新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究

高技術(shù)通訊2007年7月 第17卷第7期新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究T趙明媚②潘君③吳楊蘭劉穎李永剛王遠亮(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院重慶 4004)滴要通過(guò)直接酰胺化反應,以馬來(lái)酸酐本體改性聚乳酸(MPLA)和氨基封端聚乙二醇(H2N-PEG-NH2)為原料,合成了聚乙二醇本體改性聚乳酸(PPLA)。通過(guò)紅外、核磁共振技術(shù)對改性聚合物的結構進(jìn)行了表征;采用FTC標記牛血清白蛋白(FTTC-BSA)為模型蛋白質(zhì),測試了聚合物對蛋白質(zhì)的非特異性吸附;利用吸水率表征了聚合物的親水性;利用聚合物在12周降解過(guò)程中pH值、失重率的變化評價(jià)了它們的降解特性。結果表明:HN-PEG-NH2已成功接枝到MPLA上;與聚乳酸(PLA)、MPLA相比,PPLA明顯降低了對FTTC-BSA的吸附;其親水性和降解性增加。預計該材料將是一種更適合組織工程和藥物緩釋?xiě)玫木廴樗犷?lèi)可降解材料。關(guān)鍵詞聚乙二醇, 聚乳酸，接枝,親水性,降解性循環(huán)時(shí)間也增加[5)。聚乳酸與PEG的三嵌段共聚0引言物( PLA-PEG-PLA)可提高材料的親水性降解速率聚乳酸(PLA)是研究最早的聚酯類(lèi)生物可降解和生物相容性[16]。材料之一。早在1966年, Kulkarmi等[1]就指出PLA本實(shí)驗室1[7,18]采用馬來(lái)酸酐(MA)、乙二胺對在體內降解生成的最終產(chǎn)物是CO2和H20,其中間PLA進(jìn)行了本體接枝改性,在PLA側鏈上引入了羧代謝產(chǎn)物乳酸是體內正常代謝產(chǎn)物,不會(huì )在體內蓄基和氨基,維持了聚乳酸的主鏈結構，親水性明顯增積,在藥物控釋體系[2]和組織再生3]等方面已有大加,降解過(guò)程不出現pH值陡降現象。本研究在此量應用?；A上,通過(guò)聚乙二醇( PEG)對PLA進(jìn)行本體接枝研究顯示,親水性的表面有利于細胞黏附生改性,旨在維持降低PLA對蛋白質(zhì)的非特異性吸長(cháng)[4.5) ,材料的親水性好,對細胞的親和性則好[6.7]。附，提高其親水性,從而提高它在藥物緩釋及組織工在藥物緩釋領(lǐng)域,需要藥物載體在血液中有足夠的程中的應用性能。經(jīng)文獻檢索,采用本體接枝的方停留時(shí)間，以充分地釋放和利用藥物[8]。而在靶向法引人PEG的研究未見(jiàn)報道。藥物緩釋中,需要幾個(gè)基本的條件才能實(shí)現,其中就1實(shí)驗部分包括降低非特異性的相互作用[9]。隨著(zhù)組織工程的發(fā)展,需要支架通過(guò)特異性的受體介導支架材料和1.1材料的制備細胞之間的相互作用,以調節細胞的生長(cháng),而要實(shí)現馬來(lái)酸酐接枝聚乳酸(MPLA):根據文獻[14]自.這種調節作用,首先就需要控制細胞和支架材料間制，馬來(lái)酸酐的接枝率為2.36% , Mw = 44960。分別的非特異性相互作用10.1]。由于PLA親水性差,缺取1.000g MPLA和0. 587g氨基封端聚乙二醇(H2N-少抗非特異性蛋白吸附的能力,導致其對細胞的黏PEG-NH2 ,Sigma, Mw = 600)用四氫呋喃溶解(THF:重附力弱,也導致其微球在體內的循環(huán)時(shí)間短[12]。慶試劑公司,分析純)溶解。將HN-PEG-NH2溶液研究表明,聚乳酸與聚乙二醇(PEG)的兩嵌段置圓底燒瓶中,水浴50~ 55C攪拌條件將MPLA溶共聚物(PLA-PEG)可以提高材料的親水性、降解速液滴加到圓底燒瓶中。滴加完畢后保溫2h,反應產(chǎn)率及藥物在材料內的分布情況[13] ,延長(cháng)其微球的在物通過(guò)THF-水體系純化,提純直至溶液中無(wú)H2N-體循環(huán)時(shí)間[4);隨著(zhù)表面PEG濃度的增加，其在體PEG-中國煤化工上分析,-般進(jìn)行3YHCNMHG0國家自然科學(xué)基金300084)和國家“111 計劃一生 物力學(xué)與組織修復工程"資助項目。