甘蔗塊固定化酵母的制備及其在蔗汁燃料乙醇生產(chǎn)中的應用

甘蔗塊固定化酵母的制備及其在蔗汁燃料乙醇生產(chǎn)中的應用梁磊1,張遠平2,朱明軍1,梁世中11(華南理工大學(xué)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院廣東廣州,510006)2(廣州甘蔗糖業(yè)研究所廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗室,廣東廣州,510316)摘要以甘蔗塊為載體固定酵母細胞,通過(guò)優(yōu)化載體大小和預處理方式,制備得到性能優(yōu)良的固定化酵母,應用于蔗汁燃料乙醇的生產(chǎn)。研究結果表明,大量酵母細胞固定于甘蔗塊內部空腔以及吸附于甘蔗塊表面;較小的甘蔗莖埉作為固定化載體,乙醇產(chǎn)率增加10%左右;冷凍儲存的甘蔗塊經(jīng)過(guò)解凍、去木質(zhì)素處理后固定酵母以40%的裝壤率發(fā)酵36h,乙醇濃度達99.34g/L,糖利用率為99.23%發(fā)酵效率為93,09%關(guān)鍵詞固定化酵母,甘蔗塊,燃料乙醇固定化細胞發(fā)酵技術(shù)有許多突出的優(yōu)點(diǎn):由于它1.1.1菌種大大增加了細胞濃度,增強了菌體對外部條件如溫度釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)和酸堿度的抵抗能力;縮短了發(fā)酵周期,提高反應器AS2.1190,廣州甘蔗糖業(yè)研究所保藏。單位體積的生物轉化速率;而且由于細胞被固定,減1.1.2培養基少了細胞流失,細胞可長(cháng)時(shí)間反復使用,并有利于產(chǎn)(1)種子培養基(YPD)葡萄糖20g/L,酵母粉物分離等。這為發(fā)酵的連續化和規?；峁┝朔奖?。10g/L,蛋白胨20g/L,121℃滅菌15min目前固定化細胞技術(shù)己經(jīng)在食品工業(yè)、環(huán)境保護、能(2)發(fā)酵培養基:取堆放3d內的新鮮甘蔗(品源開(kāi)發(fā)等方面得到廣泛的應用。酒精酵母細胞固種:0026,廣州甘蔗糖業(yè)研究所湛江甘蔗育種基地提定化大部分采用海藻酸鈉聚乙烯醇(PVA)等包埋供),榨汁過(guò)濾后,121℃滅菌15min,但存在成本較高、固定化過(guò)程較繁瑣且對細胞有(3)甘蔗塊:新鮮的甘蔗莖經(jīng)清洗去皮后,切成塊損傷載體軟化現象等缺點(diǎn)口2.探索新的固定化載體狀,-20℃保存和固定化方式,營(yíng)造更適合細胞生長(cháng)和代謝的環(huán)境是.,2主要儀器設備固定化技術(shù)發(fā)展的方向。各種天然材料,如水果塊、小型甘蔗榨汁機;酒精比重計;SHP-2500型生麩皮去木質(zhì)素的纖維素殘渣,都曾作為固定化載體化培養箱;SGD-I型全自動(dòng)還原糖測定儀;SKY被成功應用于釀酒和乳清發(fā)酵等食品相關(guān)工業(yè)13-5)。2102型搖床;R205210型雙層立式蒸汽壓力消毒器;本文利用甘蔗莖塊中天然的細胞纖維間隙和纖BA2000雙目顯微鏡;血球計數板; HITACHI S維素自身對酵母的吸附作用,有利于酵母吸附并在其300N型電鏡內部生長(cháng)的特點(diǎn)制備固定化酵母并利用其發(fā)酵甘蔗1.3方法汁生產(chǎn)酒精。主要探討了甘蔗塊固定化酵母的制備方法,并對其制備條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳載體大1.3.1甘蔗塊的預處理將甘蔗去皮后切成塊,按5種不同方式處理,第小、材料的預處理方式、酒精發(fā)酵時(shí)固定化酵母的裝填率。研究結果為能源甘蔗燃料乙醇的實(shí)施奠定技1組不做處理;第2組用1%NaOH浸泡4h去木質(zhì)素3,并用磷酸調pH至中性;第3組置于冷凍干燥術(shù)基礎。機中進(jìn)行冷凍干燥;第4組凍融處理;第5組凍融處1材料與方法理后進(jìn)行去木質(zhì)素處理11材料1.3.2固定化酵母的制備取適量處理后甘蔗塊,加入YPD培養基中,滅菌第一作者:博士研究生(張遠平高級工程師為通訊作者)養至對數牛長(cháng)期的酵母種子液,置于30℃“廣東省科技計劃項目(No200B10501003),廣東省科技攻關(guān)項目(No.20064990055)轉速中國煤化工收稿日期:2008-11-24,改回日期:2008-12-161.3.CNMHG將制備好的固定化酵母按照一定接種量(裝填2009 VoL 35 No 2(Total率)接入150mL蔗汁培養基,靜態(tài)發(fā)酵。