降纖酶的聚乙二醇修飾及產(chǎn)物的純化研究

234中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals0037(4)微生物藥物與生物技術(shù)降纖酶的聚乙二醇修飾及產(chǎn)物的純化研究武霞,馮軍,趙文杰(上海醫藥工業(yè)研究院,上海200040)摘要:研究了降纖酶的聚乙二醇修飾及純化方法。采用正交法考察影響修飾的4個(gè)因素,確定了最住條件。利用分子篩柱色譜得到了較高酶活力保留的修飾產(chǎn)物,SDs-page檢測為單一條帶關(guān)鍵詞:降纖酶;聚乙二醇:正交實(shí)驗:純化中圖分類(lèi)號:TQ464.8文獻標識碼:A文章編號:1001-8255(2006)0-0234-04降纖酶(defibrase,Df)已在臨床廣泛應用,如分子篩柱色譜分離:色譜柱 Superdex775柱;流去纖、抗凝、降脂、擴張血管和改善微循環(huán)等。但動(dòng)相0.05mol/na2hp4-nah2PO4緩沖液(pH7.0):作為異源蛋白,Df在使用中不可避免地具有蛋白質(zhì)檢測波長(cháng)215m;流速0.3ml/min。收集0.5m/管。類(lèi)藥物的共同缺點(diǎn),如具免疫原性、半衰期短、穩定HPlc測定:色譜柱 Waters Symmetry300C4性差等23聚乙二醇(PEG)修飾技術(shù)是近年來(lái)發(fā)柱(3.9mm×150mm,5um);流動(dòng)相A:0.1%三展的用于改進(jìn)蛋白質(zhì)類(lèi)藥物體內藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的氟乙酸、B:乙猜-0.1%三氟乙酸(9:1);梯度洗新技術(shù),它將單甲氧基PEG分子(mPEG鍵合到蛋脫:0~18min,流動(dòng)相B20%~70%,18~白質(zhì)分子表面,改變蛋白質(zhì)的空間結構,進(jìn)而改變其20min,流動(dòng)相B70%~50%;檢測波長(cháng)215nm;生化性質(zhì)此法可有效降低蛋白質(zhì)的免疫原性,延長(cháng)柱溫37℃;流速1.0ml/min半衰期,減少給藥次數本研究考察了PEG修SDS-PAGE電泳:參考文獻81。分離膠12.5%,飾Df的條件及目標產(chǎn)物的純化。濃縮膠4%。1儀器與試藥2.2f的修飾反應910 AKTA explorer蛋白質(zhì)分離純化儀、ds-pg儀均為取1mg/ml的Df溶液2ml與0.2mol/Lna2P4- Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品高效液相色譜儀Na2HPO4緩沖液(pH6.5)4ml混合,加入mpeg-sp(Waters公司)alegrax-《wasgaAewxcug,360mi《冷凍離心機5固體6mg溶解,混勻,37℃反應60min反應(Beckman Coulter TM公司):超濾器(Millipore公司)前后分別取適量混合液以pH7.4的Tris溶液稀釋,Df(M38k,河南省中泰藥業(yè)有限公司)mpeg-A測定酶活力,計算酶活力保持率。加入甘氨酸3g終(M5k、30k,丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯)mPEG止反應。超濾(截留分子量10000)至0.5ml,待分離SBA(酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯)均為美國 Shearwater純化,產(chǎn)物記作mf5k公司產(chǎn)品。另以mPEG-SPA30k、mPEg-SBA分別進(jìn)行Df2方法與結果的修飾反應,方法同上。產(chǎn)物分別記作mDf30k和2.1主要測定方法 mDf-SBA.蛋白質(zhì)濃度測定:采用 Lowry法。2.3Df的PEG修飾條件選擇Df活性測定:參照衛生部藥典委員會(huì )頒布標準將影響修飾結果的4個(gè)影響因素:反應緩沖液(試行)測定。pH(A)、Df與PEG的摩爾比(B)、反應時(shí)間(C)和反應溫度(D),進(jìn)行3水平正交實(shí)驗,具體設計見(jiàn)收稿日期:2005-01-26作者簡(jiǎn)介武霞(1977),女,碩士研究生專(zhuān)業(yè)方向:微生表1。通過(guò)考察修飾后酶活力保持率和修飾率來(lái)確物與生化藥學(xué)。定最佳修飾條件。已修飾Df(mDf)量通過(guò)分子篩柱Tel:021-62479808×426 e-mail: wuxial202@163.com色譜圖中的面積計算。中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals200637(4)235表1L(3的因素水平表產(chǎn)物為混合物,故未進(jìn)行修飾反應條件的篩選。因素2.4修飾產(chǎn)物的純化水平AB C/hD/℃2.4.1sds-pge電冰驗證修飾產(chǎn)物6.51:20237.01:100.57.51:52487分別對各修飾反應產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗證,見(jiàn)圖1A~CmPEG-SBA修飾Df的產(chǎn)物電泳試驗結果表明,在pH6.5、Df與PEG摩爾比圖上出現數條M增大的條帶;mpeg-spA5k修飾為1:20、反應時(shí)間1h、溫度37℃的條件下,產(chǎn)Df的電泳圖上則有一條M增大的條帶,M約為物可保持較高酶活力,且修飾率最高。產(chǎn)物mDf43kmpeg-spa3ok修飾Df的電泳圖上有條M5k的酶活力保持率53%、修飾率46.7%。