聚乙二醇誘導雞紅細胞融合條件的優(yōu)化

50生物技術(shù)2011年21(3)1.7 :1.61.5-1.4豐1.3-.2手1.1日1.0拿=0.0.8-0.0010.010.1i01001000Concentrationy=(A-DV(1+(/G)+D:ABCD。STD(Standarda 美國對照:Concentration vg Men...0.94 .0.7015611.6660.9980.910.5971.131.6610088。Plot#2( Sample 2 2091111:Concentration vs Me...0.9607591.2910.99。Plot#3( Sample 3 209111:Concentration vs Mes..0.940.5821 838團6純化的 rhKCF的活性測定與對照品的對比圖Fig.6 The mitogenie activity of purified rKCF compared with control國內外報道的KGF的純化方法大多利用肝素親和層析對測方法的建立將為該因子的進(jìn)一步研究和臨床應用提供良好rhKGF進(jìn)行有效的提純。但是考慮到肝素親和層析介質(zhì)不能基礎。耐受高pH,不適合工業(yè)化生產(chǎn)。我們根據hKGF等電點(diǎn)大于參考文獻:7.而菌體蛋白大多小于7的特點(diǎn)，通過(guò)一步陽(yáng)離子交換層析， [1]erey s. Rubin, Hioyuki Oad, Peul w. Finch, e al. Puifcationn對thKGF和菌體蛋白進(jìn)行有效分離。這樣,不但省去了不適and characteization of a newly idenified growth factor speeifie for epithelial合工業(yè)化生產(chǎn)的肝素親和層析,而且簡(jiǎn)化了純化步驟，提高了cells[ J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,1989, 186 :802 - 806.純化收率,總收率達到了每升發(fā)酵液50mg以上。通過(guò)- -步離[2]harmaprojet數據庫(2011年更新).[3]Dina Ron, DonaldP. Botaro, Paul w. Finch, et al. Expression of bio-子交換層析實(shí)現rhKGF的高效純化還未見(jiàn)報道。KGF的活性專(zhuān)-性比較強,主要限于上皮性細胞,尋找-logically acive recombinant keratinocyte growth factor[J]. The Journal of種專(zhuān)一的、敏感的檢測細胞一直是目前的研究熱點(diǎn)。我們通過(guò)Biologicacl Chemistry ,1993. 4(268) :2948 -2988.篩選,獲得了一種與文獻報道不同國,對rhKGF較為敏感的細[4]安姆根有限公司.角化細胞生長(cháng)因子的純化方法[P].中國:1161380C. 1995 - 10-12.胞-貂肺上皮細胞Mv-1- lu,初步建立了hKGF生物學(xué)活[S]鄧林，劉孝菊，龔守良，等，重組截短型人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子-1性檢測方法。經(jīng)檢測,純化的rhKGF能刺激貂肺上皮細胞Mv的表達及純化[J].吉林大學(xué)學(xué)報,2010 ,36<4) :629 -633.-1 - Lu的增殖,具有顯著(zhù)的促有絲分裂活性,生物學(xué)活性與[6]蔡祥勝.重組截短型人角質(zhì)細胞生長(cháng)因子( rhKGFdesl -23)的克隆美國對照品Kepivance"相當。表達和活性[ D].北京:中國人民解放軍軍事醫學(xué)科學(xué)院,007.本研究建立了一種適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的制備高純度hKGF[7]許莉妍.角質(zhì)細胞生長(cháng)因子(KGF)的表達及其生物學(xué)活性研究和的工藝和有效生物學(xué)活性的檢測方法。該工藝具有表達水平成纖維細胞生長(cháng)因子受體(FCFR)抑制劑穩定轉染篩選模型的建立高、工藝簡(jiǎn)便、回收率高、產(chǎn)物活性高等特點(diǎn)。制備工藝和檢[D].廈門(mén):廈門(mén)大學(xué),2009.