甲醇降解菌的分離及性質(zhì)研究

第11卷第3期生物技術(shù)Vol.11 ,No.32001年6月BIOTECHNOLOGYJun 2001中圖分類(lèi)號:Q93 - 331文獻標識碼:A .文章編號:1004- 311X( 2001 )3- 0021- 03甲醇降解菌的分離及性質(zhì)研究宋志文'陳冠雄' ,馬放2楊基先2( 1.中國科學(xué)院沈陽(yáng)應用生態(tài)研究所遼寧沈陽(yáng)110016 ;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江哈爾濱150001 )摘..要對氮肥廠(chǎng)活性污泥進(jìn)行馴化篩選得到 3株甲醇降解菌,可耐10 00mg/L左右的甲醇濃度實(shí)驗得出其最佳生長(cháng)條件為pH7~ 8、溫度30C~ 35C、通氣,在適宜條件下對甲醇有較好的降解能力。關(guān)鍵詞:甲醇降解菌馴化生物降解甲醇作為一種有機污染物廣泛存在于基測定0OD5so吸收值。本有機合成、塑料、人造纖維、制藥、離子交換1.5 細菌計數采用平板菌落計數法7]。樹(shù)脂、石油化工、林業(yè)化工及硫酸鹽紙漿等生1.6 申醇的測定采用氣相色譜法島津GC產(chǎn)廢水中[1。甲醇對人體和水生生物和微生- 102型氣相色譜儀分析,檢測器為FID ,檢物均有毒性1。對于甲醇廢水的處理主要有測器、進(jìn)樣口、色譜柱的溫度分別為170°C、物理化學(xué)處理方法和生物處理方法231。由190C、180C高純N2作載氣填料為GDX -于申醇的生物可降解性極大,因而生物處理10260目~80目)方法就顯得更為重要456。較高濃度的甲醇對細菌有毒害作用,從而影響處理效果。2結果與分析分離和篩選降解甲醇的高效菌株，是這類(lèi)廢水生物處理的重要環(huán)節。本研究采用馴化的2.1 菌株鑒定分離出3株可以以甲醇為唯方法篩選出對甲醇有較強降解能力的菌株,一生長(cháng) 碳源降解甲醇的細菌編號為PI、P2為此類(lèi)廢水的工業(yè)化處理提供微生物基礎。P3根據細菌的菌落特征個(gè)體形態(tài),生理生化反應,按文獻8鑒定為假單胞菌屬細菌1材料與方法( Pseudomonas sp :2.2菌 株的適宜生長(cháng)條件1.1 培養基2.2.1甲醇濃度對細菌生長(cháng)的影響1.1.1 牛肉膏蛋白胨培養基:牛肉膏3g/L取3種菌株母液各1ml 分別加入到含有蛋白胨5g/L葡萄糖4g/L氯化鈉5g/L瓊脂不同濃度甲醇的100ml 選擇培養基中,置搖20g/L pH7.0~7.2。床中反應72h,取反應液進(jìn)行細菌平板菌落1.1.2選擇培養基:K2HPO40.5g/L計數。結果見(jiàn)表1。KH2PO40.5g/L MgSO40.3g/L ( NH4 )SO4表1甲醇濃度對細菌生長(cháng)的影響. 1.0g/L微量元素液10ml ,pH7.0- 7.2 ,加入.甲醇濃度P1細菌數( 10 )P:( mg/L)一定量 甲醇。1.1.3 微量元素液配方:ZnSO40.2g/L、FeS-93.4.4.54.13.3187.64.73.93.7040.5g/L CaCl23 .0g/ L MnSO40.06g/I。1.2菌種的馴化將從某氮肥廠(chǎng)得到的活性403.53.8污泥加到含100ml/L 甲醇的選擇培養基中，773. 92.72.9之后每天按2倍比例加入甲醇,至甲醇濃度.1357.82.62.1為12800mg/L將菌液轉移到新配制的選擇3074.30.40.210.18培養基中，重復馴化2次后_取0.2ml菌液在6418.90.090.0120.07牛肉膏蛋白胨培養基上涂平板32C恒溫培12134.50.0330.0041.3生長(cháng)條件 :考察不同甲醇濃度、溫度、二從表1中可以看出,3種菌株對甲醇均pH、供氧狀況、氮源及尿素含量對細菌生長(cháng)表現出較強的耐受性,當甲醇濃度在93.4mg/L~ 1357 .8mg/L時(shí),細菌數量保持在的影響。1.4 細菌密度測定:以空白培養基作對照,106數量級隨著(zhù)甲醇濃度的提高,細菌數有所下降,在甲醇濃度高達12134 . 5mg/L時(shí)仍收稿日期2001 - 01- 02 ;修回日期2001-04- 03有一定數量的菌株存活。作者簡(jiǎn)介宋志文( 1966- ),男博士生工程師,從事工2.2.2培養時(shí)間對細菌生長(cháng)的影響:取3種業(yè)廢水的生物處理、環(huán)境微生物學(xué)研究發(fā)表論文4篇。