女,1978年生,碩士;研究方向:生物材料; E-mail: chaoningmei@ 163. com河作E:iligaorj@ cqu. edu.cn- 736.. -趙明媚等:新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究遍。收集沉淀,將沉淀物在室溫下真空干燥48h,得重率% weight loss,計算公式為:到H2N-PEG-NH2本體改性聚乳酸(PPLA)產(chǎn)品。% weight loss =W1- W2x 100%1.2 儀器與方法W1- Wo .1.2.1 紅外光譜以THF為溶劑,在KBr晶體上通過(guò)溶劑揮發(fā)鑄2結果與討論膜法制膜,用紅外光譜儀( Perkin- Elmer Spectrum GX2.1 紅外譜圖與解析model)記錄聚合物在400 ~ 400em的吸收光譜。圖1給出了PPLA 的合成機理。如圖1所示，H2N-PEG-NH2通過(guò)與MPLA發(fā)生N-?；磻?生成1.2.2核磁共振譜以氘代氯仿(CDC])為溶劑,四甲基硅烷(TMS).了PPLA。 圖2給出了MPLA與PPLA的紅外圖譜。為內標,用核磁共振波譜儀( Bruker AV 400 0 model )從中看出,與MPLA的紅外圖譜相比, PPLA在測定PPLA的'H-NMR譜圖。.1634cm~'和1577cm~l出現了酰胺鍵的特征-N-H-彎1.2.3 FITC標記牛血清白蛋白(FTC-BSA)在聚合曲振動(dòng)吸收新峰,3100 ~ 3700 cm-1的峰比MPLA的物材料表面的非特異性吸附強度大大提高,這是PPLA中-0H、-NH2 -CONH伸縮分別稱(chēng)取0. 1g PPLA、MPLA和PLA,用5mL THF振動(dòng)峰重疊的結果。圖2結果顯示，MPLA經(jīng)反應.溶解,在直徑為9cm的培養皿內通過(guò)溶劑揮發(fā)48h后已經(jīng)生成PPLA。.成膜，室溫真空干燥至恒重。將10mL、濃度為0.02mg/mL的FTC BSA(Sigma)水溶液加入含聚合物膜的培養皿中,379C靜態(tài)孵育30min,倒掉上清液,CHOH用蒸餾水洗去未吸附的FITC BSA,通過(guò)熒光分光光CHsCH3度計檢測,直至水洗液中檢測不到熒光為止。在倒置熒光顯微鏡(Olympus IX-71)下，以藍色光激發(fā),觀(guān)MPLA測材料表面的熒光并照相。HN-PEG-NH21.2.4吸水率的測定分別稱(chēng)取0.2g MPLA和PPLA,用5mL THF溶0、.p解,加入直徑為10cm, 質(zhì)量為Wo的培養皿中,通過(guò)H溶劑揮發(fā)48h成膜,室溫真空干燥至恒重。加入pH=7.4的PBS緩沖溶液,在(37.0+0.5)C下浸泡」024h。用濾紙吸干表面的水,用電子天平(METLER-0H HNAE100)稱(chēng)重,精確至0.1 mg,記為W,再真空干燥至PEG恒重,稱(chēng)重,記為W2。實(shí)驗重復3次,計算得到吸水H2N'率為Ra=W,- W2PPLaw2-w。圖1 PPLA 合成反應的反應機理(以H2N-1.2.5 降解過(guò)程中pH值和失重率的測定PEG-NH2和MPLA為原料)分別稱(chēng)取0.1g MPLA和PPLA,用2mL THF溶解,加入內徑2cm,高2cm,質(zhì)量為Wo的培養皿中,每個(gè)聚合物制備了36份樣品，通過(guò)溶劑揮發(fā)48h成膜,室溫真空干燥至恒重,并用電子天平稱(chēng)其重量，精確至0.1 mg,記為W: ;在培養皿內加入2mL 0.1MwPPLA的PBS(pH= 7. 4)緩沖溶液,蓋封,置于(37.0土0.5)C孵箱(WGP-300型隔水式電熱恒溫培養箱)中國煤化工中,每周分別取出含MPLA和PPLA的3個(gè)樣品,用[HCNMHPHS-3C型精密pH計測量其上清液的pH值。吸走4000” 30Uuz001500上清液,然后在真空干燥箱內,室溫干燥至恒重,用圖2 MPLA 與PPLA的紅外圖譜電子天平稱(chēng)其重量,精確至0.1 mg,記為W2,計算失一737-高技術(shù)通訊2007年7月 第17卷第7期a~oHt CHCH |-nHC- HiCo=F =0OH NHNH2CH.CHCH2(OCH2CH)mOCH2CHCH3自eddeab(l(d(1):全譜(0~ 8 pm); (I):放大圖譜(1 ~2 ppm)圖3 PPLA的核磁共振氫譜及歸屬2.2核磁共振譜圖與解析圖4吸附在PPLA(a), MPLA(b)和PLA(c)表面的FTTC如圖3所示,a處是PPLA中H2N-PEG-NH2 殘基BSA,在倒置熒光顯微鏡(Olympus IX-71)下,通過(guò)藍色鏈端兩甲基的吸收,d處是PPLA中H2N-PEG-NH2上光激發(fā)得到的熒光相片殘基與氧相連的亞甲基的吸收,e處是PPLA中H2N-2.4吸水率測定試驗解析PEG-NH2殘基上鏈端次甲基的吸收。