聚乙二醇對不同濃度肺表面活性物質(zhì)活性的影響

中國小兒急救醫學(xué)2007年8月第14卷第4期Chun Pedatr Emerg Med, Aug 2007 Vol 14, No4●317●聚乙二醇對不同濃度肺表面活性物質(zhì)活性的影響孫麗萍甘小莊董聲煥宋國維郭琳瑛王翀李紅日[摘要]目的觀(guān)察非離子聚合物聚乙二醇(PEG)對不同濃度肺表面活性物質(zhì)(PS)活性的影響。方法(1) 體外實(shí)驗:利用團泡式表面張力儀測證PEG、不同濃度PS(Curosurf)、血漿及混合物的最大表面張力(Ymax)和最小表面張力(rmin),并計算其穩定系數(S.1.)。(2) 體內實(shí)驗:大鼠經(jīng)氣管滴入3 mg/ml的3X 109 CFU/ml大腸桿菌, 24~36 h后,對大鼠行氣管插管并左側頸動(dòng)脈插管術(shù)，機械通( 15 mn。然后將Pa02≤26.6 kPa的大鼠隨機分為三組,經(jīng)氣管分別滴入2 ml/kg生理鹽水(NS組)，Curosurf(PS 組) Curosurf與5% PEG混合物(1/2PS+ PEG組)。另設正常對照組(不給細菌)。大鼠機械通氣180 min后，用生理鹽水[20 m/(kg'次)]灌洗大鼠右肺三次，測定灌洗液的ymin。結果(1) 體外實(shí)驗:1.25 mg/ml的PS ymun<2 mN/m,S. 1.>1.6,而0.62 mg/ml和0.31 mg/ml的PS Ymun >10 mN/m,S.1. <0.8;加入5% PEG后，混合物ymn<2 mN/m,S.1.>1.6;血漿存在時(shí)，不同濃度PS與PEG混合物不同程度地降低了rmin, 提高了S.1.存在1%血漿時(shí).1.25.0.62 mg/ml PS與PEG混合物ymun<2 mN/m,S.1.>1.6,并且組間差異無(wú)顯著(zhù)性(P>0.05)。(2) 體內實(shí)驗:1/2PS+ PEG組和PS組大鼠肺泡灌洗液rmun與正常對照組比較差異無(wú)顯著(zhù)性(P>0.05),與NS組比較顯著(zhù)降低,差異有顯著(zhù)性(P <0.05);組間比較差異無(wú)顯著(zhù)性(P>0.05)。結論PEG可以在一 定 程度上提高不同濃度PS的活性，逆轉因血漿蛋白引起的失活。[關(guān)鍵詞]聚乙二醇 ;肺表面活性物質(zhì);表面張力;穩定系數The effect of polyethylene glycol on activation of different concentrations of pulmonary surfactant SUNLx ping, GAN Xrao zhuang, DONG Sheng-huan, et al. Caprtal Insttute of Pedatrcs, Beyrng 100020,China .[Abstract] Objective To investgate the effect of polyethylene glycol(PEG) on activation of dufferentconcentrations of pulmonary surfactant(PS). Methods (1) In vitro expenment; The maximum( yYmax) andminmum surface tension(ymun) of PEG, dufferent concentrations of PS(Curosurf), plasma and ther muxtureswere measured by captive bubble surfactometer, respectively. Values of stabulty index(S. I.) were also calcu-lated. (2) In vivo expernment: Rats recerved a dose(3 ml/kg, 3X 10"CFU/ ml) of E. coli via the arways. After24~ 36 h, the anumals were ventlated for 15 min and treated vna the tracheal cannula wth 2 ml/kg salne(NSgroup), Curosurf(PS group) or a muxture of Curosurf and 5% PEG(1/2 PS + PEG group) when PaO2≤26.6 kPa. Control animals were not recerved bacterna. After 180 min ventlation wnth 100% O2. anumals weresacnfnced. The nght lungs were washed for three times wth salne[20 ml/ (kg* tume)]. The lung lavage fluidwas centrifuged and measured. Results (1) In ntro:The rmin of 1.25 mg/ml PS was <2 mN/m and S. I.