一種新型枝化聚乙二醇的合成

2007年第15卷合成化學(xué)Vol.15,2007第2期,216~218 Chinese Journal of Synthetic ChemistryNo.2,216~218·快遞論文一種新型枝化聚乙二醇的合成王孝杰,李效東,劉克良2(1.國防科技大學(xué)航天與材料工程學(xué)院湖南長(cháng)沙4100732.軍事醫學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所北京100850)摘要:以谷氨酸作為中心分子首先對谷氨酸的氨基進(jìn)行Boc保護然后在4二甲基氨基吡啶-二環(huán)己基碳二亞胺催化體系的作用下將兩條線(xiàn)性的單甲氧基聚乙二醇(mPEG)鏈連接到谷氨酸的兩個(gè)羧基上合成出含有兩條聚乙二醇PEG)鏈及一個(gè)活性氨基的新型枝化 PEC Glu(PEG)2]其結構經(jīng)HNMR,IR,GPC和VPO表征。關(guān)鍵詞:枝化聚乙二醇;活性氨基;氨基保護;合成中圖分類(lèi)號:0623.4;063文獻標識碼:A文章編號:1005-1511(2007)02-0216-03 Synthesis of Novel Branched Polyethyle Glycol WANG Xiao-jie', LI Xiao-dong', LIU Ke-liang? 1. College of Aerospace and Material Engineering National University of Defence Technology Changsha 410073, China 2. Institute of Pharmacology Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China Abstract: novel branched polyethylene glycol[Glu(peg)2], which consists of two PEG chains and glutamic acidglu) with active amido protected by t-butyloxycarbonyl-(boc), was synthe- sized. Two linear PEG chains in Glu( PEG were linked up through two carboxylic group of the Glu by using 4-dimethylaminopyridine -dicyclohexylcarbodiimide as a catalytic system. The structure of Glu( PEG )was confirmed by'H NMR, IR, GPC and VPO. Keywords: branched PEG; active amido; amido protected; synthesis在當今的藥物傳送領(lǐng)域聚乙二醇(PEG)修具有特殊結構的PEG被稱(chēng)為枝化PEG+1。和線(xiàn)飾是一類(lèi)被廣泛使用的重要方法特別是在改善性PEG相比枝化PEG不僅可以最大限度地保蛋白質(zhì)及多肽藥物的臨床應用方面被認為是目前留被修飾后藥物的生物活性5,而且其特有的最成功的技術(shù)之一1-3。該技術(shù)在實(shí)際應用中存“類(lèi)傘型結構可以更有效地保護蛋白質(zhì)在體內在一些問(wèn)題主要表現在蛋白質(zhì)藥物在PEG修飾不被水解能更有效地阻止抗體接近蛋白質(zhì)藥物,后通常會(huì )導致其生物活性大大降低。近年來(lái)的研從而大大增加蛋白質(zhì)藥物在體內的循環(huán)半衰期,究表明當采用一種具有特殊結構的PEG進(jìn)行修同時(shí)大大降低其在體內的免疫源性781飾時(shí),可以明顯降低修飾后藥物的活性損失這種目前國內外研究和使用的枝化PEG主要是收稿日期:2006-07-12第2期王孝杰等:種新型枝化聚乙二醇的合成217 NH2 NHBoc NaOH, THF/ Bu'-0 00-Bu'+ HO,,H Ho, co, H (Boc )0 Glu NHBoc mPEG, DCC-DMAP, CH, Cl2 >PEGO2CCO,PEG Glu( PEG) Scheme 1以賴(lài)氨酸(Lys)為中心分子的二枝化pG[ Lys ACROS公司叔丁氧羰基酸酐(Boc)2O]吉爾生(PEG)2 Lys PEG在修飾蛋白質(zhì)時(shí)是以化4-二甲基氨基吡啶(DMAP)吉爾生化;二環(huán)蛋白質(zhì)上的氨基作為修飾位點(diǎn)雖然通過(guò)氨基修己基碳二亞胺(DCC)吉爾生化;其余所用試劑飾蛋白質(zhì)是迄今為止最常用的方法而且通常也均為國產(chǎn)分析純試劑使用前經(jīng)干燥處理。