聚乙二醇化重組人干擾素α2b的質(zhì)量檢測

48中國生物制品學(xué)雜志2005年1月第18卷第1期Chin 」Biogcals January 2005, Vol. 18 No.1[實(shí)驗技術(shù)]聚乙二醇化重組人干擾素a:2b的質(zhì)量檢測張雪梅郭橋吳福泉陳云聲齊影朱麗娜周麗紅盛軍劉晶[摘要]目的建立聚乙二醇化重組人干擾索ca2b(PEC rhlFNa2b)的質(zhì)量檢測方法。 方法采用Wish細胞-vsv病毒系統,以CPE法測定干擾素的生物學(xué)活性,基質(zhì)輔助激光解吸附^飛行時(shí)間質(zhì)譜法測定相對分子質(zhì)量,反向高效液相法( RP-HPLC)測定純度,溴化氰裂解-SDS-PAGE法測定肽圖,等電聚焦電泳法測定等電點(diǎn),紫外分光光度法測定紫外吸收光譜。結果聚乙二醇 化重組人干擾素o2b 的比活為6.0x 10 ~ 10.0x 10 1U/mg蛋白,相對分子質(zhì)量約為62 600,等電點(diǎn)在5.20~ 6.55之間,紫外最大吸收峰約在278 nm波長(cháng)處。結論所建 立的檢測方法可控制聚乙二醇化重組人干擾素ce2b質(zhì)量。[關(guān)鍵詞]重組人干擾索 a2b;聚乙二醇;化學(xué)修飾;質(zhì)量檢測Quality Control of PEG-rhIFNa2bZHANG Xue-mei, GUO Qiao, WU Fu-quan,et al ( Changchun Institute of Biological Products , Changchun130062, China)[Abstract] Objective To develop the methods for quality control of PEG -hIFNa2b. Methods Dtemmine the biological activity of PEG :hIFNa2b by CPE method using Wish cell-VSV system, the relative mo-lecular weight by MALDI-TOF-MS, the purity by RP-HPLC, the peptide map by SDS-PAGE afer lysis with cy-anogens bromide, the isoelectric point by isoelectric focusing electrophoresis and the ultraviolet absorption spec-tum by ultraviolet spectroscopy . Results The specific activity , relative molecular weight and isoelectric pointof PEG hIFNa2b were 6.0x 106-10.0 x 10 IU/mg protein,62 600 and 5.20-6. 55 respectively , and its maxi-mum ultraviolet absorption peak appeared at 278 nm. Conclusion The de“:loped methods were suitable forthe quality control of PEG- rhIFNa2b.[Key words] rhIFNa2b; PEG;Chemical modification;Quality control干擾素(IFN)在體內半衰期短,且長(cháng)期使用易產(chǎn)2.儀器生抗體,影響了其藥效的發(fā)揮。聚乙二醇化學(xué)修飾Biflex I型MALDI-TOF質(zhì)譜儀( Bruker Daltonics的IFN(聚乙二醇化IFN)能提高了相對分子質(zhì)量,并Co.); RP-HPLC所用色譜柱Agilent Zorbax Eclipse降低了免疫原性,延長(cháng)了其在體內的半衰期",在臨XDB-C% :4.6x 150 mm, HP1100型真空在線(xiàn)脫氣機,床上能更好地發(fā)揮治療作用。四元梯度泵,DAD檢測器;Bio-RadMini-I垂直電泳本文建立了聚乙二醇化重組人干擾素a2b系統; BECKMAN DU-50紫外分光光度計; Phamacia( PEG-mhIFNa2b)的生物學(xué)活性、分子結構和分子特公司生產(chǎn)的Phast-System全自動(dòng)水平電泳儀。