用聚乙二醇分離富集microRNA的方法探討

醫學(xué)分子生物學(xué)雜志，2009. 6 (6): 518-520 JMed Mol Biol, 2009, 6 (6): 518-520DOI: 10. 3870/j. issn. 1672-8009. 2009.06.010用聚乙二醇分離富集microRNA的方法探討駱明勇，鐘華敏廣州市婦女兒童醫療中心兒童醫院檢驗科廣 州市, 510120[摘要]目的 探討用聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 溶液分離富集miRNA的操作方法和分離富集效果，并與Ambion公司的miRNA分離試劑盒分離效果進(jìn)行比較。方法用 PEG溶液和Ambion公司的miRNA分離試劑盒從肝臟組織總RNA中分離商集miRNA,用變性瓊脂糖和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定分離效果，并在富集的miRNA中用RT-PCR擴增miR-122以鑒定是否有效地回收了miRNA。結果PEG 和Ambion公司的miRNA分離試劑盒都能有效地富集miRNA,PEG富集的RNA片段比Ambion公司的試劑盒的大。結論PEG 溶液能有效地分離富集miRNA,和Ambion公司的miRNA分離試劑盒分離效果相當，并具有操作簡(jiǎn)便、快捷及成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。[關(guān)鍵詞] microRNA; 聚乙二醇; miR-122[中圖分類(lèi)號] Q522Isolation and Enrichment of MicroRNA by use of Polyethylene GlycolLUO Mingyong, ZHONG HuaminLaboratory Department of Children's Hospital ，Guangzhou Medical Center for Women and Children,Guangzhou, 510120, China[Abstract]Objective To develop approaches for isolating and enriching microRNA with Poly-ethylene Glycol ( PEG)，in comparison with the microRNA isolation kit produced by Ambion com-pany. Methods microRNA isolation and enrichment were performed in liver tissue with PEG andAmbion microRNA isolation kit. The products produced with two methods were evaluated by electro-phoresis on denatuing agarose gel and denaturing polyacrylamide gel. miR-122 was detected by RT-PCR in the enrichment fraction to verify the recovery of microRNA in isolation process. ResultsPEG method was able to successfully enrich microRNA, similarly to Ambion microRNA isolationkit. The RNA fragment enriched by PEG was larger than that obtained by Ambion microRNA isola-tion kit. Conclusion PEG can enrich microRNA as efficiently as Ambion microRNA isolation kit,with advantage of easy and quick manipulation and low cost.[ Key words]microRNA; polyethylene glycol; miR-122microRNA ( miRNA)是一組生物體基因組編莖環(huán)結構的逆轉錄引物的RT-PCR方法也被發(fā)展了碼的內源的非編碼小RNA ( non-coding small起來(lái)，大大地提高了miRNA檢測的靈敏度[5。但RNA),廣泛分布在動(dòng)植物及病毒等生物體中。研由于miRNA在細胞或組織中含量非常低，從總究表明，miRNA 與動(dòng)植物的發(fā)育、細胞生長(cháng)分化RNA中富集miRNA是miRNA實(shí)驗中- -個(gè)重要的步和凋亡、脂肪代謝以及人類(lèi)重大疾病密切相關(guān)，近驟。目前，-些生物技術(shù)公司已開(kāi)發(fā)出了一些用于年來(lái)成為了生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)!14。分離富集miRNA的商品試劑盒，分離效果好且使隨著(zhù)生命科學(xué)研究的發(fā)展，miRNA 研究方法用方便，但是價(jià)格昂貴。在本研究中，我們擬對采層出不窮并不斷地得到改進(jìn)。