腺苷的合成與應用

Vol. 12,No.19精細與專(zhuān)用化學(xué)品第12卷第19期●12.Fine and Specialty Chemicals2004年10月6日新品介紹腺苷的合成與應用施慶珊*許虹林小平邱玉棠(廣東省微生物研究所,廣東省菌種保藏與應用重點(diǎn)實(shí)驗室,廣東廣州510070)摘要:腺苷是一種重要的醫藥原料,在醫藥工業(yè)中有很多重要的用途。本文介紹了腺苷生產(chǎn)的兩種主要方法,即生物合成法(發(fā)酵法或RNA降解法)和化學(xué)合成法。其中采用糖質(zhì)原料直接發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的成本最低,但在國內此方法尚未完全成熟,國內目前主要仍以化學(xué)合成法為主。此外,還簡(jiǎn)要介紹了腺苷在醫藥工業(yè)方面的應用和市場(chǎng)發(fā)展前景。關(guān)鍵詞:腺苷;生物合成;化學(xué)合成;醫藥原料Synthesis and Application of AdenosineSHI Qing-shan, XU Hong, LIN Xiao-ping, QIU Yu-tang(Guangdong Institute of Microbiology , Guangdong Provincial Key Laboratory ofMicrobial Culture Collection and Application, Guangzhou 510070, China)Abstract: The adenosine is a kind of important pharmaceutical raw materials ，and it is applied in pharmaceutical in-dustry widely. In this paper, two main methods i. e. chemical synthesis and biosynthesis ( by fermentation or by decomposi-tion of ribonucleic acid) for production of adenosine are introduced. Among these methods, cost of the direct fermentationof sugar is the lowest to produce adenosine, but this method has not been tally perfect in China. At present, the produc-tion of adenosine still relies mainly on chemical synthetic method domestically. In addition, the applications of adenosine inmedicine and market prospect are introduced briefly.Key words: adenosine; biosynthesis; chemical synthesis; pharmaceutical raw material腺苷是一種天然存在的遍布人體細胞的內源性法主要有發(fā)酵法和RNA降解法兩種，由于發(fā)酵法生嘌呤核苷,是三磷酸腺苷(ATP)的降解產(chǎn)物。腺苷產(chǎn)腺苷有成本.上的優(yōu)勢,因此是今后腺苷生產(chǎn)的發(fā)以其擴血管作用而被人們所熟知，除具有廣泛的心展方向。本文以腺苷產(chǎn)生菌為例,詳細介紹腺苷的臟效應以及快速顯著(zhù)的冠脈擴張作用外,還具有觸發(fā)酵生產(chǎn)法,同時(shí)簡(jiǎn)要介紹了RNA降解法和化學(xué)合發(fā)或介導缺血預適應、減輕再灌注損傷等心臟保護成法。效應。在美國,腺苷是經(jīng)FDA批準的轉復陣發(fā)性室1理化性質(zhì)上性心動(dòng)過(guò)速(PSVT)的一線(xiàn)藥物,也是經(jīng)FDA批準的用于心臟藥物負荷試驗的兩種藥物之一,已成腺苷(Adenosine)學(xué)名腺嘌呤核苷(9-B-D-Ribo-為急診處理快速性心律失常和藥物負荷試驗的常規furanosyl adenine), 分子式C， H, N,0,分子量用藥。