利血平結晶工藝的研究

藥物生物技術(shù)Pharmaceutical Biotechnology 2007, 14(2): 110-114利血平結晶工藝的研究孫蕾,馮蕾,周葉,錢(qián)秀萍,趙鳳生(上海交通大學(xué)藥學(xué)院,上海200240)摘要研究從催吐蘿芙木中提取利血平的結晶工藝。催吐蘿芙木根粉經(jīng)粗提沉淀生物堿溶解沉淀沉淀膠質(zhì)粗結晶、重結晶制得利血平。通過(guò)單因素法實(shí)驗,對可能影響利血平提取的因素進(jìn)行了考察。確定了適宜的利血平結晶工藝。得到的利血平純度達984%提取總收率298%。本結晶工藝所得利血平的純度和收率均較高適宜于工業(yè)生產(chǎn)。關(guān)鍵詞催吐蘿芙木;利血平;結晶中圖分類(lèi)號:R284.2文獻標識碼:A文章編號:1005-8915(2007)02011005蘿芙木為夾竹桃科植物蘿芙木[ Rauvol/ia學(xué)試劑有限公司),工業(yè)乙醇(上海振興化工verticilata(lour) BailL.]的根和莖。蘿芙木含廠(chǎng)),其他試劑為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限有利血平( reserpine)、育享賓利血胺、坎尼生等多公司),H2-818大孔吸附樹(shù)脂(華東理工大學(xué)華種吲哚類(lèi)生物堿,是云南省南藥的重要組成部震科技有限公司)。分2。利血平具有顯著(zhù)的降壓鎮靜和安定作用是一種常用的降壓藥。目前利血平的提取是用2方法苯為溶劑,經(jīng)與強堿性生物堿初步分離后,使利血平轉化為硫氰酸鹽得以純化。該工藝有機溶劑用2.1高壓液相色譜測定利血平的條件量大,利血平轉化為硫氰酸鹽的得率較低,包夾有色譜柱: ZORBAX SBO18(4.6mm×250mm,較多脂溶性雜質(zhì),不易純化3。5μm);流動(dòng)相:甲醇-H2O-三乙胺(72:28:云南思茅偉農植物制藥有限公司從非洲引種0:01);:流速:1.0ml/min;檢測波長(cháng):267m;柱的催吐蘿芙木( Ranvol fia vomitoria),利血平含量溫:30℃為云南蘿芙木的2~3倍。本課題組采用催吐蘿芙2.2催吐蘿芙木根粉中利血平含量的測定木為原料,用酸醇提取法取代苯提取法,再經(jīng)HZ稱(chēng)取干燥的催吐蘿芙木根粉10g,置于500ml818大孔吸附樹(shù)脂純化,得到利血平的粗提物。進(jìn)錐形瓶中,用10ml水潤濕后,加入100m含50%步探討了利血平的結晶工藝,建立了一條有機溶工業(yè)乙醇的0.025mo/LH2SO2溶液在避光的條劑用量少、對環(huán)境污染小、結晶純度高的提取利血件下放入搖床中振蕩溫度20℃,轉速250r/min。平的新工藝。將催吐蘿芙木根粉濾出,加入100m含50%工業(yè)1儀器與材料乙醇的0.025mol/LH2SO溶液再浸提1次。每Agilent100srs高壓液相色譜儀及工作次浸提時(shí)間均為2h合并2次浸提液并取樣檢站(德國安捷倫公司)。測,計算催吐蘿芙木中利血平含量Φ35mm×400mm玻璃層析柱。2.3利血平粗提液的制備干燥的催吐蘿芙木根粉(云南思茅偉農植物取干燥的催吐蘿芙木根粉2500g,用2500ml水制藥有限公司提供),利血平對照品(Sgma公潤濕加個(gè)含5%T業(yè)了酸的a25m/LHSO溶司),高壓液相色譜用甲醇(色譜純國藥集團化液浸中國煤化工次浸提時(shí)間均為CNMHG收稿日期:2006-11-10修回日期:2006-12作者簡(jiǎn)介:孫蕾,1983年生,女,漢族,上海市人,碩士研究生,研究方向:天然藥物提取與分離通訊聯(lián)系人:趙風(fēng)生Te:021-34204528,E-mail1Rizhao@sjtu.edu.cn孫蕾等:利血平結晶工藝的研究1114h,浸提液體積分別為25,12.5L。將兩份浸提液2.4.4粗結晶分別減壓蒸去乙醇,過(guò)濾,濾液作為吸附原液。先2.4.4.1溶劑的選擇取24ml沉膠后的上清將第二次浸提的吸附原液以13.5ml/min體積流液,分成4等份,蒸干。取2份樣品,各加入1ml量通人250mlHZ-818大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附,再乙酸乙酯溶解,分別濃縮至約100μl,然后分別加以10.6ml/min體積流量通入第一次浸提的吸附6倍乙酸乙酯液體積的甲醇或乙醇;另2份樣品原液。