片段法合成多肽的研究

-2005.No.6化學(xué)與生物工程Chemistry & Bioengineering片段法合成多肽的研究南亞萍(西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西西安710055)摘要:以片段合成法和直接合成法分別合成一個(gè)比較長(cháng)的多肽，并用質(zhì)譜和HPLC進(jìn)行檢測，結果顯示用片段合成法合成的多肽,其合成效率、合成純度均明顯高于直接法。關(guān)鍵詞:多肽;片段合成;直接合成中圖分類(lèi)號:Q 593.1 Q 516.文獻標識碼:A文章編號:1672- 5425(2005)06一0034 - 03隨著(zhù)人類(lèi)基因組計劃的階段性完成,研究重點(diǎn)已基甲酰胺洗滌3遍。經(jīng)越來(lái)越多地轉向了蛋白質(zhì)組計劃。從20世紀60年1.2.2 肽鍵的形成代以后開(kāi)始的固相化學(xué)合成多肽的方法,為合成較短將上述樹(shù)脂與3.5倍Fmoc保護的氨基酸、3.5氨基酸多肽提供了很好的途徑1.2],而在實(shí)際操作中倍的HBTU和HOBT、7倍的DIPEA混合反應。1 h合成含30個(gè)以上氨基酸的多肽相當困難[3],現在有研后選取少量樹(shù)脂進(jìn)行茚三酮檢測,陰性結果的進(jìn)行下究用片段合成法合成更長(cháng)的多肽片段或蛋白質(zhì),將較一步反應，陽(yáng)性結果的繼續本步反應。長(cháng)片段的多肽分成幾個(gè)部分分別合成,然后再通過(guò)一按照多肽的序列順序,依次經(jīng)過(guò)1.2.1和1.2.2定的方法把合成好的較短的多肽段連接起來(lái),最后形反應，直至連接完畢所有的氨基酸。成一個(gè)長(cháng)的完整的多肽片段。1.2.3最后的Fmoc保護基團的脫除作者采用片段合成法合成含27個(gè)氨基酸的多肽，將反應完畢的氨基酸樹(shù)脂用5 mL二甲基甲酰胺其序列為GIGRKFLGCVKTTFRGGVKFGDYKT-洗滌3遍后,用15 mL 30%的Piperidine 二甲基甲酰TI,分子量2950. 4,并與直接合成法進(jìn)行比較。胺溶液浸泡10 min,濾干,再加入15 mL 30%的Piper-idine二甲基甲酰胺溶液浸泡10 min,做最后的Fmoc1實(shí)驗保護基團的脫除。l.1試劑和材料1.2.4把多肽從樹(shù)脂.上切除并同時(shí)脫去側鏈保護基團選用FmocAA-wangresin,AM-Resin樹(shù)脂，交聯(lián)把上述脫去最后的Fmoc的氨基酸樹(shù)脂1 g置入度為1%,HMPBLinker,Fmoc保護的氨基酸由默克玻璃反應瓶中,加入15 mL裂解液(TFA : Thioanisole公司提供;HATU、HBTU.HOBT由ABI公司提供;:EDT:Anisole=90:5:3:2)反應3h。把合成好TFA .DCM .DMF、Piperidine由SIGMA公司提供;其的多肽從樹(shù)脂上切除下來(lái)，同時(shí)把多肽側鏈的保護基它試劑均為國產(chǎn)分析純。團切除,得到需要的多肽。Fmoc脫保護試劑為30%的Piperidine二甲基甲1.3片段縮合法[6]酰胺溶液。把多肽分成兩部分,第一-部分GVKFGDYKTTI,1.2直接合成法[.5]第二部分GIGRKFLGCVKTTFRG。1.2.1 在樹(shù)脂上脫除Fmoc基團第一部分的合成同1.2。第二部分按照下面方法起始的Fmoc-氨基酸樹(shù)脂(Fmoc-AA- wang res-連接在樹(shù)脂上并合成,然后把第二部分得到的片段同in,替代度0.3 mmol. g')0.5 g用10 mL DCM浸泡第一部分相連接。20min,濾去DCM,繼續用5mLDCM洗滌2遍,然后1.3.1，Free但護的每其酸和HMPBLinker反應中國煤化工用5mLDMF洗滌2遍后,加入30%的Piperidine二ut度0.5 mmol.g")甲基甲酰胺反應5 min,抽干,再加人30%的Piperi-1.5 g置八儀w心1。用1 DCM浸泡20 min，抽T(mén)HCNMHGdine二甲基甲酰胺反應10 min,最后加人10 mL二甲干后,用15 mL DCM洗滌2遍,然后用20 mL DMF收稿日期:2005-04- 08作者簡(jiǎn)介:南亞萍(1976- ).女,陜西戶(hù)縣人,助教,碩士,主要從事生物化學(xué)方面的研究。南亞萍:片段法合成多肽的研究/2005年第6期35洗滌3遍,最后加入Fmoc保護的氨基酸和HATU反應過(guò)程,直至第二部分和第一部分反應完全停止。應1.5 h。