研究方法有克隆表用聚乙二醇( polyethylene glycol, PEG) 分離富集達、Northerm 印跡及生物芯片等; -種新的采用帶miRNA的方注進(jìn)行探過(guò)中國煤化工通訊作者:駱明勇(電話(huà): 020-81330633. E-mail: luo-my@ 163.HYHCNMHGCoreponding author: LUO Mingyong ( Tel; 86-20-81330633， E-1.1試劑和儀器mail: luo-my@ 163. com)PEG 6000和氯化鈉購自加拿大BBI公司;人肝醫學(xué)分子生物學(xué)雜志，2009, 6 (6): 518-520 J Med Mol Biol, 2009, 6 (6): 518-520●519●臟組織總RNA和miRNA分離試劑盒( mirVana miR-表1 miR-122 和U6 RNA的RT-PCR引物NAisolationkit)購自美國Ambion公司;糖原購自引物序列(5'→+3')美國Invitrogen公司;低分子量DNA marker購自美miR-122 RT 引物GTCGTATCCAGTCCAGGGTCCGACG-TATCCCACTGGATACGACACAAAC國NEB公司;垂直電泳槽和電泳儀購自美國B(niǎo)io-PCR引物‘正向: GCCGTGGAGTGTGACAATCGTRad公司; PCR儀購自美國MJ Research公司;低溫反向: GTGCAGGGTCCCAGGT臺式離心機購自德國Eppendorf公司;寡核苷酸在英U6 PCR引物 正向: CTCCTCCCAGCACA駿(Invitrogen) 公司合成。反向: AACGCTTCACATTTCCGT1.2實(shí)驗方法1.2.1 PEG 6000 溶液的配制 分別稱(chēng)取PEG2結果6000 13.0g,氯化鈉9.36 g溶于100 ml DEPC處理2.1 miRNA 富集后的電泳鑒定液中。PEG的終濃度為13 % (m/v), 氯化鈉的終肝臟組織總RNA和富集后的LMW掘NA、濃度為1. 6 mol/L。溶解完后用0.2 μm濾器過(guò)濾，HMWRNA的甲醛變性瓊脂糖電泳和變性聚丙烯酰4 C保存備用。1.2.2肝臟組織 miRNA的富集過(guò)程PEG 6000胺凝膠電泳結果見(jiàn)圖1和圖2。溶液富集miRNA的方法簡(jiǎn)要過(guò)程為:在肝臟組織AB總RNA (1 μg/μl) 100 μl溶液中加入等體積的28sPEG 6000溶液，室溫放置10 min;然后在4 C,12 000 r/min離心15 min?？俁NA被分為兩部分，18 s上清液即為低分子質(zhì)量RNA ( low molecular weight18sRNA, LMW RNA),沉淀為高分子質(zhì)量RNA (highmolecular weight RNA, HMW RNA);在上清中加5.8s入0.1倍體積醋酸鈉(3 mol/L, pH 5.2)和糖原is5s(終濃度為1 ng/ul),再加入2. 5倍體積無(wú)水乙醇,圖1甲醛變性瓊脂糖(1.2%，各條帶RNA上樣量都-20 C放置1 h沉淀LMW RNA, miRNA就富集在為0.5 ug) RNA電泳圖LMW RNA中。A: PEG分離電泳圖; B: Ambion 公司miRNA分離試劑Ambion公司的miRNA分離試劑盒(mirVana盒分離電泳圖miRNA isolatin kit)分離富集miRNA按照試劑盒1:總RNA; 2: HMW RNA; 3: LMW RNA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.2.3 miRNA分離富集結果的鑒定 分離后的134LMWRNA和HMWRNA各0.5ug用1.2%甲醛變.性瓊脂糖RNA電泳和15 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)鑒定其分離效果。為了驗證兩種方法是否有效地富集回收了miRNA,我們在富集的樣品中進(jìn)行miRNA的RT-PCR實(shí)驗。由于我們富集用的總RNA是肝臟組織tRNA總RNA,就選取在肝臟組織特異表達的miR-122圖2變性綮丙烯酰胺凝膠(15 %)電泳圖進(jìn)行RT-PCR,并同時(shí)擴增U6 RNA。1:總RNA;2:PEG分離HMWRNA;3:PEG分離miR-122的RT-PCR簡(jiǎn)要過(guò)程為0:對miR-LMW RNA; 4: Ambion 試劑盒分離HMW RNA; 5:122設計--條帶莖環(huán)結構的逆轉錄引物以及相應的Ambion試劑盒分離LMW RNA-對PCR引物(序列見(jiàn)表1);10μl逆轉錄體系中M-MLV逆轉錄酶100單位、50 nmol/L莖環(huán)結構從甲醛變性瓊脂糖電泳圖上可以看出用PEG的引物和U6 RNA逆轉錄引物、LMW RNA 10 ng;沉淀中國煤化工試劑盒都能將高逆轉錄后進(jìn)行PCR, PCR 條件為95 C15s, 60 C分子質(zhì)|Y片CNMHG8srRNA)有效30s，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。同時(shí)在另- -管中擴增U6地去除，只可見(jiàn)5 S rRNA和5.8 S rRNA的條帶,低分子質(zhì)量RNA得到了很好的富集。同時(shí)變性RNA,U6RNA的PCR引物見(jiàn)表1?！?20●駱明勇，等.用聚乙二醇分離富集microRNA的方法探討PAGE電泳圖上都可以清楚地看見(jiàn)，兩個(gè)方法富集的、具有顯著(zhù)優(yōu)越性的方法，在一般的RNA實(shí)驗都可以清楚地看見(jiàn)L.MW RNA的tRNA、5 S rRNA室即可進(jìn)行操作。