聚乙二醇誘導雞紅細胞融合條件的優(yōu)化仇燕,李朝煒,苗芳(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊050018)摘要:目的:探討聚乙二醇誘導雞紅細胞融合最適條件。方法:以雞紅細胞為材料,聚乙二醇為誘導劑，從細胞密度、融合溫度聚乙二醇濃度及反應時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗,并設計3因素3水平的正交實(shí)驗計算細胞融合率。結果:雞紅細胞融合的最佳條件是:細胞密度為2x 10°個(gè)/ml .聚乙二醇濃度為35% ,反應溫度為35"C中國煤化工33. 06%。關(guān)鍵詞:細胞融合;雞紅細胞;聚乙二醇MHCNMHG中圖分類(lèi)號:0813.2文獻標識碼:Adoi : 10.3969/j. issn. 1004 -311X. 2011. 03.074Optimal Condition of PEG - Induced Chicken Red Blood Cells FusionQIU Yan,LI Zhao - wei, MIAO Fang2011年21(3)生物技術(shù)51(College of Biological Science and Engineering, Hebei Univerity of Science and Technology ,hjiachuang 050018 ,China)Abstract:Objective:To find the optimal condition of chicken red blood cells fusion with PEG ( Mw= 4000) as the revulsant. Method:The effects of diferent cell density , fusion temperature, PEG concentration and reaction time on cell fusion rate were studied. Three fac-tors and three levels of orthogonal test were designed to attain the best cell fusion condition. Result: The most appropriate condition forcell fusion was cell density 2 x 10*/ml, 35% PEG, 35 centigrade and 40min. Conclusion: Under this condition, the highest cell fusionrate reached 33. 06%.Key words:cell fusion; chicken red blood clls; PEG細胞融合( cell fusion)又稱(chēng)細胞雜交,是指用人工方法使1.2.2 細胞融合兩個(gè)或兩個(gè)以上的細胞融合成-一個(gè)異核體細胞的現象。細胞采用血球板計數法將已洗滌純化的雞紅血細胞懸浮液稀融合技術(shù)一方面為脊椎動(dòng)物肌生成.炎癥反應"、抑制腫瘤[2)釋成不同的密度,取1ml細胞懸液于離心管,放人水浴鍋中預及基因定位['等理論領(lǐng)域研究提供有力的手段;另-方面也熱,同時(shí)將不同濃度 PEG溶液放人水浴鍋中預熱。待溫度恒是制備單克隆細胞株及動(dòng)植物遠緣雜交育種方面的重要技定后 ,在1ml細胞懸液中慢慢逐滴加入0.5ml PEG溶液(慢慢術(shù)。依據融合過(guò)程采用的助溶劑的不同,細胞融合可分為:①沿離心管壁流~下融合劑)，且邊加邊搖勻,然后放人不同溫度生物法:病毒誘導的細胞融合,如仙臺病毒;②化學(xué)法:化學(xué)因水浴鍋中。 細胞融合- -段時(shí)間后 ,加入GKN溶液至8ml,靜止子誘導的細胞融合,如聚乙二醇( PEG) ;③物理法:激光、電脈于水浴鍋中20min左右。取出離心管,2 000r/min離心3min,沖誘導的細胞融合。中PEC介導細胞融合法是最簡(jiǎn)單最常使 細胞完全沉降。棄去上清液，加入GKN溶液至8ml,再離心用的方法,由于操作簡(jiǎn)便,不需復雜儀器,融合效果好(4.)等優(yōu)1次。染色棄去上清液,用手指輕彈底壁使沉淀松散,加入少點(diǎn)成為本科生細胞生物學(xué)實(shí)驗課中的首選方法。傳統教材中量GKN溶液,混勻,取少量懸液于載玻片上,加入Janus green的融合條件為:細胞濃度常選用2x 10個(gè)/ml,融合條件為B 染液,用牙簽攪勻,染色3min后蓋上蓋玻片,觀(guān)察細胞融合30心,50% PEC( MW = 40)介導反應10 ~ 15minloi。但在該情況。實(shí)驗條件下細胞融合率較低,計數困難。