同時(shí),腺苷還是一種重要的醫藥原料,利用腺267. 24,結構式如圖1所示;為含1.5分子水的無(wú)色苷可制成許多藥物如ATP、環(huán)腺苷酸、阿糖腺苷等。針狀結晶,于100C真空處理失去結晶水。有微咸自從1909年首次從苦味酸鹽中提取出腺苷后，苦味,易溶于水,幾乎不溶于醇和醚,易為稀無(wú)機酸其合成和應用就得到了廣泛的研究。腺苷的合成總水解得到腺嘌呤和D-核糖,熔點(diǎn)234 ~ 235C,比旋的來(lái)說(shuō)可分為生物合成法和化學(xué)合成法,生物合成度[a125-61011 0水). nK3.5(堿性基團)，中國煤化工THCNMHG*收稿日期: 2004-07-21基金項目:廣東省科技攻關(guān)項目腺苷產(chǎn)生菌選育及發(fā)酵工藝研究(項目編號2002C1040103)資助。作者簡(jiǎn)介:施慶珊(1966- ),男,副研究員,從事工業(yè)微生物菌種選育及發(fā)酵工藝的研究和開(kāi)發(fā)工作。2004年10月6日施慶珊,等:腺苷的合成與應用●13●12.5 (酸性基團)。有紫外吸收，紫外吸收數據見(jiàn)活化培養基(g/L):葡萄糖20,尿素4,玉米漿6,蛋表1。白胨10,酵母膏10,鳥(niǎo)嘌呤0.025,pH7.0;發(fā)酵培養NH基(g/L):葡萄糖120,玉米漿12,藥用酵母粉18,硫酸銨10,磷酸二氫鉀1,硫酸鎂1,pH7.0。HO-(3)發(fā)酵工藝、菌種在保 藏培養基培養24h后,接入裝有20mL液體活化培養基的500mL三角0H 0H瓶(0. 07MPa滅菌10min)中,32C于往復式搖床(振圖1腺苷的化學(xué)結構幅72cm、頻率100r/m)振動(dòng)培養15h。液體種子按5%接種量接入裝有20mL發(fā)酵培養基的500mL三表1腺苷紫外吸收數據角瓶(0.1MPa滅菌15min)中,32 ~ 36C于往復式搖H1.2床(振幅76cm、 頻率100~ 120r/m) 振動(dòng)培養72 ~λ最大/mm25726096h,同時(shí),在發(fā)酵至4~6h時(shí),用16%(v/v)氨水&最大x10-314. 9g260 x 10-314. 3調節發(fā)酵液pH至7.0,發(fā)酵至12 ~60h時(shí),用16%λ小/nm230227(v/v)氨水調節發(fā)酵液pH至6.0。發(fā)酵結束后,產(chǎn)0. 840. 78物可用離子交換樹(shù)脂或用超濾膜提取。用此方法進(jìn)As20/A2600.220.14A20/A260 .0.030行發(fā)酵,腺苷最大生成量可達18g/L。2.2 RNA 降解法RNA(核糖核酸)是生命存在的物質(zhì)基礎,幾乎2生物合成所有的生物體內都含有RNA(某些病毒除外),從微2.1 發(fā)酵法生物中提取RNA是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法。1937年,Hemut等[")報道了通過(guò)發(fā)酵得到核苷-些最常見(jiàn)的微生物菌體中含有豐富的核酸資源，酸,再進(jìn)行酶解得到腺苷;1954年,John等12)用腺嘌如啤酒酵母、紙漿酵母、石油酵母、糖蜜培養的面包呤和肌苷通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵,用游離細胞法得到了酵母、綜合利用生產(chǎn)的白地霉、抗菌素(如青霉素)腺苷;1965年,奧村(3)用芽孢桿菌為產(chǎn)生菌進(jìn)行腺菌絲體等。在較系統篩選的某些酵母菌(所謂的高苷發(fā)酵,生成量為1.1g/L ;1968年,小西真八等(4)核酸酵母)如白假絲酵母(Candidautili)、啤酒酵母使用枯草桿菌的異亮氨酸缺陷型在含有異亮氨酸(Sarcharomyces Cereisiae) ,以糖蜜和醋酸為碳源，培0.03%的培養基中積累1. 26g/L的腺苷(最高可達養過(guò)程中加入氣化鋁或硫酸鋁,pH控制在4.5,菌2.45g/L);1976年,中山清']用耐2-氟腺嘌呤的產(chǎn)體RNA含量可高達16%以上。