喹乙醇人工抗原的合成與鑒定

北容業(yè)學(xué)報2010,19(7):1-6Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica喹乙醇人工抗原的合成與鑒定宋春美12,高愛(ài)中3,鄧瑞廣1,職愛(ài)民1,郅玉寶1,侯玉澤2,張改平1(1.河南省農業(yè)科學(xué)院,農業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗室河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室,鄭州4500022.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南洛陽(yáng)471003;3.杭州隆基生物技術(shù)有限公司,杭州310011)摘要:采用琥珀酸酐法合成喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS),以質(zhì)譜法對其進(jìn)行鑒定;活化酯法合成全抗原O.A-BSA、 OLA-OvA,以紫外(UV)和凝膠電泳( SDS PAGE)鑒定之;用 OLA-BSA免疫BALB/c小鼠,間接ELISA測定多抗血清效價(jià),阻斷 ELISA鑒定其敏感性、特異性。紫外掃描測得 OLA-BSA、 OLA-oVA中OLA-HS和BSA,OVA的分子結合比分別為17.1:1和12.4:1;3號小鼠抗血清的效價(jià)最高,對OLA的IC為58.923ng/mL,與卡巴氧的交叉反應率為1.841%與其他藥物無(wú)交義反應。通過(guò)系列ESA鑒定,獲得高價(jià)、敏感特異的多克隆抗體(pAb),為OLA殘留免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎關(guān)鍵詞:喹乙醇;人工抗原;合成;鑒定中圖分類(lèi)號:S859.84文獻標識碼:A文章編號:1004-1389(2010)07-0001-06Synthesis and Characterization of Artifical Antigen of olaquindoxSONG Chunmei,, GAO Aizhong DENG Ruiguang, ZHI Aimin'ZHI Yubao', HOU Yuze 2 and ZHANG Gaiping(l. Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture, He'nan Provincial Key Laboratory forAnimal Immunology, He'nan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002. China; 2. Food andBioengineering College, He'nan University of Science and Technology, Luoyang He'nan 471003, China3. Hangzhou Clongene Biotech Co, Ltd, Hangzhou 310011.ChinaAbstract: The derivative of olaquindox, called as OLA-SH, was synthesized by succinic anhydridemethod and identified by mass spectrometry(MS). Two complete antigens of olaquindox(OLA-BSAOLA-OVA)were prepared by active ester method(AE). The characterization of hapten-protein conjugates were examined by two methods, ultraviolet spectrophotometry (UV), and sodium dodecyl sul-fate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE), respectively. BALB/C mice were immunizedwith OLA-BSA, the titre of polyclonal antibody( pAb)was detected by indirect ELISA, the sensitivityand specificity of pAb was identified by blocking ELISA. According to UV scanning, the conjugationratio of OLa- HS to BSa and ova was about 17. 1: I and 12. 4:1. The titer of pAb for No. 3 mousewas the highest, its ICso was 58. 923 ng/ mL, cross reaction rate to carbadox was 1. 