mDf30k增幅更明顯的條帶(圖1C),M約為97k的酶活力保持率46.9%、修飾率38.2%。因mf-sBA123123412397.4k97.4k66.2k43.0k97.4k66.2k43.0k31.0k43.0k31.0k31.0k20.1k14.4k20.1k20.1k14.4k14.4kABC1-Df:2標準分子量蛋白1標準分子量蛋白:2-Df1標準分子量蛋白;2-Df;3—修飾反應液3修飾反應液;4-mDf5k3一修飾反應液圖1Df與mG-B(A)、mpeg-spa5k(B)、mpeg-spa30k(C)的修飾反應電泳圖2.4.2 Superdex775分子篩柱色譜應液經(jīng)分子篩柱色譜分離后,所得色譜圖見(jiàn)圖2Df的mpeg-pa5k和mpeg-30k修飾反A mAU 200 mAU 40010020051510i5 t/min t/minA:mpeg-spa5k修飾反應液,B:mpeg-spa30k修飾反應液 1-Df: 2-mDf 5k; 3-mDf 30k圖2修飾反應液的分子篩柱色譜圖譜2.4.3HPLC分析取柱色譜分離后收集的單一峰濃縮,再進(jìn)行分別取Df、柱色譜分離后收集的Df5k、 mDf SDS--pag驗證結果與“2.4.1”項下類(lèi)似:30k純品適量,按照“2.1”項下條件進(jìn)行HPLC mPEG--spa5k、mpeg-sp30k修飾Df分別得到分析,色譜圖見(jiàn)圖3。M約為43000、97000的產(chǎn)物mDf5k、mDf30k2.4.4sd-Age電泳驗證純化產(chǎn)物3討論236中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 22006,37(4) AU.15 AAu0.250.20B20.100.100.150.050050.100.000.050.000.000.050.050.05-0.100.10-0.100.0.15246810121416182024681012141618202468101214161820 tmin tmin timinA:Df,B:mDf5k收集液,C:mDf30k收集液 1-Df: 2-mDf 5k; 3-mDf 30k圖3PC色譜圖mpeg-sBa修飾Df所得的mDf是多位點(diǎn)、多【2]正峰張華李成建去纖酶的不良反應醫藥導報分子量的(如圖1A)。而用SDS-PAGE、分子篩柱2002,21:136色譜和HPLC3種方法共同驗證得到結論:mPEG[3]鄭萬(wàn)剛降纖酶不良反應12例分析[蛇志1998(3:32SPA修飾Df可以得到純度較高的 mDf mPEG-spa4] Bures, Huang Oraletl Surface modifications and5k修飾產(chǎn)物的M1約為43000,符合Df與mPEG-SPA molecular imprinting of polymers in medical and5k之和;mPEG-SPA30k的修飾產(chǎn)物在電泳圖譜上 pharmaceutical applicationsUJ]. J Controlled Release, 2001.72(1-3):25-33的M,卻遠高于Df與mPEG-SPA30k之和,可能有 [5] Zalipsky S. Chemistry of polyethylene glycol conjugates with兩個(gè)原因:一是由于線(xiàn)狀PEG分子伸展在蛋白表 biologically active molecules [)] Adv Drug Deliv Rey, 1995.面,使蛋白泳動(dòng)速率降低;另一原因可能是PEG的16:157-182水化程度非常高,故在SDS-PAGE上表現異常。據文獻報道,蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的PEG修飾中, and other therapeutic proteins and peptides: the importance經(jīng)常遇到的問(wèn)題是反應產(chǎn)物不均一,包括分子量大 of biological optimization of coupling techniques[J]. Int J小不一、修飾位點(diǎn)各異等,且在修飾過(guò)程中酶活力降 Hematol,1998,68(1):1-18.低較多。Wang等(2在進(jìn)行人重組干擾素a-2b的PEG7]李建武蕭能素,余瑞元,等生物化學(xué)實(shí)驗原理和方法[M]第二版,北京:北京大學(xué)出版社,1997.168-170修飾時(shí),產(chǎn)物多達13個(gè),修飾后酶活力最高僅為8 Amersham Pharmacia Biotech Protein electrophoresis tech37.0%,最大修飾率僅為47.8%。而本研究在最佳 nical manual [M]. USA: Amersham Pharmacia Biotech. 13.修飾條件下得到單一的修飾產(chǎn)物,mDf5k酶活力可19保持53%,修飾率為46.7%mDf30k酶活力保 Kinstler OB, rems DV Lauren SL,etal. Characterization持率為46.9%,修飾率為38.2%。因PEG分子量 and stability of N-terminally PEGylated rhG-CSFUJ]. Pharm的增大,進(jìn)一步影響了酶活中心的正常功能,使酶活Res,199613(7):996-1002力保持率降低本研究組將在后期工作中,對修飾產(chǎn)[10]李偉軍林炳承蘇志國聚乙二醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)的分析方法[].