每2h稱(chēng)量糖利用率/%x初始糖(g)X殘糖(g×100(3)發(fā)酵液的CO2失重情況,直至重量恒定即發(fā)酵結束初始糖(g)發(fā)酵初始時(shí)測定發(fā)酵液中的總糖含量,發(fā)酵結束后測2實(shí)驗結果與分析定發(fā)酵液中的乙醇含量和殘糖量。1.3.4酵母細胞數的測定2.1酵母固定化的電鏡觀(guān)察將10g蔗塊固定化酵母浸入90mL已滅菌的由圖1可知,甘蔗的薄壁細胞、維管束等組織結1/4格氏試劑( Merck, Germany)中,100r/mn振蕩構經(jīng)預處理后,形成很大的空腔(圖1A),有利于大量30min,梯度稀釋后,血球板計數。同樣,分別取1酵母在其內部生長(cháng)素殖(圖1B).同時(shí)大量的酵母細mL固定化酵母發(fā)酵和游離酵母發(fā)酵結東后的發(fā)酵胞被吸附固定于甘蔗塊的表面(圖1C),說(shuō)明蔗塊天液加于99mL已滅菌的1/4格氏試劑中,梯度稀釋然的細胞纖維間隙和纖維素自身對酵母具有良好的后,血球板計數固定化作用,固定化過(guò)程兼具吸附作用和包埋作用的1.3.5酵母固定化情況電鏡觀(guān)察特點(diǎn)1.3.6發(fā)酵液中還原糖的測定切1.3.7發(fā)酵液中乙醇濃度測定B1.3.8CO2生成速率(dCO2/dt)計算CO2生成速率/g·bx重量,(g)=重量-2(g)2(h)圖1甘蔗塊固定化酵母電子顯微鏡照片(1)22載體大小的確定1.3.9酒精發(fā)酵效率的計算將甘蔗去皮后切成長(cháng)度分別為1cm2cm2cm發(fā)酵效率/%酒精度(g)初始糖(g)×殘糖(g)]X0.5×100中空1cm3種大小,按1.3.2方法制備固定化酵母,按1.3.3方法進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗,結果如表1所示1.3.10糖利用率的計算饔1載體大小對固定化酵母酒精發(fā)酵的影響甘蔗莖塊長(cháng)度體積表面積總表面積殘糖濃度乙醇體積分數發(fā)酵效率糖利用率/cm3/cm"(20℃)/%5.3019.90150.21.3711.202.3610.4287.12.0(中空直徑1cm)23.55由表1結果可知,在相同條件下,3種大小甘蔗實(shí)驗。塊發(fā)酵效果比較:2cm中空>1cm>2cm。lcm長(cháng)2.3,1預處理對CO2生成速率的影響蔗塊的乙醇產(chǎn)率比2cm長(cháng)蔗塊增加10%左右,因為小蔗塊的總表面積比大蔗塊增加40%以上,基于營(yíng)一凍融處理對照(無(wú)處理)養吸收和代謝產(chǎn)物擴散因素,在蔗塊內部,酵母集中在靠外表面的一側,大蔗塊中心部分酵母的密度很一凍融+去木質(zhì)素處理低,形成所謂死亡區域所以小蔗塊發(fā)酵乙醇產(chǎn)率較高。將2cm長(cháng)的蔗塊中心部位挖去一直徑為1cm的圓形部分,則可以大大增加甘蔗塊的表面積進(jìn)而0816243244856改善固定化效果。由于2cm中空和1cm發(fā)酵效果發(fā)酵時(shí)間h相差不大,基于制備工藝簡(jiǎn)化原則選取1cm蔗塊作圖2載體材料預處理方式對dCO2/dt的影響為載體。由中國煤化工質(zhì)素處理組CO22.3載體材料預處理生成速CNMHG率達到085g按131方法處理蔗塊按133方法進(jìn)行發(fā)酵h209年第58菊2(總254題)7一2%8預處理方式酒精含量發(fā)牌時(shí)間h圖3載體材料預處理方式對乙醇體積分數的影響圖4載體裝填率對dCO2/dt的影響2.3.2預處理對固定化和發(fā)酵效果的影響由表2可知,在一定范圍內,乙醇體積分數隨固由圖3可知,對載體材料進(jìn)行適當的預處理,將定化酵母裝填率的升高而升高,裝填率為40%時(shí),乙有效提高固定化效果和固定化細胞的催化效能。固醇體積分數達到最高99.34g/L,發(fā)酵效率為930定化細胞個(gè)數和乙醇體積分數由高到低依次為,凍融9%;而當固定化酵母裝填率大于40%時(shí),乙醇得率去木質(zhì)素處理組>去木質(zhì)素處理組>干燥處理組和發(fā)酵效率幾乎保持不變。由此可知,在甘蔗塊固定>凍融處理組>對照組。