海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)酵

第27卷第4期南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(然科學(xué)版)( A Journal of Nanjing Forestry University( Natural Sciences Edition) Jul, 2003海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)酵宋向陽(yáng)1,徐勇,楊富國2,勇強,余世袁(1.南京林業(yè)大學(xué),江蘇南京210037;2.中南大學(xué),湖南長(cháng)汐410083)攏要:以樹(shù)千畢赤酵母( Pichia stipitis為發(fā)酵茵株,利用海藻酸鈺凝膠代替海藻酸鈣·固定化酵母使用壽命明罡增加。釆用混合糖60gL(50%菊萄糖、50%木糖)為發(fā)酵底物,以250mL三角瓶為反應器,在35℃、150r/min、pH5.0條件下,嵊蕩發(fā)酵。結果表明,海藻酸錳樹(shù)干畢赤園定化增殖酵母細胞能使戊糖和己糖同步發(fā)酵,海藻酸錳凝膠耐磷酸鹽能力是海藻酸鈣凝膠的3倍,海藻酸錳固定化樹(shù)干畢赤酵母細胞乙醇發(fā)酵42d,固定化細胞穩定,總糖利用率為95.8%,乙醇得率為理論得率的92.3%,發(fā)酵穩定時(shí)間明昰長(cháng)于海藻酸鈣圊定化酵母細胞乙醇發(fā)酵的穩定時(shí)間(24d)。關(guān)鍵詞:樹(shù)干畢赤酵母;海藻酸錳;固定化細胞;糖;乙醇中圖分類(lèi)號;Q53文獻標識碼:A文章編號:1000-2006(2003)04-0001-04Fermentation of Ethanol by Immobilized Cells of Manganese AlginateSONG Xiang-yang, XU Yong, YANG Fu-guo', YONG Qiang', YU Shi-yuan'(1. Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Central SouthUniversity, Changsha 410083, China)Abstract: The life time of immobilized Pichia stipitis yeast cells was prolonged greatly when the gelwas formed with manganese alginate compared to that with calcium alginate. The ability of enduringphosphate of manganese alginate gel was increased 3 times than that of calcium alginate gel Fermentation of glucose- xylose mixture to ethanol was investigated in 250 mL shake-flask at 35C, pH 5. 0 and150/min Glucose-xylose mixture could be co-fermented to ethanol by immobilized Pichia stipitisyeast cells of manganese alginate. The results showed that immobilized cells of manganese alginate gelwere still definite when fermentation of ethanol lasted 42 d, and utilization ratio of total sugar was95, 8%, yield of ethanol rcached 92.3% of theoretical, While fermentation of ethanol by immobilizedPichia stipitis yeast cells of aluminum alginate only lasted 24 d. It provided the basis of theory for preucing ethanol witKey words: Pichia stipitis Manganese alginate; Immobilized cells; Xylose; Ethanol固定化細胞技術(shù)根據固定化方法大致分為吸附法、包埋法、共價(jià)法和交聯(lián)法,其中以包埋法應用最為普遍。載體是國定化細胞技術(shù)的核心部分。包埋法中的載體有多種,如聚丙烯酰胺凝膠、海藻酸鈣、角叉菜聚糖、瓊脂糖、明膠等。目前固定化細胞技術(shù)已成為國際上研究的熱點(diǎn)之一~4,廣泛應用于工業(yè)、醫學(xué)、環(huán)境保護、能源開(kāi)發(fā)及化學(xué)分析等諸多領(lǐng)域。