1.3.5最后Fmoc保護基團的脫除和從樹(shù)脂上切除1.3.2 肽鍵的形成同1.2.2.多肽.1.3.3側鏈全保護的肽鏈的切割.1.3.4反應得到的氨基酸樹(shù)脂同1.2 中得到的連接好氨基酸的樹(shù)脂不用脫去最后一個(gè)Fmoc基樣,可以采用1.2.3 和1.2.4的辦法脫除最后一個(gè)團，就可以直接從樹(shù)脂上切割得到全保護的多肽片段。Fmoc保護基團并從樹(shù)脂上切除,同時(shí)可以把多肽側采用含1%TFA的DCM溶液洗滌樹(shù)脂20min后就可以鏈的保護基團從多肽上切除掉。把側鏈帶保護的多肽片段從樹(shù)脂上切割下來(lái)。然后把切2合成多肽的質(zhì)譜鑒定和HPLC鑒定割液在旋轉蒸發(fā)儀上旋干,就得到固體的保護片段。1.3.4 片段縮合2.1 質(zhì)譜鑒定把1.3.3中得到的片段經(jīng)純化后同第--部分的多把反應得到的多肽采用MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行肽樹(shù)脂反應,反應時(shí)間為24 h。其間用茚三酮監測反分子量鑒定,質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1(a)、(b)、(c)。180016041[69200p1400(a)20}an)120070復100800F600f4003020020n0112403460 420026-- 4-82620242832”Mass(m/z)/minVtyoger SpA->=A+C20.50.1)-RSM00000→>IR≈TR >Y[BP 3026.815140)01600500(b,(b)10000800600ofIMl1200 196027203480424050200-一412Mas(m/2)mun1800[00N200)->0C->TR->7RB-951583.1546710090有80-(c,)(e)昌800400sL__2000260032003800Mas (m公)tin圖1質(zhì)譜圖和 HPLC譜圖Fig. 1 Mass spectra and HPL中國煤化工al ,a2 :direct synthesis b ,b2 :segment 2:YHCNMHG2.2 HPLC 鑒定及純化A含0.1% TFA的水,B含0.08% TFA的乙腈。條1.2.4和1.3.5得到的多肽采用C18反相柱，件一:在40 min內流動(dòng)相B從10%.上升到50%;條件1.3.3得到的保護片段采用C.反相柱。流動(dòng)相條件:.二:在25 min內流動(dòng)相B從30%.上升到65%。 HPLC36南亞萍:片段法合成多肽的研究/2005年第6期譜圖見(jiàn)圖1(a2)、(b2)、(c2)。到保護片段時(shí),TFA的濃度對于切割結果有很大的影響”。尤其在分離切割液和保護片段過(guò)程中(2),經(jīng)常3結果與討論.會(huì )由于TFA的濃度增加導致保護基團的脫除,如何3.1 片段合成法與直接合成法的比較選用合適的連接劑還有待更深人的研究。本實(shí)驗合成的多肽片段理論分子量為2950. 4,通在片段合成過(guò)程中,如何選取片段[8]也是合成的過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜可以很直觀(guān)地測量出樣品的分關(guān)鍵。在選取片段時(shí),要注意的是選取的片段要容易子量。從圖1(a)可以看出2951.6的分子量,并在以.合成,得到比較純的產(chǎn)物,這樣才能得到更多的目的片后的HPLC分離得到該分子量的物質(zhì),證明通過(guò)直接段產(chǎn)物,同時(shí)純化過(guò)程也較容易進(jìn)行。此外，還要注法可以合成得到該多肽。一般認為,質(zhì)譜得到的數據意,選取的幾個(gè)片段還要很好連接,否則,會(huì )導致最后高低與樣品實(shí)際各物質(zhì)的含量并不完全成比例關(guān)系，產(chǎn)物產(chǎn)率很低或者目的產(chǎn)物分離困難。如何在一個(gè)特但如果某種物質(zhì)含量比較多,在質(zhì)譜中的數據也顯示定序列中選取保護片段，也需要進(jìn)一步做更深人的得比較多。從圖1(a1)可以看到2951.6的數據峰值相研究。對較低,證明直接合成法對于這樣一-個(gè)比較長(cháng)的多肽4結論來(lái)說(shuō),效率是很低的。同樣的結果在HPLC中也可以看到。在圖1(a2)用片段合成法合成長(cháng)的多肽,其合成效率、合成純中保留時(shí)間為25.324的峰是目的肽，該峰與整個(gè)峰面度均明顯高于直接法,具有良好的研究前景。