氨短桿菌ATCC21709在適當的培養基中振蕩培養RNA降解法生產(chǎn)腺苷主要包括幾個(gè)步驟:96h,腺苷生成量為2. 1g/L;1986年,美國的Howaird(1)RNA粗品的制備培養好的 菌體離心收集ML等l6)用酵母菌進(jìn)行腺苷發(fā)酵的研究,產(chǎn)量小于后,用10%干菌體、10%NaCl、90~100C高溫抽提,5g/L;用發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷最成功的是日本的Haneda.抽提液可用超濾分離出RNA,也可用苯酚沉淀蛋白等'),他采用芽孢桿菌P53-18菌株以葡萄糖為原料質(zhì),離心,去沉淀,取上清液用乙醇沉淀,收集沉淀物進(jìn)行發(fā)酵,腺苷最大生成量達16g/L。下面以本研干燥后即得到RNA粗品。究組篩選的腺苷產(chǎn)生菌(芽孢桿菌突變株)為例,詳(2)RNA的酶解RNA0. 5%、酶液(如桔青霉細介紹腺苷的發(fā)酵法生產(chǎn)。酶液)10%(v/v)、pH5、溫度70 ~75C、降解2h,得(1)菌種肌苷產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌CMI-到4種單核苷酸混合物。741(8)為出發(fā)菌株,通過(guò)多因子誘變選育出具有黃(3)核苷酸混合物分離用離子交換樹(shù) 脂分離嘌呤缺陷型、喪失腺嘌呤脫氨酶的腺苷產(chǎn)生菌CMI-出AMI中國煤化工Xn200(Xan^)。YHCNMHG年H為5.0或(2)培養基保藏培養基(g/L):蛋白胨4,牛5.5條件下,5*-AMP回流40h脫去磷酸根得到腺肉膏14,酵母膏7,鳥(niǎo)苷0.05,瓊脂20,pH7.0;液體苷, 產(chǎn)率為80%。精細與專(zhuān)用化學(xué)品第12卷第19期氣-9-<(B-D-2' ,3' ,5'三乙?；秽颂?嘌呤[12);3化學(xué)合成最后氨解步驟同由次黃嘌呤合成腺苷的一樣。3步腺苷的化學(xué)合成方法很多,如:①由2, 8-二氯反應的總收率約為50% ~60%。 合成路線(xiàn)如圖3嘌呤合成腺苷;②由2-甲基硫代腺苷合成腺苷;③所示。由5-胺4-氰基-1-瞇唑_D-核糖呋喃或其衍生物合成OFOH腺苷;④由8-巰基-9-甲基腺嘌呤合成腺苷;⑤由.2' ,3' ,5'三乙?；吸S苷合成腺苷。上述方法起始原料價(jià)格較貴,難以應用于大規模合成中。由于HOH2C、0、 |AeOH2C、0近幾年來(lái),國內肌苷發(fā)酵水平大幅度提高,肌苷生產(chǎn)POCI3成本已下降到5萬(wàn)元/t左右,因此以肌苷為起始原HO OHAcO OAc料進(jìn)行腺苷的合成目前已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段;另CI外,以肌苷為原料合成抗病毒藥物三氮唑核苷( Ribavirin,利巴韋林)時(shí),有大量副產(chǎn)物次黃嘌呤產(chǎn)生,因此,以次黃嘌呤為原料合成腺苷在成本上也是AeOH2C、s可行的。CHgOH-NH，， 腺苷3.1由 次黃瞟呤合成腺苷AcO 0Ac由次黃嘌呤為起始原料合成腺苷時(shí),首先次黃圖3由肌苷合 成腺苷的路線(xiàn)嘌呤與三氯氧磷( POCI,)反應制得6-氯嘌呤,6-氯嘌呤再與四乙酰核糖在特制的催化劑作用下發(fā)生縮4應用與展望合反應(130 ~ 140C),生成縮合物6-氣-9-(B-D-2',腺苷作為藥物，由日本藤澤藥品工業(yè)公司( Fu-3', 5'-三乙?；秽颂?嘌呤,縮合物在0C飽.jisawa)的子公司Lyhomed于1989年首先投人美國和的氨甲醇作用下氨解(100C,氨解10 h。)制得腺市場(chǎng),隨后又在英國、比利時(shí)、法國等多個(gè)國家獲得苷,3步反應的總收率約為45%。合成路線(xiàn)如圖2批準,在美國,目前腺苷的年銷(xiāo)售額約3000萬(wàn)美元。所示(10)。