其它峰的歸屬吸水率常被用于評價(jià)材料的親水性。本實(shí)驗為:b處大的多重峰是原PLA側鏈甲基的吸收,c處室[17]做過(guò)PLA與MPLA的親水性比較,結果表明是與接枝了馬來(lái)酸酐殘基的季碳連接的甲基的吸MPLA比PLA有更好的親水性。由圖5可以看出,收,f的多重峰是原PLA主鏈上次甲基的吸收。通I0 「過(guò)圖譜上歸屬及積分數據,可計算得到PPLA中35 t30 tH2N-PEG-NH2的接枝率為1.5%。2.3非特異性吸附試驗解析圖4給出了PPLA、MPLA及PLA表面吸附的15FITCBSA通過(guò)藍色光激發(fā)得到的熒光相片。從圖4可以看出,PPLA膜表面基本沒(méi)有FTC-BSA的吸附,中國煤化工而MPLA、PLA膜表面則有大量FTIC-BSA的吸附,這MYHCNMHGrrlAPPLA說(shuō)明PPLA明顯降低了FITC-BSA 的吸附。材料圖5 MPLA 與PPLA的吸水率--738.趙明媚等:新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究MPLA的吸水率為16. 97%，PPLA的吸水率為周,而后者從第7周到第10周。這是因為H2N-31.2%,是MPLA的1.84倍,說(shuō)明PPLA比MPLA、PEG-NH2為親水性側鏈,它增加了分子的吸水性,從PLA的親水性增強。而加速水解。而HN-PEG-NH2為弱堿性物質(zhì),在降2.5降解過(guò)程 pH值和失重率變化試驗解析解初期,酯水解產(chǎn)生的-CO0H部分電離形成的H+PLA類(lèi)生物可降解材料的降解主要是通過(guò)水解被堿性氨基中和;但是隨著(zhù)降解的速度加快，大量實(shí)現的,其降解過(guò)程可分為4個(gè)階段,即水化、初期-C00H未能被及時(shí)中和。因此PPLA比MPLA提前降解、深度降解和溶解[19]。進(jìn)入加速降解階段(圖6中PPLA從第5周至第72.5.1 pH 值變化解析周)。在第一階段,水通過(guò)親水基團或者其它分子間2.5.2失 重率變化解析作用力靠近PLA。在這一階段, PLA的化學(xué)結構并圖7顯示,MPLA、PPLA的失重率變化都包括逐不發(fā)生變化,只是PLA鏈松弛,其玻璃化變移溫度漸增加階段和快速增加階段,而PPLA還多了一個(gè)降低,故在這一階段, PLA的pH值基本不變(通常為基本不變階段(從第10 周到第12周)。這是因為2天左右)。接著(zhù),PLA的水化區開(kāi)始發(fā)生酯的水解pH值下降之后才會(huì )出現酸致自催化加速現象,因作用,鏈發(fā)生斷裂,釋放出端-C0OH和端-0H,這時(shí)此,酸致自催化加速現象應滯后于pH下降,酸致自pH值開(kāi)始下降,但由于水化區有限，水解部位不多，催化所引起的失重也應滯后于pH值下降。所以，導致釋放出的-C00H也不多,故pH值下降緩慢,這.對于PPLA來(lái)說(shuō),第10周開(kāi)始時(shí)溶液中的酸性物質(zhì)就對應著(zhù)圖6中MPLA的第1周到第7周。但隨著(zhù)基本達到飽和,導致PPLA材料鏈斷裂生成的低聚物未能溶于溶液,而MPLA溶液中的酸性物質(zhì)還沒(méi)達到飽和,也就沒(méi)有出現失重率基本不變階段。+ PPLA+MPLA11000 t+PPLA世MPLA J012345678910111213降解時(shí)間(周)圖6 MPLA 與PPLA的pH值隨降解時(shí)間的變化曲線(xiàn)水化部位的增多,酯水解的部位也在增多,且隨著(zhù)降圖7 MPLA 及PPLA的失重率隨降解時(shí)間的變化曲線(xiàn)解體系中H+濃度的增大,酸催化的酯水解速率也在增大,釋放出的-CO0H也更多。