然后用500ml去離子水以8.3m/min體各加入1m丙酮溶解,分別濃縮至約100pl,然后積流量通人柱中洗滌。用750ml工業(yè)乙醇一水分別加入6倍丙酮液體積的甲醇或乙醇。4份樣(80:20,pH1.0)進(jìn)行解吸,平均體積流量品均混勻后置于4℃冰箱中20h結晶,離心,晶體6.3ml/min。棄去剛開(kāi)始流出的125ml解吸液,收用氯仿溶解后檢測利血平含量。集后面的625ml解吸液,即為利血平粗提液,用作2.4.4.2甲醇用量的選擇取50ml沉膠后的上結晶工藝研究。清液,分成4等份,蒸干后,分別加250dl乙酸乙2.4利血平的結晶工藝酯溶解后加入不同量的甲醇,4℃放置20h,離2.4.1沉淀生物堿得到利血平粗提液后,蒸去心,得粗結晶。晶體用氯仿溶解后檢測利血平粗提液中的大部分乙醇,再加入一部分水,以減少含量利血平的溶解度,然后調節pH到堿性,使包括利2.4.5重結晶取粗結晶250mg,加過(guò)量丙酮溶血平在內的生物堿沉淀,再進(jìn)一步純化解后,分成3等分,分別濃縮至2ml,分別加入不同2.4.1.1加水量的選擇取5份利血平粗提液,體積的甲醇,4℃放置20h,離心,得結晶。結晶用每份25ml,分別在50℃真空濃縮至約10ml,加入氯仿溶解后檢測利血平的含量。不同體積的水,用濃NaOH溶液調pH至8.0,離2.5小試工藝驗證沉淀各加20ml丙酮,熱水浴中溶解,離心,檢取干燥的催吐蘿芙木根粉2500g,按照上述測上清中利血平含量;沉淀再各加10ml氯仿溶利血平粗提液的制備方法,浸提得到利血平粗提解離心,檢測上清中利血平含量,計算沉淀利血平液。粗提液經(jīng)減壓濃縮至170m,加入340ml水稀的收率。釋,調至pH8.5,在4000r/min離心10min,得到2.4.1.2pH值的選擇取5份利血平粗提液,生物堿沉淀。用450m丙酮氯仿(9:1)溶液溶每份20ml,分別在50℃真空濃縮至約7ml各加解沉淀離心除去不溶性雜質(zhì)。上清液減壓蒸餾除2倍水,用濃NaOH分別調至pH6.0,7.0,8.0,去有機溶劑,棄去剩余的水相,沉淀加入31ml丙9.0,10.0,離心。沉淀各加20ml丙酮溶解,離心,酮溶解,再加人31ml氯仿一石油醚(1:1)沉淀檢測上清中利血平含量。沉淀再各用10ml氯仿膠質(zhì)。離心得到上清液,蒸干。用2ml乙酸乙溶解,離心,檢測上清中利血平含量,計算收率酯溶解后,再加5ml甲醇,4℃放置20h,離心,2.4.2溶解生物堿取5份利血平粗提液,每份得粗結晶。粗結晶加入過(guò)量丙酮直至溶解,濃20ml,分別在50℃真空濃縮至約7ml,各加2倍縮至約9ml,加18ml甲醇,4℃放置20h。離水,用濃NaOH調至pH8.5,離心。沉淀分別加心,得重結晶。所得晶體放入40℃烘箱中烘10ml不同比例的丙酮一氯仿溶解,離心,檢測上1.75h,稱(chēng)重。記錄每一步的收率,然后計算其清中利血平含量,計算收率?？偸章?。2.4.3沉淀膠質(zhì)取40ml溶解生物堿沉淀的丙酮一氯仿混合溶液,減壓蒸去有機溶劑,棄去3結果剩余的水相后,沉淀加8ml丙酮溶解,分成4等3.1催吐蘿芙木根粉中利血平含量的測定份,分別加不同體積的石油醚一氯仿(1:1),振中國煤化工粉中利血平的含量搖1h沉淀膠質(zhì)離心。分別用1ml石油醚洗滌為oCNMHG膠質(zhì)沉淀,離心。合并兩次上清液,檢測上清中3.2利血平的結晶工藝利血平含量。將膠質(zhì)取出,放在表面皿上晾干,3.2.1沉淀生物堿稱(chēng)重。3.2.1.1加水量的選擇實(shí)驗結果見(jiàn)表1。112藥物生物技術(shù)第14卷第2期Tab 1 Effect of amount of added water on yield3.2.1.2pH值的選擇實(shí)驗結果見(jiàn)表2of precipitated reserpineTab 2 Effect of ph value on yield of precipitated reserpineRatio of added water0:11:12:13:14:1pH value607.08.09.0and raw extract(v/v)Yied(%)92.297.799.898.3100.6Yield (%)73.2 90.9 97. 