841%, and nocross reaction to other antibiotics. The high-titer, sensitive and specific anti-Ola p Ab have been pro-duced in sera of ELISA, which made it possible to establish immunoassay of oLa residues.Key words: Olaquindox; Artificial antigen; Synthesis; Identification喹乙醇( Olaquindox,OLA)屬于喹啉類(lèi)化合物,最早由西德 Byer公司研制開(kāi)發(fā),是目前在收稿日期:200909-10修回日期:2010-03-15H中國煤化工基金項目國家十一五”科技攴撐計劃項日(2006BAK02A21)第一作者:宋春美女,頓士研究生,研究方向為食品安全檢測。 E-mail zhCNMHG通訊作者:張改平,男,中國工程院院士,博士生導師,主要從事動(dòng)物免疫學(xué)和魯藥殘留研究。Emil: hanggaiping2003@ yahoo.西北農業(yè)學(xué)報19卷中國生產(chǎn)和廣泛使用的具有抗菌、促生長(cháng)作用的鄭州大學(xué)醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心,河南省農業(yè)科學(xué)化學(xué)合成飼料添加劑口。OLA是一種基因毒劑院農業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗室飼養和生殖誘變劑,有致突變、致畸作用2。研究發(fā)1.3主要儀器現,長(cháng)期使用后,OLA在畜禽體內和生態(tài)環(huán)境中Quattro micro API三重四級桿質(zhì)譜儀,美國造成蓄積殘留,可通過(guò)食物鏈間接地對人類(lèi)健康 Waters公司;DU-600核酸蛋白分析儀,德國造成威脅。鑒于此,國家對其使用做出了嚴格 BECKMAN公司; Bio- rad-550型酶標儀,美國限制?！吨袊F藥典》和農業(yè)部第168號公告《飼 Bio-rad公司;AE260電子天平,德國MET料藥物添加劑使用規范》中規定:OLA禁用于禽、TLER公司;3K-18高速冷凍離心機,德國 Sigma魚(yú)和體質(zhì)量超過(guò)35kg的豬,動(dòng)物屠宰前或上市公司;凝膠成像系統及分析軟件, Syngene公司;前的休藥期為35d20。并規定其在豬肝臟和肌超凈工作臺,美國 Forma Scientific公司;JM250肉中的最大殘留限量分別為50和4gg/kg3).電泳儀,大連捷邁科貿有限公司;DK8D電熱恒目前檢測OLA殘留的方法主要有薄層色諧溫水槽,上海一恒科技有限公司;Sz93自動(dòng)雙重法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、液質(zhì)聯(lián)用純水蒸餾器,93-3定時(shí)恒溫雙向磁力攪拌器,上法01等,這些方法不但需要復雜昂貴的儀器,而海亞榮生化儀器廠(chǎng);旋轉蒸發(fā)儀,鞏義市予華儀器且需經(jīng)過(guò)繁瑣的前處理,很難達到快速、簡(jiǎn)便的現有限責任公司場(chǎng)檢測要求。而在動(dòng)物的復雜基質(zhì)中開(kāi)展痕量殘1.4方法留分析特異性、靈敏度、準確性、分析成本與效率1.4.1琥珀酸酐法合成喹乙醇半琥珀酸酯是最為重要的考核指標;免疫化學(xué)技術(shù)特別是酶( OLA-HS)參照文獻[13]所述方法,并對其進(jìn)免疫分析技術(shù),具有高選擇性、高靈敏度和高通量行改進(jìn)。稱(chēng)取26.30gOLA和13.00g琥珀酸酐特點(diǎn)恰好可以滿(mǎn)足上述要求,必將在OLA快速( Succine anhydride,SUA)置于500mL反應瓶檢測方面發(fā)揮重要作用12。本研究旨在合成并中,加入100mL二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑,鑒定OLA的人工抗原,為其殘留免疫學(xué)檢測方90C反應1h;將反應液冷卻至室溫,緩慢加入法的建立和擁有自主知識產(chǎn)權檢測產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠400mL蒸餾水中,邊滴加邊攪拌,溶液中析出大定基礎。量淡黃色沉淀;抽濾沉淀,用冰蒸餾水洗滌后抽1材料與方法干,50℃烘干,用蒸餾水進(jìn)行重結晶,重復3次干燥得淡黃色針狀結晶,即為 OLA-HS,合成路1.1試劑與溶液線(xiàn)見(jiàn)圖1。