> 1.6. The Ymin of 0.62 and 0.31 mg/ml PS was > 10 mN/m and S.1. <0.8. When 5% PEG ad ded, yminwas <2 mN/m and S.I. >1.6 PEG significanly enhanced the abulty of curosurf n reducing the Ymin andelevatingS. 1.in the presence of plasma. (2) In vivo: There were no significant dfference in yrmin of lunglavage flud between PS, 1/2PS + PEG, and control group; The Ymun values in PS and 1/2PS+ PEG groupwere less than that of NS group(P <0.05), and there were no signficant dfference between PS and 1/2PS+PEG group. Concusion PEG enbanced the ablty of dfferent concentrations of PS to reduce surface tentionand reversed the inactivaton of PS induced by plasma.[Key words] Polyethylene glyol; Pulmonary surfactant;Surface tension; Stablty index肺表面活性物質(zhì)(PS)治療新生兒呼吸窘迫綜性的影響。合征(RDS)取得了良好效果,而對急性肺損傷1 材料和方法(ALI)及呼吸窘迫綜合征(ARDS)的治療效果仍不1.1實(shí)驗 動(dòng)物健康Sprague-Dawley(SD)雄性理想。因為ALI及ARDS的主要病理改變之一是大鼠,220~240g,維通利華實(shí)驗動(dòng)物技術(shù)有限公肺毛細血管通透性增高,大量的血漿蛋白滲出到司提供。肺泡,抑制了PS的功能”。本實(shí)驗的目的是觀(guān)察1.2實(shí)驗試劑固爾蘇(Curosurf)為意大利非離子聚合物聚乙二醇(PEG)對不同濃度PS活Chies"中提取的天然PS制劑:TYH中國煤化工懸液。冰凍人血漿由CNMHGt,蛋白質(zhì)含量大基金項目:北京市自然科學(xué)基金資助項目(7042018)于50 g/L,其中白蛋白64.4%,球蛋白23.0%,纖.作者單位7100020,首都兒科研兗所通訊作者:甘小莊, E-mal: ganxz@ hotmal. com維蛋白原1.68 g/L。PEG 分子量10 000,為Sigma●318●中國小兒色數醫學(xué)2007年8月第14卷第4期_ Chin Peduatr Emerg Med, Aug 2007, Yol 14, No 4公司產(chǎn)品。大腸桿菌(011B4 E. coli)由中國藥品生分析(ANOVA),兩組間均數比較,方差齊時(shí)用S物制品檢定所提供。N-K法檢驗,方差不齊用Games-howell法檢驗, P1.3 實(shí)驗儀器 CB-I型閉泡式表面張力儀在可<0.05為差異有顯著(zhù)性?？亻]泡式表面張力儀基礎上有所改進(jìn)[2],由北京2結果分析儀器研究所與首都兒科研究所聯(lián)合研制。2.1體外實(shí)驗560E振蕩器為美國科學(xué)工業(yè)聯(lián)合公司產(chǎn)品。低溫2.1.1不同制劑γmin和S.I.測定結果生理鹽離心機為德國Eppendorf 5804R。SC-Y200 呼吸機水、PEG、血漿及混合物γmin均大于10mN/m,為上海醫療器械四廠(chǎng)產(chǎn)品。S.I.小于0.8,都不具有PS的活性，見(jiàn)表1。1.4實(shí)驗方法表1生理鹽水 、PEG及血漿混合物ymn和s.1.間的比較(x士s)1.4.1體外實(shí)驗1.4.1.1待測液體配制生理 鹽水溶解PEG,使PEG與血漿混合物Ymun(mN/m)s 1.生理鹽水28.9710.750.36+0.03其濃度為5%。冰凍人血漿在37 C水浴中融化5% PEG28.08土1 110.27+0.03后,加到5%的PEG溶液中,使其終濃度為1%或1%血漿34.15+0.490.27士0.012%。Curosurf(80 mg/ml)用生理鹽水稀釋,濃度2%血漿31.89土1.760.29 +0.04分別為1.25.0.62、0.31 mg/ml,振蕩混勻,現用現5%PEG+ 1%血漿29.68+1.110.36士0.05配。5% PEG+ 2%血漿27.41+1 690.39+0 061.4.1.2表面張力測定在安裝密封環(huán)的5 ml2.1.2 PEG 對不同濃度PS與血漿混合物的影響玻璃注射器的頂部制成一一個(gè)1%的瓊脂糖支撐面，1.25 mg/ml的PS ymin <2 mN/m,S.1.>1.6;下面裝有待測液體。用微量注射器將30μl空氣.0.62 mg/ml和0.31 mg/ml的PS ymin> 10 mN/m,注入待測液體,使形成的氣泡在瓊脂糖底部正S.I. <0.8;加入5% PEG后,混合物rmin<2 mN/中2]。