是在對蛋白質(zhì)進(jìn)行PEG化時(shí)被采用的首選方案,但這種方法也存在不足最突出的問(wèn)題就是由于1.2合成蛋白質(zhì)分子中可反應的氨基通常不止一個(gè)而使產(chǎn)(1)1的合成物中存在大量的異構體而這種異構體的混合物在燒瓶中加入Glu1.47g(10mmol)水10通常是很難分離純化的。為此目前的PEG化技m,thf20ml及1moll-nao溶液10mL術(shù)在向著(zhù)定點(diǎn)修飾”方向發(fā)展,即修飾劑只在指攪拌使其溶解后加入(Boc)202.6212mmol)定的位點(diǎn)發(fā)生反應。定點(diǎn)修飾不僅可以大幅度降于室溫反應48h(反應中不斷用1mol·L-1低產(chǎn)物中異構體的生成而且還可以通過(guò)設計蛋NaOH調節pH7~8)。反應液減壓蒸餾至10白質(zhì)分子上被修飾位點(diǎn)的位置來(lái)盡可能地保留其mL用1moll-hcl調pH2~3用乙酸乙酯藥物活性。(3×20mL)萃取合并有機相用硫酸鈉干燥減本文合成了一種新型的枝化PEG[Glu壓蒸餾,真空干燥得凝膠狀透明固體1,產(chǎn)率(PEG), Scheme]使用谷氨酸(Glu)作為中94%。心核分子通過(guò)Glu上的兩個(gè)羧基連接兩條線(xiàn)性(2)Glu(PEG)2的合成的mPEG鏈。Glu的氨基通過(guò)叔丁氧羰基(Boc)在燒瓶中加入11.0g(4mmol),mPEG6.0保護得1去保護后氨基可以方便地轉化為馬來(lái)8mmol),dC1.6g(8mmol)及dmap0.2g酰亞胺基團該基團對半胱氨酸上的巰基進(jìn)行修(1.6mmol)攪拌下于室溫反應5h過(guò)濾除去飾是蛋白質(zhì)修飾化學(xué)中最有效的定點(diǎn)修飾手段之不溶物濾液經(jīng) mol Na2co3及飽和aCl12】作為后期修飾蛋白質(zhì)時(shí)的反應位點(diǎn)。該方溶液洗滌硫酸鈉干燥減壓蒸餾真空干燥得白法合成路線(xiàn)簡(jiǎn)單,成本低,所得產(chǎn)物修飾特異性色固體 Glu PEG產(chǎn)率80%hnm8:1.44強具有很高的應用價(jià)值。相關(guān)研究國內外尚未(s,9h,H3),2.25(m,4h,ch2 of Glu),3.38見(jiàn)文獻報道。(s,6H,OCH3),3.64(m,132H,OcH2CH2),4.28(s,4h,co2H2)1實(shí)驗部分2結果與討論1.1儀器與試劑 Varian INOVA--300型核磁共振儀(CDCl3為1和Glu(PEG)2的IR譜圖見(jiàn)圖1。由于1溶劑TMS為內標)Nicolet Mangna IR--550紅有兩個(gè)羧基所以在圖1中的1715(C=0)c1外光譜儀(KBr壓片) Waters1515-2414型凝膠處出現很強的吸收此峰在Glu(PEG中卻消滲透色譜儀(簡(jiǎn)稱(chēng)GPC,THF為溶劑)KNAUER失表明1上的兩個(gè)羧基反應了。而在GluK-7000型蒸汽壓力滲透儀簡(jiǎn)稱(chēng)YP)(PEG)譜圖中卻出現了1740(C00)cm強吸218合成化學(xué)Vol.15,20071098cm-1處有較強的吸收,該處是醚鍵(C參考文獻0-C)的伸縮振動(dòng)吸收峰這是由于PEG鏈中存在大量的醚鍵導致的(1715,1603,120)[1] Harris Martin Modi. Pegylation novelcm-處的吸收分別是氨基甲酸(N-C-O)基團 process for modifying pharmacokinetic J ] Clin Phar- macokinet 2001 40 539-551.的對稱(chēng)及不對稱(chēng)吸收這一組峰是由Boc-HN產(chǎn) [2] Kartre K. The conjugation of proteins with poly( ethyl-生的(1452,1362)cm-處的吸收為叔丁基的 ene glycol) and other polymers[j]. Adv Drug Deliv特征吸收是由Boc上的叔丁基引起的。