RP-HPLC法測定發(fā)酵液中β-苯乙醇的研究

食…分桁檢測Science and Technology of Food IndustryRP-HPLc法測定發(fā)前液中β-苯乙醇的研究劉東亞,金征宇(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫214036)饔:運用反相高效液相色譜對發(fā)酵液中的β-蘋(píng)乙醇進(jìn)行定1材料與方法性定量分析確定了RP-HPLC測定發(fā)酵液中β-苯乙醇1.1材料與儀器的含量的方法。色譜柱: Dikma Diamonsil C1(150m46mm,5μm, Waters),流動(dòng)相:甲醇:水=40:60(w/),流速B-苯乙醇標準品 sigma;L-舉丙氨酸1.0mL/min,紫外檢測波長(cháng):260nm,拄溫:30℃,外標法定色結果:RP-HPLC法測定濃度在420L/10m時(shí)線(xiàn)級,江蘇無(wú)錫晶海氨基酸股份有限公司;甲醇性關(guān)系良好,r=0998,平均加樣回收率為叨71%,RSD純,江蘇漢邦科技有限公司;超純水自制。為1.04%(n=5)。此方法準確,靈敏,簡(jiǎn)單,重現性好,適合于發(fā)酵液這種復雜體系中β一萃乙醇的定量分析。UV-1201紫外可見(jiàn)分光光度計北京瑞利分析美鑣調:β-苯乙醉,發(fā)酵液,反相高效液相色譜法儀器公司; Agilent Il00高效液相色譜儀系列包括中圖分類(lèi)號:TS201.1文獻標識碼:A四元泵、DAD檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器和色譜工作站;電文章編號:1002-0306(2006)01-0198-03子天平 METTLER TOLEDO,AB104- N MAXIO1g,d=0.lmg;045m微孔濾膜上海興亞凈化材料廠(chǎng)臺式離心機TD-5上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。B-苯∠醉(B-PE)足一種有著(zhù)濃郁的玫塊香味12實(shí)驗方法的醇,玫瑰香料的廣泛需求使得B-PE成為香料和化1.2.1色譜分析條件色譜柱: Dikma Diamonsil CI妝品行業(yè)中使用量最多的香味成分。天然β-PE存在(150mm×4.6mm,5μm, Waters);流動(dòng)相:甲醇:水于很多花和植物,如玫瑰、風(fēng)信子、某莉、水仙、百合(40:60/v);流速:lm/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量等的精油中,玫瑰精油中β-PE的含量較高,最高可達60%,向濃度的產(chǎn)品只有用溶劑抽提才可生產(chǎn)出10uL;檢測波長(cháng):260nm。122溶液的制備來(lái),但損失很大,提取價(jià)格昂貲。歐美食品立法機構把用物理法、酶法或是微生物法處理自然資源生產(chǎn)122.1標準品溶液精確量取01mLB-苯乙醇標出來(lái)的香味成分定義為天然香料。酵母的 Ehrlich代準品,用甲醇溶解,定容至10mL,配成濃度為謝途徑屮,通過(guò)把L-舉丙氨酸生物轉化為2-PE是100μL/10mL的貯備液,分別吸取貯備液0.0、0.40.8、1.2、1.6、20mL以甲醇定容至10mL,得0、4、8種很好的生產(chǎn)天然阝-苯乙醇的方法。在β-苯乙醇產(chǎn)生菌的菌種選育和發(fā)酵工藝研究過(guò)程屮,需要建立12、16、20μL10mL的標準液,經(jīng)045μm微孔濾膜過(guò)種對阝-苯乙醇組分和含量的快速檢測方法。日濾后,濾液用于HPIC測定1.2.2.2發(fā)酵液樣品溶液苯乙醇發(fā)酵液以前,已報道的檢測方法有GC法、HPLC法,國內該方4000r/min離心15min,去除菌體,取上清液用面研究目前尚無(wú)相關(guān)報道。本文利用反相高效液相045μm過(guò)濾,即得待測樣品溶液。色譜法對發(fā)酵液中β-苯乙醇的定量測定進(jìn)行了研檢測波長(cháng)的確定將β-苯乙醇標準品溶解于究,狄得了較為滿(mǎn)意的結果可作為β-苯乙醇的定量甲醇中,制備成濃度約20μL/10mL的溶液,在200-測定方法。400mm的波長(cháng)范圍進(jìn)行紫外光全波掃描,β-苯乙醇在218、260m有2個(gè)紫外吸收峰,實(shí)驗中以218nm收稿日期:2005-03-12為檢測波長(cháng)時(shí)干擾較大,260mm時(shí)色譜圖基線(xiàn)平穩作者簡(jiǎn)介;劉東亞(1981-),男,在讀碩士研究生,研究方向:生物技術(shù)在食品中的應用。峰形良好,故選擇260mm作為檢測波長(cháng)食品業(yè)鐘核分析檢測ol.27,No.O1,2006好,如表1所示(n=5)。1.27回收率實(shí)驗取已知β-PE含量的發(fā)酵液315份,向其中分別加入三個(gè)濃度水平的B-PE標樣,測定加入標樣后的回收率,算得平均加樣回收率為9771%,符合測試要求,如表2所示。01.2.8發(fā)酵液樣品測定12.8.1發(fā)酵液的預處理β-PE發(fā)酵液以4000r/mi波長(cháng)(m)離心15min,去除菌體,取上清液用0.45μm過(guò)濾,即圖1得待測樣品溶液。124流動(dòng)相和流速的確定文獻中采用乙腈-水以1.28.2標樣及樣品的分離色譜圖在上述優(yōu)化的相關(guān)配比作為流動(dòng)相?？