和5.8S rRNA的條帶，并且在HMW RNA中較少miRNA由于在細胞和組織中含量低，所以不看到5.8srRNA以下的RNA;PEG富集的LMW管是miRNA克隆、Northerm 印跡還是生物芯片檢RNA條帶的加樣孔中的亮度比Ambion公司的miR-測都需要對總RNA進(jìn)行分離富集。分離方法也層NA分離試劑盒分離的亮，并月PEG富集后HMW出不窮，最開(kāi)始研究人員采用PAGE 電泳分離RNA條帶中的剩余的5.8 S條帶較暗，而AmbionmiRNA'),此方法難度大、復雜且操作繁瑣;公司的miRNA分離試劑盒分離后的HMWRNA條Thomson等8率先采用PEG的方法分離富集miR-帶中叮以較多地看到5.8 s RNA部分，說(shuō)明PEGNA,取得了滿(mǎn)意的結果。該方法具有操作簡(jiǎn)便、方法富集的低分子質(zhì)量RNA部分包括有較多的成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，且不影響miRNA的后續反應,5.8S RNA部分。綜上所述，兩種方法都能有效地富集的miRNA可以進(jìn)行各種酶學(xué)反應。近年來(lái)，富集低分子質(zhì)量RNA (包括miRNA部分)，PEG生物技術(shù)公司開(kāi)發(fā)出了各種miRNA分離試劑盒，富集的RNA片段比Ambion公司的試劑盒的大。這些試劑盒方便使用，為研究工作者提供了方便，2.2 miR-122的RT-PCR檢測但是試劑盒都比較昂貴。本研究用PEG的分離方PCR產(chǎn)物的電泳圖見(jiàn)圖3。miR-122 的PCR產(chǎn)法和Ambion公司的miRNA分離試劑盒進(jìn)行了比物長(cháng)度為59 bp, U6的PCR產(chǎn)物長(cháng)度為94 bp。從較，兩種方法都能有效地分離富集miRNA,但RT-PCR結果可以看出，兩種方法富集的低分子質(zhì)PEG的方法具有成本低廉，操作便捷，為研究工量RNA中都能很好地擴增出miR-122和U6 RNA。作者提供了另一個(gè)較好的方法選擇。說(shuō)明兩種方法都能有效地富集回收miRNA。在用乙醇沉淀回收低分子質(zhì)量RNA時(shí)，加入糖元是必需的。糖元作為核酸沉淀的載體可以使bpJ6MiR-122miRNA不易丟失且操作更方便，糖元也可以用如766Takara公司的核酸共沉淀劑等替代。Ambion 公司500的miRNA分離試劑盒也是-個(gè)使用較方便的試劑350盒，但是價(jià)格較昂貴，另外我們在使用Ambion公200司的miRNA分離試劑盒的過(guò)程中也發(fā)現，由于試250劑盒的洗滌緩沖液在低溫下容易析出鹽結晶，如果1501009使用前溶解不充分就會(huì )將鹽分殘留在富集的miR-75NA中,從而影響后面的酶學(xué)反應。595(參考文獻2:[1] BARTEL D P. MicroRNAs: genomies, biogenesis. mechanism, and圖3肝臟組織 miR-122和U6 RNA RT-PCR電泳圖function[J]. Cell ,2004 ,116(2) :281-297.[2] YANG M,LI Y, PADGETT R w. MicroRNAs: Small regultoswith a big impact[J]. Cyiokine Growth Factor Rev ,2005 ,16(4-3討論5) :387 393.[3] WIENHOLDS E, PLASTERK R H. MicroRNA function in animaldevelopment[J]. FEBS Lett ,2005 ,579(26) :591 15922.2miRNA是近年來(lái)生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，研究[4] MISKA E A How microRNAecontrcell division,frtition的方法也發(fā)展得較多，但由于miRNA在細胞和組and death[ J]. Cur Opin Genet Dev ,2005 ,15(5) :563-568.[5] CHEN C, RIDZON D A. BROOMER A J.et al. Real-ime quani.織中含量很低，所以miRNA大部分的的研究方法cation of microRNAs by stem-loop RT-PCR[ J]. Nucleic Acids都需要預先對其進(jìn)行分離富集。本研究對PEG分Res ,2005 ,33(20) :e179.[6]駱明勇.楊戎，張亮，等.MicroRNA122對肝樹(shù)細胞基因表達離富集miRNA的方法進(jìn)行了探討，成功地摸索出譜的影響[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，200 ,23(8):644 -651.了用PEG 6000溶液離心沉淀分離miRNA的方法。[7] BASKERVILLE s. BARTEL D P. Micrarray profiling of micoR.鑒定結果顯示PEG溶液能有效地分離富集miRNA,中國煤化工4i4neigboring miRNAs and并和Ambion公司的miRNA分離試劑盒分離效果相[8]Hal A cuslom microaray當，PEG分離富集的RNA片段略大于A(yíng)mbion公司ods,2004,1(1) :47-53.的miRNA分離試劑盒。但PEC分離富集的方法具(00908-17收稿)有操作簡(jiǎn)便、快捷及成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，是- -種實(shí)用