在國內，以腺苷為原料生產(chǎn)腺苷制劑的廠(chǎng)家比較多，0Cl Ac0- \ OAc如沈陽(yáng)光大制藥有限公司生產(chǎn)的腺苷注射液，法國P0C]z .OAc OAc的SamifeWintrp公司曾于1996年在我國申請腺昔注射劑品種的注冊登記。另外,腺苷也是合成其它.核苷類(lèi)藥物的中間體,利用腺苷可制成許多藥物如C嘌呤霉素、高瓜氨基腺苷、賴(lài)氨酰氨基腺苷、琥珀酰-5' -腺苷酸、S-腺苷蛋氨酸、腺苷乙硫氨酸等核苷類(lèi)AcO- pNH,-MeOH腺苷抗菌素,由于它們是肽合成的抑制劑,具有廣譜抑菌OAc 0Ac作用,可用于治療乳腺癌及其他病毒性疾病等()。圖2由次黃嘌呤合成腺苷的路線(xiàn)利用腺苷為原料還可合成阿糖腺苷、單磷酸阿糖腺3.2由肌苷合 成腺苷苷(Ara-Amp)、ATP 、環(huán)腺苷酸等藥物。其中,阿糖20年前,肌苷發(fā)酵水平很低、價(jià)格很高,是由腺腺苷現市場(chǎng)價(jià)60萬(wàn)~80萬(wàn)元/kg,有廣譜的抗DNA苷在亞硝酸作用下脫氨而產(chǎn)生的;而現在情況相反，病毒、RNA病毒活性,用于抗單純皰疹病毒HSV-1是以肌苷為起始原料合成腺苷,合成過(guò)程主要包括和HSV-2;本品的單磷酸酯(單磷酸阿糖腺苷)有抑?；然桶苯?個(gè)步驟。?；饕菫榱吮Ｗo中國煤化工于治療肝癌;環(huán)腺核糖上的3個(gè)羥基,-般用肌苷與醋酐-冰醋酸進(jìn)行營(yíng)酸YHCNMH包分化、癌變、逆轉.乙?；磻?，制成三乙酰肌苷;然后在三氯甲烷等多種生理生化過(guò)程,具有重要的調節控制作用,是中用氯亞叉進(jìn)行三乙酰肌苷6-羥基的氯化,得到6-一種 效果明顯、毒副作用較小的非強心苷類(lèi)藥物,現2004年10月6日施慶珊,等:腺苷的合成與應用●15.市場(chǎng)價(jià)7萬(wàn)元/kg;ATP(三磷酸腺苷)是生物體內能物8-氯腺苷等,因此,它具有廣闊的市場(chǎng)和發(fā)展前量代謝的重要中間物質(zhì),它作為能量的載體可將分景?？诮獯x所獲得的能量傳遞給合成代謝系統,在生物參考文獻體內的能量交換中,占有中心地位,臨床上可用于治[1] Hellmut B. Adenosine( P]." CE 650 874,1937療心臟病、腦動(dòng)脈硬化及肌肉萎縮等癥,目前市場(chǎng)價(jià)[2]- John 0. Formation of adenosine by ellftee extacts of escherichiacoli[J]. Arch Biochem Biophys, 1954, 48: 483 ~ 484每噸100萬(wàn)元左右,年需要量約為150t。[3)奧村.特許公報24278,1965腺苷原料目前國內的市場(chǎng)價(jià)為60萬(wàn)~70萬(wàn)[4) s Konishi, K Kubota, R Aoki,et al. Amino Acid and Nucleic Acid元/t,采用糖質(zhì)原料直接發(fā)酵生產(chǎn)腺苷成本最低,如1968，18 (15)果發(fā)酵水平達到20g/L以上,提取總收率80%以(5].中山清(協(xié)和發(fā)醇).特許公報15115, 1976上,則生產(chǎn)成本可控制在10萬(wàn)元/t以下。與日本旭( 6] Howard M, Laten. Production of adenosine by mutants derived fromyest[J]. Journal of Bacteriology，1986 , 168(3):763 ~ 768化成公司相比,國內發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷起步較晚，目前[7] K Haneda, A Hirano, R Kodaina, et al. Accumulation of nucleie有2 ~3家研究單位進(jìn)行研究,技術(shù)尚未完全成熟,工acid-related substances by microorganisms part I. Production of a.