分析化學(xué),200129(2)228-231物酶的理化性質(zhì)、免疫原性、半衰期等進(jìn)行進(jìn)步試 [1] Roberts MI, Bentley MD, Harris JM. Chemistry for peptide驗,考察其能否最終成為Df的改良藥物,達到更好 and protein PEGylation [] Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54療效。(4):459-476 [12] Wang YS, Youngster S. Grace, et al. Structural and biologi-參考文獻: cal characterization of pegylated recombinant interferon al-[1]張惠,王永茂降纖酶的臨床應用[]現代中西醫結合雜 pha-2 b and its therapeutic implications ] Adv Drug Deliv志,2003,12(12):1323.Rev,2002,54(4):547-570中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals2006,37(4)237還原型谷胱甘肽的金屬螯合親和色譜純化潘飛,邱雁臨*湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,湖北武漢430068)摘要:制備了以殼聚糖為載體的金屬整合親和色譜分離純化還原型谷胱日肽(GSH)。研究了pH、銨離子濃度等對GSH洗脫的影響。根據試驗結果確定洗脫液為pH4.2、0.2mol/磷酸鹽緩沖液(含0.5mo NHC),所得GSH純度可達49.8%,平均提取率為67.9%。關(guān)鍵詞:還原型谷胱甘肽;金屬整合親和色譜;殼聚糖中圖分類(lèi)號:Q516文獻標識碼:A文章編號:1001-8255(2006)04-0237-03谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨得到富含GSH的酵母抽提液。另以殼聚糖為載體、酸縮合而成的含巰基的生物活性三肽化合物,有還Cu2+為配基制得金屬合劑,以酵母抽提液上柱分原態(tài)(SH)和氧化態(tài)(GSSG)兩種GSH有多種離,考察了洗脫條件對純化結果的影響。生理功能,對維持生物體內適宜的氧化還原環(huán)境尤1儀器與試劑為重要[21,臨床用于中毒性和感染性肝炎的治療3、c-6型高效液相色譜儀(日本島津) Nexus傅里葉變有機物及重金屬的解毒、癌癥輻射和化療的保護換紅外光譜儀(美國 Nicolet公司)722型可見(jiàn)分光光度計等6殼聚糖是天然的氨基多糖,生物相容性與(上海精密科學(xué)儀器有限公司)吸附性均較好,可直接或經(jīng)修飾后用作各種色譜和啤酒酵母泥(華潤集團武漢東西湖啤酒公司);殼聚糖蛋白質(zhì)分離純化的載體金屬離子親和色譜是新(市售,分子量270k,脫乙酰度87.22%);亞氨基二乙酸興的色譜技術(shù),利用Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+鈉、5,5二硫二(2-硝基苯甲酸)(DTNB);GSH對照品等金屬離子與蛋白質(zhì)表面的組氨酸、色氨酸或半胱(Sigma公司,含量98%);Tris生化試劑(Amresco公司)氨酸配位結合,由于氨基酸種類(lèi)、數量、位置及庚烷磺酸鈉(美國Regis公司):其余試劑均為分析純空間構象不同,故與金屬離子親和力大小不同,從2方法與結果而選擇性地分離純化82.1GSH提取液的制備本研究通過(guò)對啤酒酵母的預處理及細胞破碎,啤酒酵母泥經(jīng)預處理(包括過(guò)篩、除雜)得到凈的啤酒酵母后,按1:2(w/v)的比例將0.5%對收稿日期:200-8-11基金項目:湖北省教育廳重大項目(20032001)羥基苯甲酸丙酯溶液加至菌體中,30℃、pH5~6作者簡(jiǎn)介:潘飛(1980),男,碩上研究生,專(zhuān)業(yè)方向:多肽攪拌3h離心(100rmn)10min,上清液加入藥物。Tel:013277053767絮凝劑殼聚糖使其終濃度為0.1%(w/v),攪拌 E-mail: pf_sky@163.com通訊聯(lián)系人:雁臨(1942),女,教授,博士生導師,從事再10min,離心(1r/min)10mn后取上清液備用生資源的微生物轉化研究。2.2親和色譜劑的制備Tel:027-88016421 e-mail: hgqiuyl@126.com殼聚糖3g溶于1%乙酸溶液100ml,攪拌2h,哈哈66哈666哈6666哈6666666哈6666666666 Defibrase Modified by PEG and It's Purification WU Xia, FENG Jun, ZHAO Wen-Jie (Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200040) ABSTRACT: Defibrase modified by polyethylene glycol(PEG) and it's purification were studied. Four factors were determined by orthogonal experiments. The PEGlation defibrase with high enzyme activity was purified by molecular sieve column chromatography, and showed single band on SDS-PAGE. Key Words: defibrase; polyethylene glycol; orthogonal experiments;purification