海藻酸鈣是迄今應用最為廣泛的一種固定化載體。它具有網(wǎng)格孔隙大、傳質(zhì)阻力小制備方法簡(jiǎn)單及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。但其強度較差,使用壽命短。這主要是由于培養基中的磷酸鹽逐漸使海藻酸鈣凝收稿日期:2002-04-25修回日期:2003-0103基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(39970597)作者簡(jiǎn)介:宋向陽(yáng)(1965-),男,江蘇無(wú)鍋人,南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院測教授博士,南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第27卷第4期膠破裂和解體。延長(cháng)海藻酸鈣凝膠使用壽命的處理方法較多。筆者利用Mn對Ca¨置換法,將低濃度的樹(shù)于畢赤酵母( Pichia sti pitis)細胞固定,通過(guò)增殖培養,能高效地同步發(fā)酵戊糖和已糖,形成的海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力顯著(zhù)增強,其使用壽命顯著(zhù)增加。為固定化細胞乙醇發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據材料與方法1.1菌種和培養基菌種為樹(shù)干畢赤酵母( Pichia stipitis),由南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所保藏,該菌種能夠同步發(fā)酵戊糖和己糖酵母細胞培養基為木糖20.0g/L,蛋白胨5.0g/1-,酵母汁3.0g/L,培養基pH5.0;固定化增殖培養基為葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,蛋白胨3.0g/L,酵母汁2.5gL,CaCl2.5g/L,MgS(,0.25g/I,KHPO2.5g/I,培養基pH5.0;發(fā)酵培養基為葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,CaCl22.5g/L,MgSO40.25g/L,KH2PO42.5g/l,培養基pH51.2固定化細胞的制備與增殖將試管斜面菌種接入液體酵母細胞培養基,在30℃、150r/min條件下活化2d,取2mL菌液與3%海藻酸鈉溶液(68mL.)于常溫下混合,注人2%CaCl2水溶液中,固化4h,用無(wú)菌水將固化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2~3mm)洗3次(每次50mL),移入1.2%MnSO4溶液中,放置冰箱(4℃)固化24h。將固定化好的凝膠球(直經(jīng)約3mm)置于增殖培養基中,在30℃、150r/min條件下增殖培養12h更換一次新鮮培養液,共增殖4次L.3乙醇發(fā)酵將固定化凝膠球川無(wú)菌水洗3次后,移人發(fā)酵培養基中。發(fā)酵容器為250mL三角瓶,發(fā)酵液體積與凝膠球的堆積體積之比為3:2,其中發(fā)酵液體積為50m1,總體積為80mL。將三角瓶置于恒溫振蕩器中,在35℃、150r/min條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。利用固定化細胞重復式發(fā)酵,每一批發(fā)酵結束后,收集發(fā)酵液,接人新鮮發(fā)酵液1.4分析測定當一批發(fā)酵結束后,傾去發(fā)酵液,稱(chēng)取三角瓶與固定化細胞質(zhì)量減去空三角瓶質(zhì)量,即為固定化細凝膠顆粒濕重。利用高效液相色譜法測定乙醇含量。釆用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖。2結果與分析2.1固定化凝膠顆粒耐磷酸鹽能力海藻酸鈣是一種應用較為廣泛的固定化載體,但其強度較差,使用壽命短。在制備海藻酸鈣凝膠顆粒過(guò)程中添加活性炭、Al2O3、SiO2、MnCl2等,盡管表1固定化細胞凝膠顆粒耐磷酸鹽能力可不同程度地增加海藻酸鈣的機械強度及穩定性, Table 1 Test of enduring phosphate of gel bends但由于發(fā)酵培養基中的磷酸鹽逐漸使海藻酸鈣凝膠on cells immobilization顆粒破裂和解體,所以海藻酸鈣凝膠使用壽命提高實(shí)驗添加物添加物質(zhì)凝膠顆粒溶凝膠顆粒破并不明顯。試驗通過(guò)Mn2+對Ca2-置換法,形成的量分數%解時(shí)問(wèn)/mn裂時(shí)間/min1A2O3(A)海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力明顯增強。