菌株母液各1ml 分別加到含有甲醇200mg/LpH7.0的100ml 選擇培養基中329C搖床22生物技術(shù)第11卷第3期培養,每隔一定時(shí)間取樣測反應液0ODo值，329培養箱和 120r/min搖床上培養72h后，結果見(jiàn)圖1。 .取樣測定0OD5so值結果見(jiàn)圖4。0350.4[0.33t0.25口靜置■振蕩)2 F80.150.10.051224364860728496108時(shí)間(b)PP2蘭株圖1培養時(shí)間對細菌生長(cháng)的影響從圖中可以看出3種菌株的生長(cháng)曲線(xiàn)圖4供氧狀況對細菌生長(cháng)的影響不同,P1、 P2、P3進(jìn)入穩定期的時(shí)間分別為從圖中可以看出振蕩培養的細菌生長(cháng)明60h、36h和36h ,在穩定期持續的時(shí)間分別為顯好于靜置培養的細菌說(shuō)明分離的菌株生36h、24h和36h。長(cháng)要在好氧條件下進(jìn)行,因此在實(shí)踐中應用2.2.3培養溫度對細菌生長(cháng)的影響:取3種.這些菌株處理甲醇廢水或進(jìn)行甲醇污染的現菌株母液各1ml 分別加到含有200mg/L 甲場(chǎng)修復需要保持良好的通氣(曝氣條件,否醇、pH7.0的選擇培養基中在不同溫度下?lián)u則將影響菌株的生長(cháng)。，床反應72h測反應液ODso值結果如圖2所2.2.6不同氮源對細菌生長(cháng)的影響:取3種示。結果表明3株細菌均為中溫菌,在159 .菌株母液各1ml,分別加到含有不同氮源的~40C范圍內溫度對細菌的生長(cháng)影響相對氮源培養基中在適宜條件下培養72h取樣測定ODs5結果見(jiàn)圖5。結果表明,3株細菌較小最適生長(cháng)溫度為30°C~35°C。的最佳氮源是牛肉膏,P1 和P3的次佳氮源2.2.4 培養基初始pH對細菌生長(cháng)的影響:是尿素P2的次佳氮源是硝酸銨。取3種菌株母液各1ml分別加到含有200mg/L甲醇、不同pH的100ml選擇培養基中置圈P10P2于搖床中32C條件下反應72h結果見(jiàn)圖3。OP30.4 [0.20.350.15P30尿素硫酸銨 硝酸銨.硝酸鈉牛肉膏圖5不同氮源對細 菌生長(cháng)的影響1520 2530 3510 溫度2.2.7_尿素含量對細菌生長(cháng)的影響:取3種.菌株母液各1ml 分別加到含有不同含量尿.圖2培養溫度對細菌生長(cháng)的影響素的100ml選擇培養基中,在適宜條件下反應72h取樣測定0OD6o值結果見(jiàn)圖6。.).25 [0.→P1-P2--P0:。00.4P 0.389pH0.5圖3培養基 pH對細菌生長(cháng)的影響尿素含量(%)從圖中可以看出3株菌生長(cháng)的最適pH為7~8 ,P1對pH比P2、P3更敏感過(guò)酸或過(guò)圖6尿素含量對細菌生長(cháng)的影響堿均不利于菌體生長(cháng)。從圖中可以看出,低含量尿素( 1% ~2.2.5供氧狀況對細菌生長(cháng)的影響:試驗是2%)對3種菌株的生長(cháng)均有很大的促進(jìn)作以搖床培養作為好氧靜置作為缺氧條件進(jìn)用。在氮肥廠(chǎng)合成氨生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的甲醇行的取3種菌株母液各1ml分別加到含有廢水中通常含有少量的尿素[9。從實(shí)驗結果200mg/L用數糖l7.0的選擇培養基中,在來(lái)看1%~2%含量的尿素可作為細菌生長(cháng)第11卷第3期生物技術(shù)Vol.11 ,No.32001年6月BIOTECHNOLOGYJun 2001的氮源促進(jìn)細菌的生長(cháng)。P3進(jìn)入穩定期的時(shí)間分別為60h、36h和2.3降解甲醇的能力36h在穩定期持續的時(shí)間分別為36h、24h和取3株細菌母液各1ml分別加入到含有36h 3株細菌的最適生長(cháng)條件為_(kāi)pH7 ~ 8、不同濃度甲醇的100ml 選擇培養基中,在適30°C ~ 35°C、振蕩培養,最佳氮源是牛肉膏_宜條件下反應12h測定甲醇含量,計算甲醇少量尿素(1%~2%對細菌生長(cháng)有很好的促降解率結果見(jiàn)圖7。進(jìn)作用在適宜條件下，當甲醇濃度< 300mg/100L時(shí)3株細菌對甲醇降解率均很高,經(jīng)12h降解率在80%以上。隨著(zhù)甲醇濃度加大降80解能力也隨之降低,在低濃度甲醇條件下3株細菌對甲醇的降解能力基本相同,在高濃度條件下,P1對甲醇的降解效果明顯好于P2、P3。