注射器固定在37 c恒溫水槽的支架上。.m,S.1.>1.6。即使存在血漿時(shí), PEG與不同濃度常壓下在讀數顯微鏡下測量氣泡的高度及橫徑,PS混合,仍能不同程度地降低ymin,提高S.1.。見(jiàn)測得最大表面張力( ymax)。通過(guò)穩壓閥給氣系統表2,3。加壓至150 kPa,用拉桿(三通閥)排氣,穩定在加表2不同濃度Cunourf與PEG及壓狀態(tài)，再測量氣泡的高度及橫徑,測得最小表面血漿混合物yrman的比較(土s,mN/m)張力(ymin)。一般PS的rmin應小于10毫牛頓/PEG與血漿Curour(mg/ml)米(mN/m)。穩定系數(S. I.)=2 x (Ymax -混合物.1.250.620.31γmin)/(ymax+ γmin),正常在0.8以上。1.54+0.03 21.78+1.69" 21.85+1.78*1.4.2體內實(shí)驗大鼠氣管滴入3 m/kg的3x5%PEG1.37+0.12 0.85 土0.06*0.83 +0.08*109 CFU/ ml的大腸桿菌(E. coli),24~36h后,對18.98士0.46 23.55+1.12* 25.28+2 24*#大鼠行氣管插管并左側頸動(dòng)脈插管術(shù),機械通氣22.94+0.42 28.47+2.48* 32.75t3 83*5%PEC+1%血漿1.59土0.221.68士0.156.18士0.38* #[頻率50次/ min;吸氣時(shí)間0.55 s;吸氣時(shí)間/呼氣5%PEG+2%血漿1 43土024 4 84土0 35°_ 19 24土0.96*#時(shí)間1:1.2;呼氣末正壓4~6 cm H2O(1 cm H2O=注:與1.25 mg/ml Curosur組比較，. P<0.0S;與0.62 mg/ml0.098 kPa);氧流量8 L/min;潮氣量8~ 10 ml/Curosurf組比較，#p<0.05。kg]。15 min后，PaO2≤26.6 kPa的大鼠隨機分為表3不同濃度 Curosurf與PEG及三組:經(jīng)氣管分別滴入2ml/kg的生理鹽水(NS血漿混合物s.1.間的比較(壓土s)組)、Curosurf (160 mg/kg, PS組)及CurosurfCuroeurf(mg/ml)(80 mg/kg)與5% PEG混合物(1/2PS+ PEG組)?；旌衔锪碛幸唤M動(dòng)物不給細菌,為正常對照組。分別機1.71+0.01 0.44士0.08* 0.47 +0.07*械通氣180min后,頸動(dòng)脈放血處死大鼠,原位結1.76+0.02 1.85士0.01* 1.85 t0.01*扎左側支氣管,生理鹽水用量20ml/(kg*次),經(jīng)氣0.38士0.05 0.3610.05 0.33 +0.13管插管灌洗右肺3次,每次重復3遍,收集灌洗液，0.34士0.02 0.40+0.08 0.31 40.085%F中國煤化工031.15+0.06**回收率> 85%,4 C離心(3000轉/min) 10 min,上5%P0S° 0.17+0 04*清液用于表面張力的測量。MHc N M H Go0.05;與0.62mg/m1.5統計方法實(shí)驗數據以均值士 標準差.Curosurf組比較，#P<0.05.(G土s)表示,采用SPSS 12.0統計軟件進(jìn)行方差2.2體內實(shí)驗1/2PS+ PEG組和Ps組大鼠肺泡中國小兒急救醫學(xué)2007年8月第14卷第4期Chn Pedatr Emer Med, Aug 2007 Vol 14.No 4灌洗液ymin與正常對照組比較,差異無(wú)顯著(zhù)性同濃度的Curosurf都失活;當加入PEG時(shí),又不同(P>0.05),與NS組比較顯著(zhù)降低; 1/2PS+ PEG程度地提高了它們的活性。這和國外學(xué)者[8-10]報組與PS組間差異無(wú)顯著(zhù)性(P>0.05),見(jiàn)表4。道的非離子聚合物(PEG、葡聚糖)可以逆轉PS因表4各組間大鼠肺 泡濮洗液最小表面張力的比較(丘士s)血漿、胎糞等引起的失活,提高了Survanta(從牛肺組別數量(只) .組織提取的PS)降低肺泡表面張力的能力是- -致正常對照組24.38士1.73的。NS組36.68士8.23*我們應用大腸桿菌制造了ALI動(dòng)物模型,因Ps組26.88土1.87*肺毛細血管通透性增高,大量的血漿蛋白滲出,抑1/2PS+ PEG組25.25+4 12#注;與正常對照組比較, 'P<0.0S;與NS組比較, "p<0.05.制了PS活性。實(shí)驗結果表明，1/2PS+ PEG組和PS組大鼠肺泡灌洗液的γmin與正常對照組沒(méi)有3討論3.1 閉泡式表面張力儀的應用 表面張力測定顯著(zhù)差異;與NS組比較,顯著(zhù)降低。這說(shuō)明在半是了解肺PS物理性能的重要手段。表面天平被量PS中加入PEG,增強了低濃度PS降低肺泡表稱(chēng)作經(jīng)典的表面張力儀,但它操作復雜,測定溫度面張力的能力?？傊?我們的實(shí)驗結果提示，在PS中加入一不易控制,需要標本量大,標本自動(dòng)滲漏,因此它定量的高分子聚合物可以在- -定程度上提高不同的使用受到限制。