紤]到乙腈價(jià)格較高,同時(shí)參色譜條件下,標準品和樣品溶液得到充分的洗脫和考其他文獻,分別配制不同組成的流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗,分離,保留時(shí)間分別為7207和7220min,色譜圖見(jiàn)經(jīng)過(guò)多次篩選,結果表明,甲醇-水(40:60,vv的系統圖3、圖4。從圖中可知,在本色譜條件下,發(fā)酵液中效果最好。同時(shí),對不同流速(080、100、120ml/min)條的β-PE能得到很好的分離,保留時(shí)間與標準品基本件下的分離情況進(jìn)行研究。與1.00 ml min相比較,流致,峰形對稱(chēng)且無(wú)明顯的干擾峰。速為080mL/min時(shí)保留時(shí)間增加,分離效果較差;流速為L(cháng)20ml/min時(shí)保留時(shí)間縮短,但不明顯,且分離效果與100mL/min相差不大?？紤]到柱壓的因素,最終選用流速為100mmin。1.25標準曲線(xiàn)的繪制按2.2中所配048、1216、20μL/lOmL的標準液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后,在上述優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)樣10μL測定,以濃度50為橫坐標,峰面積為縱坐標作標準曲線(xiàn),結果見(jiàn)圖2。02,。,線(xiàn)性回歸方程為y=23902x-13188,r=0.9998。結果表明,B-苯乙醇在4-20μL/10m范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好。圖3標準品色譜圖60004000標樣濃度(μL/1OmL)0圖2β-苯乙醇標準曲線(xiàn)57.510125126精密度實(shí)驗取…濃度128mL/左右的發(fā)酵液樣品,在前述色譜條件下連續進(jìn)樣5次,考察方圖4發(fā)酵液樣品色譜圖法的重現性。算得柑對標準偏差為104%,精密度良1.2.8.3發(fā)酵樣品測定結果如表3表1精密度實(shí)驗(n=5)測定值mL紐分平均值m/1)RsD)%B-P530741.2845126631,277612838表2加樣回收率實(shí)驗原樣濃度(mL)添加濃度(mL)測定濃度(mL/)問(wèn)收率%)平均回收率(%)0.40097270.8002.01997.71.60029170L.17食業(yè)技分析檢測Science and Technology of Food Industry表3發(fā)酵樣品測定結果中的嵐味強化肽食品與發(fā)酵工業(yè)2004,30(90:96-995]趙光輝,王成福李俊萍采用反相高效液相色譜法測定木測定結果(mLD0.80.720.36119094糖醇產(chǎn)品中各組分含量食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(7:1172討論[6 MM W Etschmann, D SelJ Schrader. Biotechnological本文建立了一種HP-HPLC法測定發(fā)酵液中B- production of2- phenylethane. Appl Microbiol BiotechnolPE的分析方法,流動(dòng)相為甲醇:水(40:60,v/v);色譜柱2002.59:1-8%3 Dikma Diamonsil C:(150mm x4.6mm, 5um, Waters), [71 Christoph wittmann, Michael Hans, wilfried Bluemke流速1ml/min,最適吸收波長(cháng)260mm。此方法具有處 Metabolic physiology of aroma -producing Kluyveromyces理簡(jiǎn)單、快速、定量準確、回收率高和重復性好的特 marxianus[J Yeast,200.191351-1363點(diǎn)。在B-PE產(chǎn)生菌的菌種選育和發(fā)酵工藝研究中采8] Chung- Jr Huang Shiow- Ling lee, Cheng- Chun Chou用本法,可有效的對菌株生產(chǎn)能力和發(fā)酵條件進(jìn)行 Production of2- phenylethanol, a flavor ingredient. by Pichia評價(jià),為菌株改良,發(fā)酵與分離工藝的優(yōu)化,提高單fermentens L-5 under various culture conditions. Food位發(fā)酵液的目標產(chǎn)率和分離提取的收率提供了有效 Research International.20134277-282的分析分離手段9) D Stark, T Munch, B Sonnleitner, I W Marison, U von參考文獻Phenylalanine by Saccharomyces cererisiae [] Biotechnol Prog[]達世祿色譜學(xué)導論M武昌:武漢大學(xué)出版社,1999320-3392002,18:514~523.[2]孫寶國,等香科與香精M北京:中國石化出版社20009-10[10] MM W. 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