變產(chǎn)生的應力集中而[7] Sampath S, Smith W C,Jewett T J,et al. [J]. Materials導致涂層脫落問(wèn)題。Science Forum,1999 ,308-311 :383-388.等離子熔射制備的WC-20%Co/NiCrAI系FGM[8] Takigawa H,Koga M. Proc of the First Inter[C]. Japan;組織結構呈連續變化,斷面硬度呈梯度分布,表面耐磨Symp on FGM Sndai;1990. 247-252.性能較傳統鋼材有較大提高,制造成本低、周期短,是[9] Yoshikazu s, Yoshio I, Susumu L [J]. ISI International,1992 ,32(8) :893-901.新材料的發(fā)展方向和必然趨勢.FGM模具快速制造技術(shù)縮短了模具開(kāi)發(fā)周期,延Preparation of functionally graded materials by plasma sprayingZHAO Zi-yu,ZHANG Su zhi, F ANG Jian-cheng(College of Mechanical Engineering and Automation, Huaqiao University ,Quanzhou 362021 ,China)Abstract;Functionally graded materials (FGM) are a new material with special structures and characteristics,and it would contribute to improve the traditional materials industry by further research of the FGM, In this pa-per ,FGM was prepared by plasma spraying , the gradient component was designed and analyzed, and the metallo-graphic structure and microhardness of the gradient coating were tested as well as. The results show that theperformance and life time of the FGM have greater improvement than that of the single materials and the com-posite-level materials. It would have a great effect on development of the industrial technology of our countrythat FGM are applied to modern manufacturing industry and material surface modification.Key words; plasma spraying; FGM; structure design(上接第300頁(yè))Synthesis of non-viral gene carrier PEG-PEI and its capability to condense DNALUO Xin'2, PAN Shi-rong' ，FENG Min2 , ZHANG Xuan' , ZHANG Weil ,WEN Yu-ting'(1. The First Affiliated Hospital, SUN Yat sen University, Guangzhou 510080, China;2. School of Pharmaceutical Science, SUN Yat-sen University,Guangzhou 510080, China)Abstract:PEG-PEI graft copolymers were synthesized with IPDI as a coupling reagent, and the copolymers werecharacterized by FT-IR and 'H NMR. The molecular weight of the copolymers were calculated by 'H NMR.The capability of the copolymers to condense DNA was evaluated by agarose gel electrophoresis. It was showedthat the capability of the copolymers to condense DNA was not impaired when grafting 10% and 25% PEG,while the capability was a lttle declined when grafting 50% PE(中國煤化工Key words:non-viral gene crrier; polyethylene glycol; polyethylenC N M H Gte; agarose gel elec-trophoresis