OLA標準品(純度99%),Dr. Ehrenstorfer;1.4.2活化酯法合成OLA人工抗原稱(chēng)取牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA), Pierce10.96 mg OLA-HS溶于500μLNN二甲基甲產(chǎn)品;弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑酰胺(DMF)中,加入9.34mgN,N二環(huán)已基碳(FIA), Gibco產(chǎn)品;四甲基聯(lián)苯胺(TMB), Sigma二亞胺(DC),用200LDMF溶解4.17mgN產(chǎn)品;羊抗鼠酶標二抗( GaMIgG-HRP),華美生羥基琥珀酰亞胺(NHS),將其滴加到上述溶液物工程有限公司產(chǎn)品;試驗用水為超純水河南省中,室溫攪拌反應8h,此為反應液A;另稱(chēng)取農業(yè)科學(xué)院農業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗室制20.00 mg bSa溶于2.00mL0.01mol/L,pH備;其他試劑市售所得,均為AR級。7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,此為反應液B。將洗液(PBST)為0.01mol/L、pH7.4的磷酸反應液B置于磁力攪拌器上,4℃下將反應液A鹽緩沖液(PBS),含0.5mL/ L Tween20;包被液緩慢滴加到反應液B中,攪拌反應過(guò)夜。次日將為0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS);反應液置于處理過(guò)的透析袋內,在PBS中透析3間接 ELISA的封閉液、稀釋液為含50mL/L豬d,離心棄沉淀,分裝并貯于-20℃備用。交聯(lián)產(chǎn)血清的PBST;酶底物為T(mén)MB的磷酸檸檬酸緩物命由回圖2。同理合成沖液;終止液為2mol/L的硫酸溶液。包被中國煤化工1.2實(shí)驗動(dòng)物YHaNMHGSPF級6~8周齡雌性BALB/c小鼠,購自宋春美等:喹乙醇人工抗原的合成與鑒定CONHCH, CH, OHCONHCH, CH, OCCH CH, COOHDMSOLAUAOLA-HS圖1半抗原 OLA-HS合成路線(xiàn)Fig 1 Synthetic routes to the haptenONHCH2CH2OCCH, CH2 COOHDCCOLA-HSNHSBSACONHCH2CH2OCCHCH2C0--0--N中間體 Intermediate productCONHCH, CH,OCCH, CH, CONHOLA-BSA圖2活化酯法合成OLA-BSA路線(xiàn)Flg. 2 Synthesis scheme of OLA-BSA by active ester method1.4.3UV鑒定OLA人工抗原用PBS配制用文獻[15]介紹的方法,濃縮膠體積分數為50OLA-HS、BSA和OVA的標準溶液,將免疫原和mL/L,分離膠體積分數為100mL/L,濃縮膠電包被原按一定比例稀釋,用 Braford法測定其蛋壓70V,分離膠電壓85V,上樣量為20μL,考馬白質(zhì)質(zhì)量濃度,據此質(zhì)量濃度調節免疫原和包被斯亮藍染色5~6h后,置脫色液中脫色過(guò)夜。原溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別與BSA和OⅴA1.4.5 OLA PAb的制備用 OLA-BSA免疫的標準溶液致在波長(cháng)20-50m范圍內進(jìn)周齡!V凵中國煤化工每只0.2mL行紫外掃描,參照文獻[14]所述方法分別計算(含量CNMHG射。首免,用OLA-HS與BSA和OVA的分子結合比。無(wú)菌PBS溶解 OLA-BSA,與等量FCA混合,充1.4.4 SDS-PAGE法鑒定OLA人工抗原采分乳化;加強免疫,用無(wú)菌PBS溶解 OLA-BSA,西北農業(yè)學(xué)報19卷與等量FIA混合,充分乳化首免后4周進(jìn)行共BSA與 OLA-HS偶聯(lián)后,兩者的峰疊加并位移免4次每次間隔2周,最后1次免疫后10d斷至261nm,與BSA、 OLA-AS的紫外吸收曲線(xiàn)相尾采血分離血清。比, OLA-BSA的紫外吸收曲線(xiàn)都發(fā)生了改變既1.4.6 OLA PAb的鑒定效價(jià)測定:采用間接具備BSA的紫外吸收特征,也具備 OLA-HS的ELISA測定pAb效價(jià),基本程序參照 Tijssen的紫外吸收特征,表明 OLA-HS與BsA偶聯(lián)成方法。第1步,用 OLA-OVA包被,包被質(zhì)量功1。同理證明 OLA-OVA偶聯(lián)成功。依據朗濃度0.5gg/mL,包被量每孔100μL,37℃溫育2伯比爾定律推算出 OLA-BSA的分子結合比約為h,PBST洗板6次(下同);第2步,用50mL/L17.1:1, OLA-OVA的分子結合比為12.4:1豬血清封閉,每孔200μL,37℃溫育1h,洗板;第3步,加多抗血清,每孔50μL,用封閉液倍比稀釋,設陰性對照(NC)和空白對照(BC),37℃溫育15min,洗板;第4步,加 GaMigG-HRP,用封倒臺60閉液1:1000稀釋,每孔50μL,37℃溫育30min,洗板;第5步,加酶底物TMB顯色,每孔50μL,室溫反應5min;第6步,終止顯色反應,每孔00220240260280300320340360380400加入終止液50μL-,用酶標儀讀OD4s;第7步,結果判斷,以待測孔OD45≥NCOD450的2.1倍(P/N≥2.1),判為陽(yáng)性圖3OLA的質(zhì)譜圖敏感性測定:采用阻斷 ELISA鑒定其敏感Fig 3 ESI-MS spectrum of OLA性。