3 94.6 98.7 Note, yield (%)=(reserpine amount in acetone solution + reser-Notel: yield(%)=(reserpine amount in acetone solution+repine amount in chloroform solution)/ reserpine amount in raw ex-serpine amount in chloroform solution)/ reserpine amount in rawtract×100%extract%從表2可見(jiàn),隨著(zhù)pH值逐漸增大,利血平收不加水和加1倍體積的水,調pH值8.0沉淀率增加,當pH8~10時(shí),達到較高的收率。但利生物堿后離心,所得上清比較混濁說(shuō)明沉淀物較血平在強堿條件下不穩定,容易水解,所以選擇難沉降,收率較低。從表1可見(jiàn),當加水量為2倍pH8.0~9.0范圍內沉淀生物堿。體積或更大時(shí),沉淀較為完全。加2倍水的收率就32.2溶解生物堿實(shí)驗用丙酮氯仿配制混合達到973%,與3、4倍水的收率相差不多,但用水溶劑,改變兩者的比例考察溶解利血平的收率結量小,所以選擇2倍水。果見(jiàn)表3。Tab 3 Effect of proportion of acetone and chloroform on yield of dissolvedRatio of acetone and chloroform1:1nout chloroform)Yield(%)88.096.393.6Note: yield(%)= reserpine amount in acetone-chloroform solution /reserpine amount in raw extract 100%從表3可見(jiàn),只使用丙酮,利血平收率較低;丙酮氯仿混合溶劑中,其中含有少量的水,還含有酮氯仿比例為5:1和9:1的時(shí)候,利血平收率相當多的膠質(zhì),會(huì )影響以后的結晶,需要除去。較高;但氯仿加得太多時(shí),膠質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)會(huì )變成粘稠石油醚對膠質(zhì)的溶解度很小,可以用來(lái)沉淀膠狀,使沉淀結塊,收率降低。所以選擇丙酮一氯仿質(zhì)但石油醚對利血平的溶解度也很小,沉淀膠質(zhì)(9:1)溶解生物堿沉淀,用量為利血平粗提液體積時(shí)利血平的損失較大,因此選擇石油醚氯仿(1的50%1)作為沉淀劑。實(shí)驗結果見(jiàn)表43.2.3沉淀膠質(zhì)包括利血平的生物堿溶解在丙Tab 4 Effect of amount of petroleum ether-chloroform on precipitating gumAcetone-petroleum Acetone- petroleumAcetone-petroleumAcetone- petroleumAdded solventether-chloroformether-chloroformether-chloroformether-chloroform(4:1:1)(4:2:2)(4:3:3)(4:4:4)Reserpine amount in66.366.762.5supernatant(mg)Gum amount by388.6371.265.8354.2precipitation(mg)從表4可見(jiàn),丙酮石油醚一氯仿的比例為3.2.4粗結晶4:2:2時(shí),上清中利血平含量最高沉淀的膠質(zhì)3.2中國煤化工的粗結晶可選用溶的量與丙酮石油醚一氯仿(4:1:1)相差不大。解度CNMH配成的混合溶劑。所以選擇丙酮石油醚氯仿(4:2:2)為沉淀乙酸乙酯丙酮可作為溶解度大的溶劑,這是因為它劑且石油醚、氯仿的總量為利血平粗提液的10%們對利血平的溶解度較大,對未除盡的膠質(zhì)溶解度左右。也較大易于將包裹在膠質(zhì)中的利血平溶解。而甲孫蕾等:利血平結晶工藝的研究113醇、乙醇可作為溶解度小的溶劑。實(shí)驗結果見(jiàn)表5。3.2.5重結品重結晶選用丙酮和甲醇組成的混從表5中看出,乙酸乙酯的結晶效果高于丙合溶劑。實(shí)驗結果見(jiàn)表7。