性等質(zhì)量指標的檢測方法,為聚乙二醇化學(xué)修飾的3.蛋白含量檢測蛋白類(lèi)藥物的研究與開(kāi)發(fā)提供了有效的檢測手段和按照2000版《中國生物制品規程》“生物制品化經(jīng)驗。學(xué)及其他檢定方法”中微量法(Lowry)進(jìn)行2]。材料與方法.4.抗病毒活性檢測按照2000版《中國生物制品規程》“重組人干擾1.材料Wish細胞為本所常規傳代培養,VSV病毒為本素a2b制造和檢定規程”中所述方法[2]。中國煤化工所繁殖保存;干擾素國家標準品及蛋白國家標準品購自中國藥品生物制品檢定所;PEG:hIFNa2b為本MHC N M H G行時(shí)間質(zhì)譜(MAL-DI-T0F-MS)法又SLS-rAGE測疋相對分子質(zhì)量。所制備。.6.純度檢測作者單位:長(cháng)春生物制品研究所(長(cháng)春130062).采用SDS-PAGE法后掃描儀掃描及反向高效液中國生物制品學(xué)雜志2005年1月第18卷第1期Chin J Biologicals Jormuary 2005, Vol. 18 No.1相法(RP-HPLC) (流動(dòng)相: A:0.1%三氟乙酸水溶g液[2]。B:95%乙腈的A液。梯度:B液由0% ~600100%A液,時(shí)間:0 ~ 30 min,流速:1 ml/min, 檢測波500長(cháng):214 nm,柱溫:25C)測定。7.肽圖分析400采用溴化氰裂解后SDS-PACE法測定日。3008.等電點(diǎn)檢測.200采用水平等電聚焦電泳法。9.紫外光吸收性質(zhì)分析00按照200版《中國生物制品規程》“生物制品化20000300004000050000600007000080000學(xué)及其他檢定方法”中紫外光譜檢測法進(jìn)行間。M結圖1基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法測定PEG-rhIFNo2b的相對分子質(zhì)圉譜1.干擾素抗病毒活性Fig 1. Determination of relative molecular weight of PEG-以干擾素國家標準品為標準，檢測連續3批rhlFNo2b by MALDI-TOF-MSPEG rhIFNa2b干擾素抗病毒活性、蛋白含量及比活,見(jiàn)表1。Mr表1 PEG-rhIFNa2b 的抗病毒活性和比活-93000Tab 1. Antiviral and speiflc activities of PEG-hIFNa2bAntiviral activityProteinSpecife activitySample(10 IU)(u/m1)(10 IU/mg)_-43000015.7567.510.0- 47 0004.6539.38.6-_14 4003.6586.8.11,5: Mr marker;2,3,4:PEG-rhFNic2b.2.相對分子質(zhì)量3批PEG-hIFNa2b經(jīng)MALDI-TOF-MS法測定相圖2 SDS-PAGE法測定PEG-rhIFNa2b的相對分子質(zhì)對分子質(zhì)量約為62 600,SDS-PAGE法測得的相對分量圖譜子質(zhì)量約在93 000附近,見(jiàn)圖1、圖2。Fg 2. Determination of relative molecular weight of PEG-rhIFNa2b by SDS-PAGE3.純度SDS- PAGE后掃描法測定純度為100% ,見(jiàn)圖3;0.800-- 0.800RP-HPLC法測定PEG -rhIFNa2b保留時(shí)間約為10.2 min,純度為98.9%。本文檢測了3批樣品,并且每批樣品重復檢測3次,所得結果相同。4.肽圖分析0.400-t 0.400采用溴化氰裂解后,干擾素被裂解成4個(gè)肽段,相對分子質(zhì)量為8 200~ 12 000; PEC -rhIFNa2b也被裂解成4個(gè)肽段,與干擾素肽圖不同的是,其上方有0.000-0.0002個(gè)較大相對分子質(zhì)量帶,其中I為未裂解的PEG-中國煤化工300hIFNa2b, I為結合了PEG大分子的肽段。其余肽段相對分子質(zhì)量為9000~ 12 000,見(jiàn)圖4、圖5。對3YHC N M H Grp-htIFNa2b的純度批樣品反復檢測,結果相同。