所有的Rev9931091-114數據與枝化PEG的分子結構相吻合。 [3] Walsh G. Second-generation biopharmaceuticals[ J Eur J Pharm Biopharm 2004 58 185-196 GMPEG)2 [4] Monfardini, Schiavon O Caliceti,et al. branched monomethoxypoly( ethylene glycol) for protein modifica- tior{ J Bioconjugate Chem 1995 6 62-691 [5 Veronese F, Pasut G. PEGylation successful ap proach to drug delivery[ J ] Drug Discovery Today.2005101451-1458. [6] Veronese F M Caliceti, Schiavon 0. Branched and4000300020001000 linear poly( ethylene glycol J ] Bioactive Compatible v/cm-I Polym199712196-207圖11和Gl(PEG)2的IR譜圖 [7] Caliceti, Schiavon, Veronese F M. Immunological Figure 1 IR spectra of 1 and Glu PEG properties of usricase conjugated to neutral soluble pol-圖2為Glu(PEG)2的GPC圖。GPC譜圖結 ymerd]. Bioconjug Chem 2001 12 515-522果表明產(chǎn)物中有兩種物質(zhì)其中主要產(chǎn)物的相對8】 Veronese Monfardini Caliceti et al Im provement of pharmacokinetic immunological and sta-分子量峰值為1995次要產(chǎn)物的相對分子量峰值 bility properties of asparaginase by conjugation to line-為927經(jīng)分析其中主要產(chǎn)物是Glu(PEG)2次要 ar and branched monomethoxypoly( ethylene glycol產(chǎn)物為只連接了一條鏈的不完全產(chǎn)物。根據峰面 J] Control Release ,1996 40199-209積比例計算,Glu(PEG)2的含量為80%由于[9] Andrea, Michela, Chiara,etal. An improvedGPC所測得的結果是相對于聚苯乙烯(PS)的相 procedure for the synthesis of branched polyethylene對值所以所得結果與真實(shí)值之間存在一定的偏 glycols(pegs) with the reporter dipeptide met--ala差。過(guò)柱純化后經(jīng)VPO測試結果表明主要產(chǎn)物 for protein conjugation[ J ] Bioorg Med Chem Lett,的數均分子量為1783。由于原料mPEG本身的200212177-180分子量具有一定的分散度,所以所測結果與lu0 Caliceti Veronese Pharmacokinetic and bio(PEG)2的分子量(理論值為1712)較為吻合。 tein conjugates[ J ] Adv Drug Deliv Rev,2003,55:30.019951261-127720.011] Andrea, Mirta Michela,etal. Anchimeric assistance effect on regioselective hydrolysis of10.0 branched PEGS[ J ] Bioorg Med Chem, 2004,12:5031-5037.0.0 12] Roberts M, Bentley M, Harris J M. Chemistry4.08.012.018.020.0 for peptide and protein PEGylation J ] Adv Drug De- Minutes liv Rev200254459-576.圖2PEG2的GPC譜圖 Figure 2 GPC. spectrum of PEG2