業(yè)上還未采用,但本研究組目前已取得比較好的進(jìn)denosine by mutants derived from bacillus sp[J]. Amino Acid and展,相信不久就可用于工業(yè)生產(chǎn)中;采用化學(xué)合成生Nucleic Aeid, 1972 ,25 :106 ~ 112產(chǎn)腺苷的生產(chǎn)成本為35萬(wàn)~40萬(wàn)元/t左右,目前[8]邱玉棠,施慶珊,李崇,等.0Cor射線(xiàn)輻照選育肌苷高產(chǎn)菌株MI.-41的研究[]].核農學(xué)報，1995 ,9(3);175 ~179.仍是國內生產(chǎn)腺苷的主要方法,廣東肇慶、山東明水[9] Akira T. Preparation of nuclesides by the hydrolysis of 5' -nucle-等地的藥物就是采用肌苷為原料生產(chǎn)腺苷;RNA降tides (J]. Yakugaku Zssh,1965,85 (7) : 658 ~ 661解法曾經(jīng)是生產(chǎn)腺苷的主要方法,以前福建莆田廣[10]楊西寧,董春紅,榮桂榮.腺苷的合成新工藝研究[J].精細化東湛江?？诘鹊氐墓S(chǎng)曾用此法生產(chǎn)腺苷,但因為工,2001, 18 (6) :317 ~318RNA產(chǎn)量有限，成本太高,目前基本不采用此法。[11]周濤、三氮唑核苷合成工藝的改進(jìn)[J].中國藥物化學(xué)雜志，1996, 27.(2) : 133-135.國內腺苷的年需要量為300t左右。腺苷本身是一種心血管藥物,又是其它核苷類(lèi)([12]周樂(lè ),史遠剛,王建辰.6.氣-B-D.呋喃 核糖嘌呤的合成[J].化學(xué)通報,1996 ,5:31 ~32藥物合成的前體,隨著(zhù)腺苷下游研發(fā)工作的深入,一([13]R.J蘇哈道尼克著(zhù).核苷類(lèi)抗菌索[M]_北京:科學(xué)出版社，些新的用途還在不斷開(kāi)發(fā)出來(lái),如治療惡性腫瘤藥1982,1 ~153(上接第6頁(yè))要原材料對羥基苯乙酸的優(yōu)勢,又有工業(yè)化技術(shù)水4市場(chǎng)需求、前景預測及發(fā)展趨勢平高的優(yōu)勢,所以該產(chǎn)品有很強的市場(chǎng)競爭力,目前目前皮膚病外用藥品大部分都是甾體激素類(lèi)藥產(chǎn)品供不應求?，F在正積極開(kāi)拓國外市場(chǎng),特別是品，副反應多,不宜長(cháng)期使用;還有一部分銷(xiāo)準字產(chǎn)西歐市場(chǎng),相信該產(chǎn)品定會(huì )有好的發(fā)展前景。品,科技不成熟,療效不確切,市場(chǎng)不穩定。目前該產(chǎn)品的市場(chǎng)參考價(jià)格在80萬(wàn)~90萬(wàn)丁苯羥酸主要用做非甾體抗炎藥,以丁苯羥酸元/t,是個(gè)高附加值的產(chǎn)品,很值得研究和推廣。0為原料藥,制成丁苯羥酸乳膏(國家新藥)已在湖南迪諾制藥和海南三葉制藥有限公司批準生產(chǎn)。該品具有消炎鎮痛作用,外用可在局部組織達到較高濃[1] Xadhad Hoch. 1990,34(3). 212 ~214( Korea)度,而很少進(jìn)入體循環(huán)。適用于濕疹和神經(jīng)性皮炎、(2) Kokai Tokkyo Koho[P]. JP 81 118 004 ,1986接觸性皮炎等皮膚炎癥疾病。(3] Kokai Kokuy([P] JP 8062050 ,1980國內外市場(chǎng)都需求該產(chǎn)品,國內預計每年需求[4]徐燕.丁苯羥酸的合成[J].中國藥物工業(yè)雜志(信息版) ,1995,8:20丁苯羥酸1t左右,隨著(zhù)該藥品的推廣, 需求量還會(huì )[S)李慶中國煤化工，廣東藥學(xué)院學(xué)報，上升,國外需求量較大。中昊宣化公司接到的訂單1999MYHCNMHG中,意大利曾超過(guò)10t,日本曾超過(guò)4t,印度、韓國超[6]科技查新報告201500030丁0苯羥酸新產(chǎn)品新工藝研究過(guò)2t。隨著(zhù)中昊宣化開(kāi)發(fā)該產(chǎn)品的成功,加上有主.[7]中華人民共和國衛生部標準(試行)WS-249(X-214)-96