阻斷 ELISA測定抗血清對OLA的半數抑制質(zhì)量濃度(IC5),并以ICs作為敏感度,操作步80驟與間接 ELISA的區別在于第3步加OD5為E百701.0的小鼠血清50μL和不同質(zhì)量濃度的OLA腮g50溶液(抑制劑)50μL。特異性測定:采用交叉反應試驗鑒定其特異性。交叉反應試驗選擇OLA及卡巴氧、乙酰甲喹、磺胺間甲氧嘧啶、嗯喹酸等競爭物,用阻斷200220202803003203403603ELISA測定各競爭物的IC0,以pAb對OLA的質(zhì)荷比m/zICs與各競爭物的IC50之比的百分數為其交叉反圖4OLA-HS的質(zhì)譜圖應率(CR%)。Fig 4 ESI-MS spectrum of OLA-HS2結果與分析2.1 OLA-HS的質(zhì)譜鑒定結果圖3為OLA標準品經(jīng) ESI-MS檢測后的圖譜,最強m/z286.7為[OLA+Na]的分子離子峰;圖4為OLA衍生物( OLA-HS)的 ESI-MS圖譜最強m/z386.8為[ OLA-HS+Na]的分子離子峰,表明新合成化合物的分子量為362.8,與其理論分子量363.1基本一致,初步證明OLA220240260280300320340360380400420440460480500的衍生化是成功的。中國煤化工2.2OLA人工抗原的UⅤ鑒定結果人工抗原、載體蛋白和半抗原的紫外掃描結CNMHG漿外掃描光譜·rof BSA果見(jiàn)圖5、圖6。由圖5可知,BSA的最大吸收峰OLA-HS and OLA-BSA在278nm, OLA-HS的最大吸收峰在259nm,7期宋春美等:喹乙醇人工抗原的合成與鑒定2.4 OLA PAb的鑒定結果2.4.1 OLA PAb效價(jià)和敏感性測定結果間接 ELISA效價(jià)見(jiàn)圖8,Co結果見(jiàn)圖9。由圖8可知,免疫的3只小鼠血清抗體效價(jià)均達到了10ˉ‘,獲得了較好的免疫效,3號鼠血清效價(jià)最小鼠1 Mouse1小鼠2 Mouse小鼠3 Mouse322024026028030032034036038040042040460480500圖6 OVA. OLA-HS和OLAOⅤA的紫外掃描光譜Fig. 6 UV scanning spectrum of ovAOLA-HS and OLA-ovA2.3OLA人工抗原的 SDS-PAGE鑒定結果200如圖7所示,免疫原和包被原 SDS-PAGE電OLA PAbl的稀釋度泳條帶的遷移率均比各自載體的遷移率小,且有Diluted concentration of OLA pAb(10")明顯的拖尾現象,說(shuō)明偶聯(lián)物的分子量大于載體圖8小鼠血清效價(jià)的分子量,偶聯(lián)成功1。Fig 8 Titer curve of BALB/e mice antiseraMarker BSA OLA-BSA OVA OLA-OvA小鼠1 Mouse l小鼠3 Mouse37.4ku66.2ku43.0kuy=-0.2166x+0.563531.0kuc5o=58.923ag/mL20.0ku14.4ku0.51.0圖7人工抗原及其載體的 SDS-PAGE結果Ig[OLA dilution/30(og/mL)圖9pAb對OLA的阻斷 ELISA抑制曲線(xiàn)Fig 7 SDS-PAGE electrophoresis of artificialFig 9 The inhibitive curve for pAb toantigen and its carrierOLA by blocking ELISA表1 OLA pAb與其他競爭物的交叉反應Table 1 The crossreactivity of oLA pAb with compete compounds半數抑制質(zhì)量濃度/(ng/mL)交叉反應性/%乙醇 Olaquindox58.923卡巴氧 Carbadox乙酰甲喹 Maquindox>5.0×100.I18磺胺間甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine>5.0×10<0.118磺胺嘧啶 Sulfadiazine>5.0X104<0.118嘔哮酸 Oxolinic Acid>5.0X10<0.118青霉素 Penicillin5.0×104四環(huán)素 Tetracycline中國煤化工0.18氯莓素 Chloramphenicol新莓素 NeomycinTHCNMHG菜克多巴胺 Ractopamine>5.0X104<0.1186西北農業(yè)學(xué)報19卷高;由圖9可知,3號鼠的IC5最低,達到58.923[3]孫雷韓嘉媛汪霞等.嗤乙醇的毒理學(xué)研究概況[Jng/mL,線(xiàn)性回歸方程為y=-0.2166x+中國魯藥雜志,2008,42(1):41440.5635,相關(guān)系數R2=0.987,符合線(xiàn)性關(guān)系的判[4]劉維華,劉學(xué)琴,吳彥虎,等.HPLC法測定飼料中唯乙醇的研究[J.中國魯藥雜志,2007,41(10):29-30定標準,故選擇3號鼠為細胞融合備用鼠。