為此,本實(shí)驗在單因1.2.3 單因素實(shí)驗素試驗的基礎上設計正交試驗對融合率進(jìn)行了全面系統比1.2.3. 1不同細胞密 度對融合率的影響較,以?xún)?yōu)化PEC介導細胞融合的反應條件。將10%細胞懸液(經(jīng)血球計數器計數此細胞懸液密度為1材料與方法.2x10個(gè)/ml)分別稀釋10倍、20倍.40倍和100倍。1ml不1.1 材料.同濃度細胞懸液預熱后,慢慢逐滴加入0. 5ml預熱后的50%1.1.1 實(shí)驗材料PEG溶液(慢慢沿離心管壁流下),且邊加邊搖勻,然后放入.雞全血,市購。30C水浴鍋中20min,余下步驟同1.2.3。1.1.2試劑1.2.3.2不同融合溫度對融合率的影響PEC4000為分析純(25% .35% .50% .75% ) ,美國B(niǎo)iobas-取1.2.3.1中融合率最高的細胞懸液1ml ,將慢慢逐滴加ic公司;Alsever液0. 85%生理鹽水、GKN液Janus green B染人0.5ml預熱后的50% PEG溶液然后放入不同溫度(30C、液。35C、37C、39C )水浴鍋中20min,步驟同上。1.1.3 儀器1.2.3.3不同濃度 PEC對雞血細胞融合率的影響TDL-60B離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));倒置顯微鏡向1ml細胞懸液中慢慢逐滴加入0.5ml不同體積分數(Nikon ELIPSE E200) ;HH -2水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有PEG 溶液(25% .35% .50%、70% )隨后放入35C水浴鍋中反限公司)。應20min,步驟同上。1.2 方法1.2.3.4不同反應時(shí)間對 雞血細胞融合率的影響1.2.1雞血紅細胞懸液的制備1ml雞血細胞懸液加入0. 5ml 35% PEC溶液,35C融合不參照文獻[7]制備雞血與Alsever 液體積比為1:4的懸同時(shí)間(20min .30min .40min、50min、60min)。液,取1ml雞血懸液,加入4ml 0. 85%生理鹽水，混勻平衡后，1.2.4正交實(shí)驗800r/ min離心3min,棄去上清液,再按上述條件離心2次。最在結合上述單因素實(shí)驗的基礎上,對影響細胞融合的各后,棄去上清液,收集離心沉淀的血細胞,加入4mlGKN溶液因素,即PEG濃度融合時(shí)間及融合溫度進(jìn)行三因素三水平正混勻后離心1次。棄去上清液,加GKN液(體積比1:9),制成交實(shí)驗(如表1)。10%細胞懸液。表1_正交設計試驗的因素與水平ab. |中國煤化工收稿日期:2010 -11 -23;修回日期:2011 -03 -18YHCNMHGin)融合溫度(C)資助項目:河北科技大學(xué)理工學(xué)院教研項目(2009Y05) ;河北科技大學(xué)教研項目(2009 - YB010)資助30作者簡(jiǎn)介:仇燕( 1977 -),女,河北井陘人,博士,副教授,研究方向:細240胞生物學(xué)與分子生物學(xué)，發(fā)表論文20篇, Tel:0311 - 88632198 , Email:5037qiuyan77@ yahoo,. comn. cn。52生物技術(shù)2011年21(3)1.2.5融合率的計算范圍內的實(shí)驗結果,見(jiàn)圖2A。由圖2A可知.細胞融合率隨細每組反應條件制備3張裝片,每張涂片隨機選取3個(gè)視胞密度的增大而增高,10%細胞懸液稀釋10倍時(shí)即細胞密度野分別置于40倍顯微鏡中,計數其中已發(fā)生融合的細胞核及為2x10*個(gè)/ml細胞完整，相鄰及融合的最多,融合率達未融合細胞核數,求平均值,計算融合率(81。10. 3% ,而10%細胞懸液用于融合反應時(shí).細胞密度過(guò)大,無(wú)融合率=視野內發(fā)生融合的細胞核總數/視野內所有細法計數(結果未列出)。因此將2 x 10個(gè)/ml作為融合最佳細胞核總數x 100%胞密度。2結果與分析2.2.2融合溫度對融合率的影響2.1雞 血細胞融合過(guò)程的觀(guān)察由圖2B可知,細胞融合率隨著(zhù)反應溫度的升高而增加，顯微鏡下可見(jiàn)細胞融合過(guò)程中兩個(gè)細胞逐漸靠近(圖37C時(shí)細胞融合率最高達 20.15% ,并發(fā)現有少量細胞的細胞1A) ;兩個(gè)細胞的細胞膜接觸.粘連;接觸點(diǎn)可能由于脂類(lèi)分子膜破裂,可能是由于隨著(zhù)溫度升高,膜流動(dòng)性加快,有利于細發(fā)生疏散使得細胞膜破潰(圖IB) ;兩個(gè)細胞的細胞質(zhì)相互溝胞融合的進(jìn)行。