2A:O3(B試驗過(guò)程為:分別稱(chēng)取1g固定化凝膠顆粒,溶于MteA)50m濃度為0.1mol/l的磷酸鹽中性緩沖液中,5 St(A)于35℃條件下,間歇振蕩,確定固定化凝膠顆粒開(kāi)65(B裂及溶解的時(shí)間,以測試凝膠顆粒耐磷酸鹽能力活性炭結果見(jiàn)表1。8活性炭(B)9空H從表1可見(jiàn)海藻酸鈣凝膠顆粒中添加劑不同,19A:(S0,(B)1.0其耐磷酸鹽能力也不同。添加活性炭的固定化凝膠Mn90(B.034030顆粒耐磷酸鹽能力沒(méi)有明顯提高,由于活性炭表面注:A表示添加物在滅)前加入B表示添加物在滅菌后加入。203年總第106期宋向陽(yáng)等:海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)酵積比較大且具有多孔性,添加到海藻酸鈣凝膠顆粒屮,增加了固定化細胞的通透性,但其耐磷酸鹽能力提高不多,開(kāi)裂時(shí)間為30min,比空白(不添加物的)多10min,溶解時(shí)間均為120min。添加SiOh比№O)效果要好,耐磷酸鹽能力提高2倍,這是由于SO2為原子型晶體,強度較高,添加至凝膠顆粒中可增加其強度。而采用冒換法形成海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細胞耐磷酸鹽能力增強顯著(zhù),因為Mn3、∧}'把(aξ-從海藻酸鈣凝膠顆粒中置換岀來(lái),磷酸鹽對海藻酸錳、海藻酸鋁的凝膠顆粒破壞性減少,故海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細胞耐磷酸鹽能力提高3倍2.2MnSO4溶液濃度對固定化細胞乙醇發(fā)酵的影響配置0,4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%,1,4%,981.6%的MnSO)溶液,利用Mn對Ca2置換法,分9別制備成海藻膠錳固定化酵母細胞,通過(guò)增殖培養,使凝膠株表面的樹(shù)十畢赤酵母細胞密集,形成高濃度的固定化酵母細胞、高效地利用皮糖,已糖同步發(fā)酵成乙醇。MnSO4溶液濃度對固定化細胞乙醇0.40.60.81.01.21.41.6發(fā)酵糖利用率的影響見(jiàn)圖1。MnS04溶液質(zhì)量分數由圖1可見(jiàn),MnO溶液濃度對固定化酵母細圖1MnsO,溶液質(zhì)量分數對固定化細胞乙醇胞乙醇發(fā)酵的影響較大。當MnSO4溶液質(zhì)量分數為發(fā)酵糖利用率的影響0.4%~1.2%時(shí),隨著(zhù)Mn2濃度的增加,還原糖利Fg.1 Effects of concentration of Mnso) solution on用率逐漸升高。如MnSO4溶液質(zhì)量分數為0.4%utilization ratio of sugar of ethanol fermentation0.6%,0.8%,1.0%時(shí),還原糖利用率分別為by cells immobilization91.7%,92.8%,93.6%,94.6%,當MnSO4溶液質(zhì)量分數為1.2%時(shí),還原糖利用率達最大值95.8%。而當MnSO溶液質(zhì)量分數超過(guò)1.2%時(shí),隨著(zhù)Mn2+濃度的增加,還原糖利用率反而下降。即MnSO)溶液質(zhì)量分數1.2%為轉折點(diǎn)。這是因為Mn2濃度對海藻酸鈣的置換影響較大。當MnSO4溶液質(zhì)量分數為0.4%由于Mn2+濃度低,海藻酸根螯合及置換出海藻酸鈣中的Ca2+形成的海藻酸錳凝膠的作用較弱凝膠株強度差,穩定性低。顯微鏡下觀(guān)察,醪液屮溢出的游離細胞較多,還原糖利用率為91.7%當 EnSO,溶液質(zhì)量分數超過(guò)1.2%時(shí),雖然凝膠株的機械強度有所提高,醪液中游離細胞減少,但是凝膠株彈性變小,且凝膠株介質(zhì)表面過(guò)于稠密,降低了底物及營(yíng)養鹽通過(guò)酵母細胞的傳質(zhì)能力,故還原糖利用率下降。結果表明,當MnSO4溶液質(zhì)量分數為1.2%時(shí),形成的海藻酸錳固定化酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵最佳2.3發(fā)酵液pH對固定化細胞乙醇發(fā)酵的影響將海藻酸錳固定化增殖酵母凝膠顆粒各30m表2發(fā)酵液pH對海藻酸錳固定化細胞分別放入體積為50ml不同pH混合糖(混合糖濃醇發(fā)酵24h的影響度為60g/1,木糖和葡萄糖各占50%)的發(fā)酵液中,Tae2 Effects of pH value of the broth on ethanol在35℃,150r/min條件下,發(fā)酵24h,結果見(jiàn)表2。fermentation for lasting 24 h by cells從表2可見(jiàn),發(fā)酵液pH在3.0~6.0范圍內immobilization of manganese alginate發(fā)酵液pH越低,越不利于海藻酸錳固定化酵母細PH濃度(,1用幸%細胞重理論得胞的生長(cháng)和繁殖。當發(fā)酵液pH3.5時(shí),殘糖濃度3.028.5152.442.30.216高達16.72g/L,乙醇得率為理論得率的32.1%。