積相比表明目的產(chǎn)物和其它雜質(zhì)的相對含量。同時(shí)，參考文獻:由于長(cháng)肽的合成過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生大量的殘缺肽，HPLC[1] Atherton E.Sheppard R C. Solid Phase Peptide Synthesis a Prac-tical Approach[ M]. New York: Oxford University Press, 1989:的峰中,選擇目的峰也是非常困難的- - 件事。15-16.圖1(b1 )是保護片段的質(zhì)譜結果,可以看到，測量2] Chan W C,White P D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A的結果3026. 58和理論計算值3025. 7相吻合,而且由Practical Approach[M]. New York: Oxford University Press,于所選的片段的氨基酸數目比較少,合成得到的產(chǎn)物200011-15.也比較純。圖1(b2)(保 留時(shí)間為11. 596的峰是目的3] 麻遠.趙玉芬.多肽片段連接:合成蛋白質(zhì)的一一種新方法[J].科學(xué)通報.2002.47(16) :393-400.部分)也表明了所合成得到的片段的純度比較高,很容.4] 劉杰,高晨吳,甘一如，等. Fmoc新型固相法合成胸腺素a1及其易從粗品中純化出來(lái)。反應途徑[J].天津藥學(xué),2001, 13 (3):39-41.圖1(c)顯示了采用片段縮合法得到的完整肽的5] 王賢純,梁宋平，羅澤民.虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-突變體A1Y-HWTX-質(zhì)譜數據。從該圖和圖1(a)的比較可以看到,盡管1的固相合成和生物學(xué)活性測定[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)兩圖都出現了目的產(chǎn)物，但是片段縮合法得到的目的報，2000,16(3):357-362.分子量峰遠較直接法得到的分子量峰明顯,并且含量6] Florsheimer A.et al. Peptides, 1990 ,Proe[A].21* European pep-tide symposium[C]. ESCOM, Leiden:Giralt E & Andreu D, 1991:要高。在圖1(c2)中,保留時(shí)間為28. 324的峰是目的產(chǎn)物,該峰的面積含量要比直接法高得多,并且很容易[7] Tony Dean. A Practical Introduction to Solid Phase Chemistry篩選出來(lái)。[M]. Glaxo Wellcome R &D, 1998:15-16.3.2片段法合成多肽的探討8] Han So Yeop, Kim Young Ah. Recent development of peptide實(shí)驗采用的HMPBLinkerf是--種常用的合成coupling reagents in organic synthesis[J] 。Tetrahedron, 2004.(60) :2447-2467.保護片段多肽的連接劑,但是在使用1%TFA切割得Study on Synthesis of Peptide by Segment CondenseNAN Ya-ping(School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'ar中國煤化Ire and Technology,Xi'an 710055,Chimc:MYHCNMHGAbstract : Large peptides are synthesized by using two methods: direct synthesis and segment condense. The end-products are analyzed by MS and HPLC. Result shows that segment condense method is more better than direct meth-od. By using this method, the synthesis efficiency and product purity are higher than that of direct method.Keywords: peptide; segment condense; direct synthesis