這兩種效應共同本實(shí)驗室采用相同的MPLA為原料,以乙二胺導致MPLA降解過(guò)程出現了pH值陡降這- -過(guò)程(圖對MPLA進(jìn)行了改性研究[8] ,并對PLA、MPLA和乙6中MPLA的第7周到第10周)。從圖6中MPLA的降解情況可以看出,當降解體系的pH值降至二胺改性材料的親水性[17]和降解性過(guò)程pH值變化6.44時(shí)就開(kāi)始出現加速降解現象。由于這一階段進(jìn)行研究[8]。結果表明乙二胺的接枝率為馬來(lái)酸與水化部位的增多和酸致自催化加速有關(guān),所以凡酐的100% , MPLA的親水性大于PLA, pH陡降時(shí)間是有助于水化和酸性增大的因素都可以提前和加速比PLA提前了1周左右,而乙二胺改性材料在12周MPLA的降解。親水性提高有助于聚合物的水化。的降解過(guò)程中,pH值沒(méi)有出現陡降現象。分析圖6顯示，MPLA、PPLA的pH值變化均呈倒sPPLA降解時(shí)pH值的變化與它不同的原因可能是:47眩的辛水性強, 接枝到形,但在相同的時(shí)間點(diǎn),除了第1、2周PPLA的pHMPL中國煤化工的親水性、降解性;值高于MPLA外,其他時(shí)間點(diǎn)都低于MPLA。二者(2)HYHCNMH G性弱,接枝率比它pH值差異最大時(shí)達4(第7周時(shí)，MPLA的pH值為6.4,PPLA的pH值為2.28);且PPLA的pH值陡降小,以至它沒(méi)有足夠的容量吸收材料降解產(chǎn)生的時(shí)間比MPLA提前了2周左右,前者從第5周到第7H*,導致降解過(guò)程中PPLA材料的pH值出現陡降高技術(shù)通訊2007年7月 第17卷第7期現象,該現象可通過(guò)提高H2N-PEG-NH2的接枝率來(lái)81-92克服。研究表明,由于聚乳酸的降解造成了一個(gè)酸[ 8] Gref R, Minamitake Y, Perchia M T, et al. Biodegradable性的環(huán)境,這個(gè)環(huán)境對多肽、蛋白質(zhì)及DNA都是非long-circulation polymetic nanospheres. Science, 1994, 263:1600-1603常不利的[20),因此可快速降解的生物材料受到人[9] Petrak K. Essential properties of dnug- targeting delivry sys-們的關(guān)注[21]。PPLA 就具有了這個(gè)性質(zhì)。tems. Drug discorery loday, 2005, 10: 1667-1673[10] Grifth L G. Polymeric biomaterials. Acta mater, 2000, 48:3結論263-277[1] Langer R, Trell D A. Designing material for biological and以馬來(lái)酸酐接枝聚乳酸(MPLA)和氨基封端的medicine. Nature, 2004, 428: 487-492聚乙二醇( H2N-PEG-NH2)為原料,通過(guò)在溶劑中的[12] Ishaug S L, Crane C M, Gurlek A, et al. Ectopic bone for-酰胺化反應,成功地將PEG接枝到MPLA上,接枝率mation by marrow stromal osteoblast transplantation using poly為1.5%。吸水率為31.2% ,是MPLA的1.84倍,產(chǎn)(DL-lactic-C0-glycolic acid ) foamns implanted into the rat物的親水性能比PLA明顯提高;降解速率比MPLA、mesentery. J Biomed Mater Res, 1997, 36(1):1-8PLA提高,從第6周起就開(kāi)始加速降解,直至12周，[13] Park S J, Kim S H, Preparation and characterization ofbiodegradable poly( l-lactide )/ poly ( ethylene glycol) micro-降解到達92%,而MPLA在12周時(shí)僅降解50%;產(chǎn)capsules containing erythomycin by emulsion solvent evapo-物明顯降低了對牛血清白蛋白的非特異性吸附。