酮,甲醇的結晶效果高于乙醇,因此選用乙酸乙從表7可見(jiàn),隨著(zhù)甲醇用量的增加,收率明顯酯一甲醇作為結晶混合溶劑。增加,但純度有所下降。丙酮一甲醇體積比為13.2.4.2甲醇用量的選擇實(shí)驗結果見(jiàn)表6。1和1:2時(shí),純度相差不多,且后者所得晶體量較從表6可見(jiàn),當甲醇用量大于乙酸乙酯的2倍多,所以選擇丙酮甲醇(1:2)。時(shí),所得晶體總量較多,所以確定結晶溶劑為乙酸3.3小試工藝驗證乙酯一甲醇(1:2.5)。小試工藝提取利血平的收率見(jiàn)表8。Tab 5 Effect of different solvents on reserpine crystallizationolvent of crystallization Ethyl acetate-methanol Ethyl acetate-ethanol Acetone- methanol Acetone-ethanolCrystallized reserpine (mg)17.38.516.54.6Tab 6 Effect of methanol amount on reserpine crystallizatiTab 7 Effect of methanol amount on reserpine recrystallizationRatio of acetone andRatio of ethyl acetate1:11:21:31:4l:11:21:3and methanolRecrystallized reserpine(mg) 65.0 72.4 77.6Purity(%)98.398.297.9Crystallized reserpine (mg) 57.8 62.6 64.3 63. 8Note! purity(%)= Area of reserpine peak in hPLC/ total areaof all peaks in HPLCX 100%Tab 8 Yield of extracted reserpine in small trailProcedureOperationYield in this step(%)Total yield(%)2123Concentration of extractFiltration before adsorption by resin96.5Concentration by macroporous resin83.6Precipitation and dissolution of alkaloids82.5Precipitation of gum86.86Crystallization72.Recrystallization68.6Note!: Yield in this step(%)= reserpine amount in this step/reserpine amount in preceding stepX100%Note?: Total yield(%)=reserpine amount in this step/reserpine amount in extract X100%小試所得利血平晶體的總量為0.7129g,純29.8%從催吐蘿芙木用量計算總收率為度達98.4%,從酸性乙醇提取液計算總收率為0.285‰。利血平晶體的高壓液相圖譜見(jiàn)圖1。mAUreserpine中國煤化工CNMHGA: Reserpine standardB: Reserpine crystalFig 1 hPlc of reserpine standard and reserpine crystal114藥物生物技術(shù)第14卷第2期利血平的提取總收率僅為29.8%,原因是提4討論取、結晶的步驟較多,利血平相應的損失也較大。用含乙醇的酸性水從催吐蘿芙木中提取利血步驟14的損失與濃縮時(shí)溫度較高有關(guān),因此要嚴平時(shí),容易將催吐蘿芙木中的膠質(zhì)一并提取出來(lái)。格控制濃縮溫度以減少利血平的破壞。步驟5沉雖經(jīng)大孔樹(shù)脂提純,也難以去除膠質(zhì)。大孔樹(shù)脂提淀膠質(zhì)時(shí),膠質(zhì)中會(huì )夾帶部分利血平一起沉淀,造取液濃縮后加水,再調節pH為堿性,沉淀生物堿,成損失,應該充分攪拌以提高收率。步驟6、7結晶膠質(zhì)也隨之沉淀出來(lái)。