但溫度過(guò)高時(shí),容易造成細胞膜的破損且融通,形成細胞質(zhì)通道,細胞內物質(zhì)通過(guò)這種通道得到轉移,兩合率下降，故將35C作為最適反應溫度。2.2.3 PEG 濃度對個(gè)細胞連成一體(圖1C)。融合率的影響2.2 單因素試驗PEG具有一定的毒性,且其濃度越大對細胞的毒性越大，2.2.1細胞密度對融合 率的影響極大地影響融合率和融合后細胞的存活率。由圖2C可知,融細胞密度是影響細胞融合的重要因素之一。PEG 濃度為合率隨PEC的濃度增加而升高,PEG濃度為35%時(shí)融合率最50% .30C下融合反應20min,細胞密度在(2 - 20) x 10'個(gè)/ml高,因此,PEG的體積分數- -般在25% ~ 50%較適宜。圖1細胞融合過(guò)程Fig. 1 The process of chicken red blood cells fusion25「B鼻8-信15￥86g 102↑下s052030353739細胞密度(x 10個(gè)/ml)融合溫度(C)cell density( x 10cel/mL)fusion temperature(C)信30c30「I; 25畫(huà)昌2:三215署號1010川員官s中國煤化工2535075MHCNMHG.PEC濃度(%)PEC concentratin(%)fusion time(min)日2 細胞密度(A)、融合溫度(B)、EC濃度(C)、融合時(shí)間(D)對細胞融合率的影響Fig.2 Efets of cell densily (A). fusion temperature (B). PEC concentntion (C) and fusion time (D) on cell fusion rate2011年21(3)生物技術(shù)532.2.4融 合時(shí)間對融合率的影響高對細胞的毒性越大,且PEG濃度過(guò)高時(shí)細胞反應液體環(huán)境由圖2D可知,在一定時(shí)間范圍內融合率隨反應時(shí)間增加粘滯度升高,可能會(huì )阻礙細胞融合。本研究細胞融合的PEG而增加,反應時(shí)間為40min時(shí)融合率最高達28. 36% ,而當反最適濃度為35% ,融合率為26. 78%.明顯高于于李秀蘭等12]1應時(shí)間延長(cháng)為60min時(shí)細胞膜破裂較多,細胞形狀發(fā)生改變，采用的最適濃度為50% PEG時(shí)融合率為20.72%。最適溫度、故反應時(shí)間的適宜范圍在30 ~ 50min。PEG濃度,細胞融合的最適融合時(shí)間為40min,結果與趙詠2.3正交試驗梅']研究結果-致。筆者認為低濃度PEG延長(cháng)融合時(shí)間,可在結合上述單因素實(shí)驗的基礎上,對影響細胞融合的各以取得較好的融合效果,且對細胞損傷較少。前人的報道1.8]因素,即融合溫度、PEG濃度、融合時(shí)間,進(jìn)行三因素三水平正只進(jìn)行了單因素對雞血細胞融合率的影響,本研究系統地進(jìn)交實(shí)驗。正交試驗的結果(見(jiàn)表2)表明,三種考察因素對行了單因素實(shí)驗及正交試驗。通過(guò)正交試驗極差分析確定雞PEG誘導細胞融合效果影響程度不同,計算分析可以得出極紅細胞融合的最佳條件組合為A2B2C2 ,即PEG濃度為35%、差(R)A>C> B,即PEG濃度對雞紅細胞的融合率影響較大，反應溫度為35C下融合40min。在此條件下進(jìn)行了3次平行其次為融合溫度、反應時(shí)間。驗證實(shí)驗,細胞平均融合率為33.06%均高于文獻7.8.12所報表2 1,33 正交試驗及結果分析道融合率。在單因素實(shí)驗結果中發(fā)現，細胞密度為2.0x 10°Tab.2 L3 Orthogonal test and result analyis個(gè)/ml時(shí)細胞融合率達最高,但升高到2.0x 10'個(gè)/ml時(shí),就試驗號B細胞融合率(%)因密度過(guò)高而無(wú)法計數,下一步我們將在A(yíng)2B2C2條件下進(jìn)行1(25%) 1(30min)1(33C)7.5最適細胞密度的探索。2( 40min)2(35C)11.59 .參考文獻:3(50min)3(37C)9.2[1]Clas B. Johansson, Sawsan Youssef, Kassie Koleckar, et al. Extensive2(35%)24. 13fusion of haematopoietic cells with Purkinje neurons in response to chronic216.78infammation[J]. Nature Cell Biology, 2008 ,10:575 -583.322. 