由ration technique. Joumal of Colloid and Interface Science,于該材料特殊的親水性、降解性和抗非特異性蛋白2004, 271: 336-341質(zhì)吸附的性質(zhì),預計在藥物緩釋材料和組織工程中14] Mallard s, Ameller T, Gauduchon J, et al. Inovaive dnug將有廣闊的應用。delivery nanosystems improve the antitumor activity in vitroand in vivo of ani-estrogens in human breast cancer and mul-致謝:感謝重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物材料與仿生工.tiple myeloma. Jounal of Steroid Biochemistry and Molecular程中心對本課題的支持。Biolog, 2005, 94: 11-121[15] Vila A, Gill H, MaCalion 0, et al. Transport of PLA-PEG參考文獻particles across the nasal mucosa: efct of particle size and[ 1] Kulkamni R K, Pani K C, Neaman C, et al. Polylactic acidPEG coating density. Joumal of Controlled Release , 2004,for surgical implants. Arch Surg, 1966, 93 (5): 839-84398: 231-244[ 2] ZhangXC, Mc AuleyK B, Goosen M F A. Towards predi-[ 16] Ruan C, Feng S S. Preparation and characterization of polycation of release profles of anibiotics from coated poly(D,L-(lactic acid)-poly( ethylene glyo)-poly( lactic acid) (PLA-lactide) eylinders. J C ontrol Release, 1995, 34 (2): 175-PEG PLA) microspheres for cortolled release of paclitaxel.179Biomaterials ,2003, 24: 5037-5044[ 3] Cima LG, Vacanti JP, Vacanti C, et al. Tissue engineeing[17]羅彥鳳，王遠亮，潘君等.新型改性聚乳酸及其親/疏by cell transplantation using degradable polymer subtates. J水性研究.高技術(shù)通訊，2003, 2: 47-59Biomech Eng, 1991, 13 (2): 143-51[18] PanJ, Wang Y L, QinS H, et al. Grafing reaction of ply[ 4] WuYC, ShawSY, Lin H R, et al. Bone tisue engneering( D, L)lactic acid with maleic anhydride and hexanedianine toevaluation based on rat calvaria stromal cells cultured onintroduce more reactive groups in is bulk. J Biomed Malermodified PLGAscaffolds. Biomaterials, 2006, 27: 896-904Res B Appl Biomater, 2005, 74 (1): 476-80[ 5] KuoS M, Tsai S W, Huang L H, et al. Plasna modified ny-[19]陳寶林.組織工程材料的細胞相容性研究.