3.516.7272.118.50.32顯做鏡下觀(guān)察酵母細胞部分形態(tài)已不圓滑,單細胞02.6197570,896較多,芽孢少,即酵母細胞長(cháng)時(shí)間在pH3.5以下發(fā).52.530.B23生變形,其生物功能降低或喪失,糖代謝能力下降,6.02.2359.30.925己醇得率顯著(zhù)降低。當發(fā)酵液pH為4.0時(shí)酵母細胞形態(tài)圓滑糖利用率高,殘糖僅3.93g/L,乙醇得率為理論得率的896%。發(fā)酵液pH5.5時(shí),乙醇得率為理論得率的923%。發(fā)酵液pH大于5.5時(shí),乙醇得率雖有提高,但工業(yè)生產(chǎn)時(shí)高pH發(fā)酵液易染菌。因此,當pH為5.0~5.5時(shí)海藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵較適宜,此結果與海藻酸鈣固定化酵母乙醇發(fā)酵最適宜pH相吻合南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第27卷第:期2.4海藻酸鈣、海蘰酸鋁及海藻酸錳的乙醇發(fā)酵利用海藻酸鈣、海藻酸鋁和海藻酸猛的固定化7增殖樹(shù)干畢赤酵母細胞,在35℃、150r/min條件下對濃度為60g/1.混合糖(50%葡萄糖、50%木糖)分三別進(jìn)行發(fā)酵試驗(圖2)。結果表明,3種固定化增殖墼樹(shù)干畢赤醇母細胞前24d乙醇發(fā)酵均較穩定,但要3:三=本24d以后差異明顯發(fā)酵至36d,海藻酸鈣固定化細胞乙醇發(fā)酵中,6122428364248殘糖濃度由2.87g/I.(24d)上升至3.53g/L,其固發(fā)醇周期/d定化細胞重量由59.4g下降至53.6g,減少5.8g;圖2海藻酸鈣、海藻酸鋁、海藻酸錳而海藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵穩定,固定化酵母固定化細胞的乙醇發(fā)牌細胞流失少,僅減少2.6g。即海藻酸鈣、海藻酸鋁和Fi;.2 Ethanol fermentation of inurmolilizcd cells of calcium海藻酸錳的固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵可分別穩定發(fā)alginate, aluminum alginate and manganese alginate酵24、36及42d。這是因為發(fā)酵培養基中磷酸鹽逐海藥酸鈣固定化細胞乙醇發(fā)酵殘糖濃度:O海漸使海藻酸鈣凝膠破裂,而海藻酸鋁、海藻酸錳的固酸錳定化細眶乙醇發(fā)酵殘巒濃度;·海酸定化細胞耐磷酸鹽能力明顯強于海藻酸鈣固定化細定化細胞乙牌發(fā)酵殘櫆濃度;▲一海藻酸鈣固定化胞凝膠聯(lián)粒重海藻酸鋁固定化細胞凝膠顆草重胞。海藻酸錳圊定化酵母細胞乙醇發(fā)酵穩定性長(cháng)于?！Ｂ渌嵴`因定化組胞凝膠顆粒重海藻酸鋁的固定化酵母細胞,因為海藻酸錳凝膠顆粒強度雖然略差于海藻酸鋁固定化細胞,但海藻酸錳凝膠顆秈富有彈性,細胞固定得牢固,凝膠顆粒不容易破碎。海藻酸鋁固定化細胞凝膠顆粒強度較大,但凝膠顆粒比海藻酸錳固定化細胞凝膠顆粒脆性大,容易產(chǎn)生裂痕,最終導致細胞流失及凝膠顆粒自溶。所以,海藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵要比海濚酸鋁固定化細胞乙醇發(fā)酵穩定時(shí)間長(cháng)6d。3結論(1)Mn3-對Ca°+置換形成的海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力明顯增強,而MnS()溶液濃度對固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵糖利用率的影響較大。以不同質(zhì)量分數MnSO溶液分別制成的海藻酸錳固定化細胞進(jìn)行乙醇發(fā)酵,當MnSO.溶液質(zhì)量分數為1.2%時(shí),海藻酸錳固定化酵母乙醇發(fā)酵的糖利用率最高,達95.8%。(2)耐磷酸鹽能力試驗表明海藻酸鈉溶液中添加SO效果較好,形成的海藻酸鈣固定化細胞耐磷酸鹽能力是不添加的2倍。而以置換法形成的固定化酵母細胞要比以添加法形成的好,形成的海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力是不添加SiO3的3倍。3)采用置換法形成海藻酸錳固定化細胞,其發(fā)酵穩定性由24d延長(cháng)至42d,乙醇得率為理論得率的92.3%[1張樹(shù)政酶制劑工業(yè):上[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1998:350.[2i Lata A, Garria L A Dazm. 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