表明該方法適合對圖譜Fg 3. Scanning of SDS-PAGE proflePEG-rhIFNa2b做肽圖分析。中國生物制品學(xué)雜志2005年1月第18卷第1期Chin J Biologicals January 2005, Vol.18 No.1擾素的免疫原性,因而在臨床上能更好地發(fā)揮作用。但是,干擾素經(jīng)化學(xué)修飾后,其結構和性質(zhì)都發(fā)生了很大變化,原有的針對干擾素的檢測方法不能完全適合。本文在對PEG-rhIFNa2b的理化和生物學(xué)性質(zhì)研究的基礎上,建立了一套質(zhì)量檢測方法。經(jīng)驗證,該方法準確可靠,能很好地控制其質(zhì)量。hIFNa2b經(jīng)PEG化學(xué)修飾后在體外抗病毒活性2512-一有較大下降,約為修飾前的8% ,這可能是由于大分子物質(zhì)的化學(xué)結合影響了干擾素的空間結構,并且與干擾素化學(xué)結合的PEG的線(xiàn)性長(cháng)鏈在干擾素分1:protein Mr marker;2,3,4:PEG rhIFNa2b.子周?chē)p繞,形成了一道分子屏障,阻礙其活性圄4 PEG rhIFNa2b溴化氰裂解肽圉部位與受體的結合,從而影響了抗病毒活性的發(fā)揮。Fig 4. Peptide map of PEG-rhIFNa2b treated by CNBr有研究顯示[1 ,與干擾素結合的PEG相對分子質(zhì)量越大,其活性越低。然而這些結果是在體外測出的,在體內,由于受多種因素的影響,其生物學(xué)活性的發(fā)揮還有待進(jìn)-步研究。由于蛋白質(zhì)結合了惰性線(xiàn)性大分子后,其整個(gè)分子的外部形狀和電場(chǎng)性質(zhì)都發(fā)生了很大變化,PAGE法和凝膠層析法已不再適合檢測其相對分子質(zhì)量;MALDI-TOF-MS法所需樣品量小,測量范圍二E2廣,精確度高,非常適合對此類(lèi)樣品分子量的檢測。肽圖分析中溴化氰裂解不完全,表明hIFNa2b修飾后穩定性明顯提高;裂解后有一肽段相對分子質(zhì)量較大,說(shuō)明此肽段上存在與PEG結合的位點(diǎn);1:rhlFNo2b;2:protein Mr marker.其余肽段位置與修飾前相同。.本文所建立的方法基于PEG-thIFNa2b 的性質(zhì),圄5 rhIFNa2b 溴化氰裂解肽圄簡(jiǎn)單易行,精確度高,能較好地控制PEC-hIFNa2bFig 5.Peptide map of rhIFNa2b treated with CNBr質(zhì)量,同時(shí)也為類(lèi)似的生物制品提供了可靠的檢測方法。5.等電點(diǎn)檢測經(jīng)檢測3批樣品等電點(diǎn)為5.2 ~ 6.55,而hIFNa2b畚考文獻的等電點(diǎn)應為4.0 ~ 6.7,表明hIFNa2b經(jīng)PEG修飾[1] Jeng sT, Byun SM. Decresed agutinablil d meaypx-lyethyle后,其等電點(diǎn)沒(méi)有改變。gycol ttachedl rod blood cells: sgifcance嶼a blood sbtute. Atif6.紫外光譜檢測Cells Blood Subesit Immbil Biotechnol, 196,24:503-511.1經(jīng)檢測最大吸收峰約為278 m,說(shuō)明hIFNa2b[2]中國生物制品規程2000經(jīng)PEG修飾后紫外最大吸收值沒(méi)有改變。[3]張龍翔,主編.生化實(shí)驗方法和技術(shù).第2版.北京:高等教育出版社1997.100- 116.6[4] Megof P. Beaiotis AC, Maskiewicz R. Analyi's of plythylene gyolmodifed superoide disnutase by chromalographic, light sttring,重組人干擾素a2b經(jīng)聚乙二醇化學(xué)修飾后相對chernical and enzymatic mithods. Chem Parm Bull Val, 1988, 36(8):分子質(zhì)量明顯增加,從而延長(cháng)了其在體內的循環(huán)時(shí)3079-3089.間,同時(shí)由于免疫惰性大分子的遮蔽作用,降低了干中國煤化工YHc N M H口L2_0回200402)2