呼倫貝爾lon meshes as supports for cell culmring. Ar Cell Blood Subs學(xué)院學(xué)報，2000, 8(4): 54-56and Immo Biotech, 1997, 25: 551-562[20] Weert M, Hennink W E, Jiskoot w. Protein instability in[ 6]郝杰，鄭啟新，郭曉東等.三嵌段高分子骨組織工程poly ( lacico-gycolie acid) miroparticles. Pham Res ,支架材料的制備及細胞粘附性研究.中國生物醫學(xué)工2000, 17 (10): 19-1167程學(xué)報, 2005, 24(2): 129-133[21]中國煤化工Bidlegadable Bnushlike[ 7] Pashkuleva I, Marques A P, Vaz F, et al. Surface modifica-CNMHGharge- Modified Poly( vinyltion of starch based blends using potassium permanganate-ni-avunun/ DaunuIc田a r lawunn sur Dnug Delivery Systems:tric acid system and its ffet on the adhesion and proliferationSynthesis and Characterization. Macromolecules, 2006， 39of oselat-likee cells. J Mater Sci , Mater Med, 2005, 16:(4): 1417-1424萬(wàn)分數據趙明媚等:新型聚乙二醇接枝聚乳酸及其降解特性研究Synthesis and degradation of a new poly( ethylene glycol)-graft-poly(D ,L-lactic acid)Zhao Mingmei, Pan Jun, Wu Yanglan, Liu Ying, Li Yonggang, Wang Yuanliang(Biongineering College of Chongqing University, Chongqing 40044)AbstractA new poly( ethylene glycol) (PEG) graft poly(D, L-lactic acid) (PLA) was synthesized using maleic anhydridegraft PLA (MPLA) and amine terminated PEG (H2N-PEG-N2H) as raw materials. Its structure was confirmed via FTIRand 'H-NMR. The anti-non-specific protein adsorption property was visualized by fluorescent microscopic image with Flu-orescein 5- isothiocyanate (FTTC) conjugated bovine serum albumin ( FTTC- BSA). The hydrophility was tested throughwater uptake. Degradation was investigated by pH change and weight loss during 12 weeks. The results showed that H2N-PEG-N2H was scessully gafed onto MPLA and formed PPLA. Compared with MPLA and PLA, PPLA had prominentproperties of decreasing BSA adsorption and increased hydrophility and degradability, all of which may lead to its poten-tial applications in drug delivery and tissue engineering.Key words: poly( ethylene glycol), poly (D, L-lactie acid), graft, hydrophility, degradability中國煤化工MYHCNMHG-741一