凍融處理結合去木質(zhì)素處化酵母發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的過(guò)程中,在一定的固理的蔗塊,固定化效果和發(fā)酵效果最好原因可能為定化酵母裝填率以下,發(fā)酵效果受裝填率的影響較凍融處理和去木質(zhì)素處理后蔗塊內部的空腔面積增大,而當裝填率達到一定程度時(shí),固定化酵母的裝填加,而且吸附作用增強,固定化細胞能力提高進(jìn)而改率對發(fā)酵效果的影響不顯著(zhù)。原因可能由于一方面善發(fā)酵效果固定化酵母的裝填率低于一定值時(shí),固定化酵母越2.4載體裝填率的確定多,酵母細胞對于甘蔗汁中的糖分的利用率越充分2.4,1載體裝填率對CO2生成速率的影響因而增加裝填率,有利于乙醇發(fā)酵;另一方面,當發(fā)酵按1.3.3方法,比較不同固定化載體裝填率對過(guò)程中固定化酵母的裝填率大于一定值時(shí),固定化酵CO2生成速率的影響。由圖4可知,發(fā)酵過(guò)程中的母處于飽和狀態(tài),發(fā)酵過(guò)程中的物質(zhì)傳遞受到限制,CO2生成速率隨固定化酵母載體裝填率的升高而升甘蔗汁中的總糖分一定因而繼續提高裝填率對乙醇高發(fā)酵的效果影響較小2.4.2載體裝填量對發(fā)酵效果的影響2載體裝填量對固定化酵母乙醇發(fā)酵的影響裝填率初始糖濃度/g殘糖濃度/g·L1乙醇質(zhì)量濃度/g·L發(fā)酵效率/%糖利用率/%189.702.1989.7198.8430189.7091.241.4693.0999.23189.701.62由表2可知,在一定范圍內,乙醇體積分數隨固因而增加裝填率有利于乙醇發(fā)酵;另一方面當發(fā)酵定化酵母裝填率的升高而升高裝填率為40%時(shí),乙過(guò)程中固定化酵母的裝填率大于一定值時(shí),固定化酵醇質(zhì)量濃度達到最高99.34g/L,發(fā)酵效率為930母處于飽和狀態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的物質(zhì)傳遞受到限制9%;而當固定化酵母裝填率大于40%時(shí),乙醇得率甘蔗汁中的總糖分一定因而繼續提高裝填率對乙醇和發(fā)酵效率幾乎保持不變。由此可知在甘蔗塊固定發(fā)酵的效果影響較小?；湍赴l(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)乙醇的過(guò)程中,在一定的固定化酵母裝填率以下,發(fā)酵效果受裝填率的影響較3結論大,而當裝填率達到一定程度時(shí),固定化酵母的裝填(1)蔗塊可作為固定化酵母的載體用于蔗汁乙醇率對發(fā)酵效果的影響不顯著(zhù)。原因可能由于一方面生中國煤化工固定化酵母的裝填率低于一定值時(shí),固定化酵母越CNMHG響來(lái)看,甘蔗莖塊體多,酵母細胞對于甘蔗汁中的糖分的利用率越充分,積小,總表面積大,發(fā)酵效果較好基于制備工藝簡(jiǎn)化78 2009 Vol 35 No. 2(Total原則采用截面直徑為1cm的蔗塊作為固定化載體。nified spent grains as yeast supports for alcohol production3)從載體的處理方式對發(fā)酵的影響來(lái)看預處 om molasses [. Bioresource Technology,207,98(7)理有利于固定化和發(fā)酵,無(wú)論是CO2生成速率還是1440~1447乙醇體積分數凍融+木質(zhì)素處理的載體固定化效果4 Kourkoutas Y, Xolias V, Kallis M.etal, Cell immobilization on fruit pieces for probiotic additive, fermented較好。milk and lactic acid production[J]. Process Biochemistry.(4)從裝填率對發(fā)酵的影響來(lái)看,一定范圍內裝2005,40:411~416填率越高CO2生成速率也越大,40%裝填率的發(fā)酵5 Plessas P, Bekatorou A. Use of Saccharom yces cerevisia液中乙醇體積分數最高,故選擇40%的裝填率較為Cells Immobilized on Orange Peel as Biocatalyst for Aleo-合適。