39[2]Zhi Hu, Shihui Liu, Xuancheng Mai, et al. Anti - tumor efects of fu-3(50% )7.0sion vaccine prepared by renal cell carcinoma 786 - 0 cell line and periph-14. 28eral blood dendritic cells of healthy volunteers in vitro and in human im-10.53mune reconstituted SCID mice[J]. Cellular Immunology, 2010, 262T8.29%8.63%44.17%(2);112-119.T263.3%42. 65%46.25%[3]Claire Robinsona and Andreas F Kolb. Analysis of mammary speiegene loeus regulation in diferentiated cells derived by somatic cell fusionT:31.81%42. 12%30. 98%[J]. Experimental Cell Research,2009 ,315(3): 508 -522.R35.01%4.02%I5. 27%[4]Anna Piliszck, Jacek A Molinski, Kazimiera Pyniak, et al. Foetal fi-注:TI、T2.T3分別為各因素不同水平含量之和,R為極差。broblasts introduced to cleaving mouse embryos contribute to full - lerm de-velopment[J]. Reproduction ,2007 ,33(1): 207 -218.3討論[5]Elizabeth H. Chen and Eric N. Olson. Unveiling the mechanisms ofPEG對水有極高的親和性,可與水分子借氫鍵結合,產(chǎn)生cell fusion[J]. Science ,2005 ,308: 369 - 373.滲透梯度導致細胞間或囊泡間的聚集。較高濃度時(shí)(40% ~[6]楊漢民細胞生物學(xué)實(shí)驗[M].2版.北京:高等教育出版社,50% ,分子量為4000 ~8000),由PEG產(chǎn)生的高滲透壓破壞1997:109 -110.互相接觸處的細胞膜的磷脂雙分子層,使得細胞間的接觸點(diǎn)[7]趙詠梅，郭云婷,馬蕊，等.PEC介導細胞融合的最適條件探究質(zhì)膜變得不穩定9”,隨后形成-一個(gè)大的雙核或多核融合細胞。[J].西安文理學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2007, 10(3):7 -78.有文獻報道以兔血細胞、鴿血細胞及小鼠血細胞([7.10]為材料，[8]趙彥禹,張艷華,馮照軍.雞紅細胞融合最適條件得探討[J].生物但這些材料成本高,且實(shí)驗效果不佳。筆者也試用小鼠血細磁學(xué),2006,6(1):43 -44.胞為材料,但由于細胞小且無(wú)核,使得判斷融合與否非常困[9]SW Hui, TL Kuhl, YQ Guo, el al. Use of poly( ethylene glycol) t0o難。而雞血紅細胞體積較大且細胞核清晰,易于觀(guān)察與統計control ell aggregation and fusion[ J]. Colloids and Surfaces B: Bioint-融合細胞。erfaces, 1999 ,14: 213 -222.細胞密度決定細胞間發(fā)生融合的有效距離,進(jìn)而影響細[10]中國煤化工作細胞融合材料的可行性胞融合率。通過(guò)比較不同細胞密度對融合率影響，結果得出研究33(3): 244- 245.密度為2x 10*/ml為最適條件。同一時(shí)間下雞血紅細胞融合[1]HC N M H G胞融合條件的正交設計優(yōu)的最適溫度為37C ,膜的流動(dòng)性隨溫度上升而加快,有利于細化[J].生物技術(shù),2009,19( 6):44-45.胞融合的進(jìn)行。但溫度為39C時(shí),細胞膜破裂，融合率降低，[12]李秀蘭,姜日水.聚乙二醇誘導細胞融合影響因素探究[J].菏澤其結果與魯云風(fēng)等["的研究結果-致。PEG 的體積分數越學(xué)院學(xué)報.2007 ,29(5):79 -82..