根據菌株的性質(zhì)有可能將其投加到活性污泥或生物膜中處理甲醇廢水，從而為甲醇廢水的生物處理提供微生物學(xué)基礎。筆93 188 40.4 77.4 135.8 307.4 641.9 1213.5者將分離篩選的菌株固定在顆?；钚蕴?ZJ甲醇含量(m/L)- 15 )上處理輕度污染甲醇廢水取得了一 定效果10]圖7細菌對甲醇的降解能力參考文獻:從表中可以看出在甲醇濃度< 300mg/L[1I蘇JM.格魯什科.工業(yè)廢水中有害有機化合物手冊時(shí)3株細菌對甲醇降解率均很高,在80%以[MI北京化學(xué)工業(yè)出版社: 1988 208 -211.[2馮錫康主編。有機化工廢水治理技術(shù)[ M].北京:化學(xué)上。隨著(zhù)甲醇濃度加大,降解能力也隨之降[3趙洪波.國內甲醇廢水處理技術(shù)應用現狀[J]化工環(huán)工業(yè)出版社低在低濃度甲醇條件下3株細菌對甲醇的保,1998 ,18(6):154~ 157.降解能力基本相同,在高濃度條件下,P1 對[4 Novak J T C D ,Benoit，et al . Biodegradation of methanol and甲醇的降解效果明顯好于P2、P3。tertiary butyl alcohol in subsurface systems[ J ] Water Sci._Technol.1985 ,17 71~ 85.[ 5 ]Anthony C.The _oxidation of methanol in gram - negative bacte-3結論nid J ] FEMS Microbiology Reviews. 1990 87( 3-4 ):209~ 214.[ 6 ]Kinagata K. Systematics of methanol - utilizing bacteria[ J ].從氮肥廠(chǎng)活性污泥中分離出3株能夠以7 BMicrobicly Reivcs9087 3-4)0122出甲醇為唯一碳源降解甲醇的細菌，編號為[7祖若夫等，微生物學(xué)實(shí)驗教程M jP1、P2、P3經(jīng)鑒定均為假單胞菌屬細菌，這3版社,1993 :株細菌可在10 000mg/L的甲醇濃度中存活。;8中國科學(xué)院微生物研究所細菌分類(lèi)組編著(zhù).一般細菌常用鑒定方法M 1.北京科學(xué)出版社1978 :135 ~ 194試驗表明3種菌株的生長(cháng)曲線(xiàn)不同,P1、P2、: 9國家環(huán)境保護局石油石化工 業(yè)廢水治理M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社.1992 :461 - 535[10宋志文陳冠雄,馬放。微生物固定化處理甲醇廢水的實(shí)驗研究J]微生物學(xué)雜志2000 244 )30~31.Isolation and characterization of bacteria capable of degradingmethanolSONG Zhi- wen' CHEN Guan- xiong' ,MA Fang2 ,YANG Ji - xian2( 1. Institute of Applied Ecology Academia Sinica Shenyang 110016 ;2. Harbin Institute of Technology Harbin 150001 China )Abstract :Three strains of bacteria which can highly degrade methanol have been obtained by enriching ,screening and acclimatizing the strains in active sludge gotten from a fertilizer factory . These bacteria cantolerate methanol of 10 ,000mg/L ,The optimum culture conditions are pH7 ~ 8 30C ~ 35C and aera-tion. At th5op麴據n conditions their degrading capacities are very efficient.Key words imethanol degrading bacteria jacclimatization ;biodegradation