搏動(dòng)泡式表面張力儀,根據濃度PS的活性,逆轉PS因血漿蛋白引起的失活，Laplace定律的原理設計,此法操作簡(jiǎn)單,測量溫度為研制新型PS提供了實(shí)驗依據。容易控制,需要標本量小,但也有樣品滲漏的問(wèn)題。閉泡式表面張力儀是20世紀80年代末開(kāi)始參考文獻應用的新型表面張力測量裝置[4,5]?？煞忾]氣泡[1] Lews JF, Veldhwzen R. The tole of exogenous sufacant mn the的注射器是該儀器的關(guān)鍵部分,懸于凝膠下的小.treatment of acute lung mjury[J]. Annu Rev Physol, 2003, 65氣泡周?chē)急淮郎y液體包圍,避免了可能的擴散2]鄧淵,董聲煥,張廣安，等.可控閉泡式表面張力測定儀的研(6):613-642.和稀釋。我們使用的儀器是在國外經(jīng)驗基礎上研制[J].中國醫療器帔雜志1994, 18(2):87-89.制的,其最大優(yōu)點(diǎn)是密閉的小泡完全避免了待測[3]董聲煥呼吸衰竭基礎與臨床[M].北京:人民軍醫出版社,液體的滲漏,小泡壓縮后可以很快達到平衡,而且1992:41-42測量時(shí)需要的樣品也較少,結構簡(jiǎn)單,使用方便,[4] Schurch s, Bacholen H, Goerke J, et al. A captve bubble methodreproduces the in stu behavnor of lung surfectant monolayers并且經(jīng)實(shí)驗證明準確度和精密度良好。[].J Appl Pbysol, 1989, 67(6) :2389 2396.3.2 PEG 對PS失活的逆轉作用PS 具有降低[5] Scburch s, Bacholen H, Goerke J, et al. Surface propertesof rat肺泡表面張力,防止肺泡萎陷,維持肺臟正常生理pulmonary surfactant studued wnth the captive bubble motbed;adsorpton, hysteres, sabhty[J]. Brochum Biopbys Acta, 1992,功能的作用。ALI及ARDS動(dòng)物模型和臨床資料1103(1):127-136. .提示，ALI及ARDS時(shí)肺組織毛細血管通透性增[6] Frerkang 1, Gunther A. Seeger w, et al. Pulmonary surfastant:加，血漿蛋白滲漏到肺泡,抑制PS的活性,成為functons abnormaltues and therapeuthc options [J]. IntensiveCare Med, 2001, 2711)1699-1717.PS功能異常的-一個(gè)重要原因6。Zasadzinski 等[7][7 ] Zassdznsla JA, Ahg TF, Alonso C, et al, Inhabrtion of pulmonary和我們以前的實(shí)驗都發(fā)現,PS和血漿蛋白等抑制surlactant adsorpton by serum and the mechansms of reversal物存在競爭性抑制,當存在較高濃度血漿蛋白時(shí),by hydrophle polymers: theory[]. Brophys J, 2005, 89(3);1621-1629.就需要高濃度的PS對抗它的抑制。因此,胎糞吸[ 8] Willam Taeusch H, Lu KW. Goerke J, et al. Nononuc polymers入綜合征和重癥肺炎等疾病患兒需要高濃度的PSreverse inactvation of suractant by meconum and other sub-治療才有效果。但是, PS的價(jià)格昂貴,有必要研制stances[J]. Am J Respur Cnt Care Med, 999, 159(5 Pt 1);1391-1395.能夠更好對抗血漿蛋白抑制的新型PS。[9 ] Tashuro K, Kobayashu T, Robertson B. Dextran reduces surfac--般PS的γrmin應小于10mN/m,s.I.大于tant mhubton by meconum[]. Acta Padatr, 2000, 89(12):0.8。本實(shí)驗結果顯示, 1.25 mg/ml的PS ymin小1439-1445.于2 mN/m, s. I.大于1.6,具有降低表面張力的活[10] Lu Kw, Coerke J. Clemment JA, et al. Hyaluronan Decreases性;而0.62 mg/ml和0.31 mg/ ml的PS γmin大于中國煤化工咖Re 205,57(2);210 mN/m, S.1.小于0.8,不具有活性;當加入PEGTHC N M H G回日期:207.0420)時(shí)顯著(zhù)降低了yrmin, 提高了S.1. ;存在血漿時(shí),不(本文編輯:李巍)