holic Fermentation[]. Bioresource Technology, 2007, 98,860~8656 L1張超王立高虹,等,固定化細胞應用進(jìn)展[].微生物學(xué)sugarcane pieces as yeast supports for ethanol production雜志,2006,26(4):82~84from sugarcane juice and molasses[J]. Journal of Industri-2 Kiran N Sree, Sridhar M, Venkateswar L Rao. High al-al Microbiology Biotechnology DOI:10.1007/s10295cohol production by repeated batch fermentation using an008-0404-zimmobilized osmotolerant Saccharomyces cerevisiae].7楚杰王德源楊艷張利群等.還原糖測定儀的應用[Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2000山東食品發(fā)酵,2003,4:42~438梁磊張遠平,梁世中,等.高酵母接種量的抑菌特性及其3 Nikolaos Kopsahelis, Nikolaos Agouridis, Argyro Beka在蔗汁生產(chǎn)乙醇中的應用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),20073torou, et al. Comparative study of spent grains and deli(12):1~4Preparation of Immobilization Yeast with Sugarcane andIts application for Alcohol ProductionLiang Lei, Zhang Yuanping, Zhu Mingjun, Liang Shizhong1(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)2( Guangdong Key Laboratory of Sugarcane Improvement and Biorefinery, Guangzhou SugarcaneIndustry Research Institute, Guangzhou 510316, China)aBSTRact A novel catalyst has been prepared with sugarcane as the carrier, in which the carrier shapeand size were optimized and materials pretreatment was investigated. The immobilized yeast was applied toproduce fuel ethanol with sugarcane juice. It has been observed that yeasts can be fixed in the sugarcane car-rier by electron microscope. The fermentation experiments indicated that the ethanol production using immo-bilized yeast with l cm length carrier was about 10% higher than that of with 2 cm length carrier. Frosteddefrosted and delignified, the immobilized sugarcane pieces were added by 40%(/v)in the sugarcane juicefor 36h fermentation, which showed that the yield of ethanol was 99. 34%, the sugar utilization was 99,23%and the fermentation efficiency was 93. 09%.Key words immobilized yeast, sugarcane piece, fuel ethanol中國煤化工CNMHG年35卷2期(總第254期)79