本文選用丙酮溶解生物堿和重結晶的損失最大,這是由于母液中含有較高濃沉淀,是因為在丙酮中膠質(zhì)易于分散,從而可以將度的利血平,而小試是單批實(shí)驗,無(wú)法回收。在規大部分利血平溶解。但丙酮對利血平的溶解度不模放大的多批實(shí)驗中,可以將本批實(shí)驗的結晶母液夠大,還需用氯仿再溶解一次。氯仿對利血平的溶和重結晶母液加在下一批的沉淀膠質(zhì)步驟中,回收解度很大,缺點(diǎn)是會(huì )使膠質(zhì)聚集成團,致使利血平其中的利血平。此外,整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中應注意避包裹在膠質(zhì)內部,不易溶解出來(lái),所以氯仿用量不光,以降低利血平見(jiàn)光分解的損失能太大。參考文獻在小試工藝驗證實(shí)驗中,用丙酮一氯仿(9:1)溶液溶解生物堿沉淀時(shí),因為沉淀的生物堿量較1]周麗娜戴斌,丘翠嫦蘿芙木質(zhì)量標準修訂的研究[J廣西多,需用較多的丙酮一氯仿溶液,用量超過(guò)了粗提中醫藥,2003,26(5):37.液體積的一半。隨后的步驟中加入丙酮溶解沉淀,〖2]田學(xué)軍龍云惠何英等綠春蘿英木資源薄層色譜鑒別J].紅河學(xué)院學(xué)報,2005,3(6):23再加入氯仿一石油醚(1:1)沉淀膠質(zhì),由于小試中[3]張志信,張仕秀,宋關(guān)斌D51大孔樹(shù)脂酸水法提取利血處理的樣品量比做結晶條件實(shí)驗時(shí)要大,所用的溶平的工藝研究[J].藥物生物技術(shù),2004,11(3):157.解固體的溶劑可以相應減少。本步驟所用的丙酮4]柯銘清中草藥有效成分理化與藥理特性[M第2版長(cháng)沙:為粗提液的5%,氯仿一石油醚用量也為粗提液湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1982,196.的5%。Study on Crystallization of RespersineSUN Lei, FENG Lei, ZHOU Ye, QIAN Xiu-ping, ZHAO Feng-sheng(Scholl of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)Abstract Crystallization process of reserpine was investigated in this paper After separation from rauuolfia vomitoria through the process of rough extraction, precipitation of alkaloids, dissolution of pre-cipitation, sedimentation of gum, crystallization and recrystallization, reserpine was obtained. Variousfactors affecting the isolation of reserpine were studied by single factor method. Suitable conditions forthe crystallization of reserpine were optimized. The purity of reserpine was 98. 4%. Total recovery yieldwas 29.8%. The crystallization technology can bring about high purity and recovery of reserpine. It isapplicable for industrial production.Key words Rauvol fia vomitoria, Reserpine, Crystallization信息2007-10一種低聚糖一新科斯糖的發(fā)酵法生產(chǎn)方法新科斯糖中國煤化工勺葡萄糖基6碳位相連接構成的蔗果三糖,與普通低聚果糖相比,它又具有更為優(yōu)越的增殖CNMHG夫酵母28為出發(fā)菌株,發(fā)酵生產(chǎn)新科斯糖的方法和工藝條件,包括發(fā)酵的培養基組成、濃度、溫度、pH培養時(shí)間等?？刂埔欢ǖ陌l(fā)酵條件可得到較高產(chǎn)量的新科斯糖