[5]農業(yè)部畜牧獸醫局農業(yè)部發(fā)布動(dòng)物性食品中獸藥最高殘2.4.2 OLA pAb特異性鑒定結果由表1可留限量(續)[.中國獸藥雜志,2003,37(4):1520.知,OLA抗血清對卡巴氧有1.841%的交叉反應[6]劉安南薄層色諾法鑒別中西復方制劑中唾乙醇成分[J性,對其他藥物無(wú)交叉反應江西飼料,2001(1):23[7] dos Ramos F], da Silveira IN, de Graaf G. Column liquid3討論in feeds[J] Journal of Chromatography A,1991,5583.1關(guān)于OLA人工抗原的合成125-130.OLA是小分子化合物必需與大分子的載體[8]楊文軍張麗英李德發(fā),等反相高效液相色譜法測定飼料蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。但OLA本身并沒(méi)中唾乙醇的含量[門(mén).中國獸藥雜志,2003,37(2):20-23有合適的活性功能基團可直接連接到載體蛋白9 Miao x s. Raymond E M, Chris D M. A tandem mass上,必須先將其羥基轉換成羧基才能與載體蛋白spectrometric study of the N-oxides, quinoline N-oxidescarbadox, and olaquindox, carried out at high mass accura-偶聯(lián)。對比文獻[13]描述的方法,優(yōu)化試驗條件,cy using electrospray ionization[J]. International Journal of將反應溶劑吡啶更換為DMSO,降低控制溫度,Mass Spectrometry, 2003. 230: 123-13由原來(lái)的125℃降至90℃,這樣使得反應裝置簡(jiǎn)10] vanpoucke, keyser, Baltusnikiene A,ea. Liquid單化,只在旋轉蒸發(fā)儀上便可完成;反應時(shí)間由hromatographic-tandem mass spectrometric detection ofh縮短至1h;避免了吡啶的難聞氣味和對身體的banned antibacterial growth promoters in animal feed[j].Analytica Chimica Acta. 2003, 483: 99-109損害同時(shí)產(chǎn)率從702g/kg提高到823g/kg。對[]楊文軍,張麗英,賀平麗等.高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測于含羧基的半抗原,其人工抗原的合成常采用混定飼料中喳乙醇[J.中國飼料,2006(20):33-36.合酸酐法活潑酯法或碳二亞胺法。采用活潑12]吳永寧,邵兵沈建忠,等獸藥殘留檢測與監控技術(shù)[M酯法,并和混合酸酐法進(jìn)行對比,結果表明,活潑北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007,621-645酯法比混合酸酐法的免疫效果更佳,故將選用活[13]朱學(xué)加陳金蘭,何計國.疃乙醇人工抗原的合成及鑒定[J].食品科學(xué)2008,29(5):129-133.潑酯法免疫的小鼠進(jìn)行下一步試驗。[14]楊利國胡少昶,魏平華,等酶免疫測定技術(shù)[M].南京:3.2關(guān)于OLA人工抗原的鑒定南京大學(xué)出版社,1998:252-258.鑒定小分子人工抗原常用的方法有UV、紅[5]郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗技術(shù)[M北京:科學(xué)出版社,外色譜(IR)、 SDS-PAGE、核磁共振碳譜(C13NMR、標記抗原示蹤法等。但人工抗原能否刺160 Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassay激動(dòng)物產(chǎn)生針對半抗原的特異性抗體,是判斷人[17肖理文,袁耀萍,鄙日沫,等四環(huán)素人工抗原的合成與鑒工抗原合成成敗的核心21.小鼠免疫試驗結果定[]].細胞與分子免疫學(xué)雜志,208,24(4):419421顯示,所合成的OLA人工抗原能有效刺激小鼠[8]肖甄磊謝忠良何計國.卡巴氧的代謝物喔啉2駿酸人機體發(fā)生免疫應答,產(chǎn)生針對OLA的特異性抗工忼原的合成及其多克隆抗體的制備[冂].食品科學(xué)體,為抗OLA單克隆抗體的研制及免疫學(xué)分析2008,29(5方法的建立奠定了基礎。[19]張改平,劉宜兵,彩鴻翔,等新霉素人工抗原的合成與鑒[20]洪孝莊,蛋白質(zhì)連接技術(shù)[M]北京:中國醫藥科技出版參考文獻:社,1993:34.[1]林順全飼料中乙醇含量檢測方法的比較研究D]雅安:[21]沈關(guān)心,周汝瞬現代免疫學(xué)實(shí)驗技術(shù)[M].武漢:湖北科四川農業(yè)大學(xué),2004:11技出版社,19[2]鄧云波,段蘇華,陳啟友,嗉乙醇的特性及其合理使用[J湖南裔牧魯醫,2004(1):14-1中國煤化工CNMHG