聚乙二醇單甲醚-聚谷氨酸的合成與表征

生物醫學(xué)工程學(xué)雜志J Biomed eng2006;23(4):786~789聚乙二醇單甲醚一聚谷氨酸的合成與表征杜建張晟張麗芳孫蕊熊成東^彭宇行(中國科學(xué)院成都有機化學(xué)研究所,成都610041)摘要以聚乙二醇單甲醚為原料在溶劑中與萘鉀反應,形成聚乙二醇單甲醚的鉀鹽活性中間體,再與對甲苯磺酰氯反應得到聚乙二醇單甲醚對甲苯磺酸酯,進(jìn)而反應生成氨基聚乙二醇單甲醚,并用此引發(fā)γ芐基-L-谷氨酸N-羧酸酐,生成嵌段共聚物聚乙二醇單甲醚聚芐酯谷氨酸,然后用堿脫去芐酯保護基,得到水溶性的聚乙二醇單甲醚一聚谷氨酸。用紅外光譜,核磁共振,凝膠滲透色譜對聚合物結構進(jìn)行了表征。該嵌段共聚物在藥物控制釋放研究中具有重要的應用價(jià)值關(guān)鍵詞氨基聚乙二醇單甲醚γ芐基-L-谷氨酸N-羧酸酐聚乙二醇單甲醚一聚谷氨酸嵌段共聚物Synthesis and Characterizations of Poly (ethylene glycolblock-poly (glutamateDu Jian Zhang Sheng Zhang Lifang Sun Rui Xiong Chengdong Peng Y uxing(Chengdu Institute of Organic Chemistry, Academia Sinica, Chengdu 610041ChAbstract Amine-terminated poly (ethylene glycol )(PEG) was prepared by two steps. Firstly, potassiumnaphthalene was added to a solution of methoxypolyethylene glycol 5, 000 in benzene until thegreen in half of an hour, then excess tosylchloride was introduced secondly, the conversion of the tosylate into anamine was carried out by Gabriel synthesis. The block copolymer poly (ethylene glycol )-co-poly(y-benzyl L.lutamate ) could be obtained by ring-opening polymerization of y-benzyl-L-glutamate N-carboxy anhydride withamine-terminated PEG as macroinitiator. And the benzyl group could be removed by sodium hydroxide. Theproduct structure was characterized by IR, HNMR, GPC. The cisplatin-loaded micelle was observed bytransmission electron microscope(TEM ). And the block copolymer is expected to be useful as functional materialsincluding carrier systems in drug controlled delivery applications.Key words Amine-terminated PEG Y-Benzyl-L-glutamate N-carboxy Poly (ethylene glycol)-co-poly(glutamate acid) Block copolymer要使用有機溶劑,強力攪拌,和表面活性劑。這就使得那些易失活,不穩定的藥物不可避免的存在失活在聚合物科學(xué)領(lǐng)域,無(wú)論是基礎研究還是應用分解變性的現象。而且這類(lèi)載體往往載藥量較低,原研究,通過(guò)大分子自組裝形成超分子結構的新型功因是藥物與載體之間是靠物理吸附和包裹作用結合能高分子都是研究熱點(diǎn)之一。在這一領(lǐng)域中嵌段共到一起的因此,近年來(lái)人們開(kāi)始對聚醚共聚物的結聚物特別是以聚醚為基礎的嵌段共聚物引起了人構進(jìn)行改性,引入帶有活性基團的水溶性的鏈段,其們的特別關(guān)注。在聚醚與可生物降解高分子共聚材中八料研究得最多的是聚醚與可生物降解聚酯的共聚材物件H中國煤化工迷聚氨基酸兩嵌段共聚CNMHG成方法上進(jìn)行一些創(chuàng )新料,如聚醚一聚乳酸等-3。該共聚物能自組裝成納性探米粒子,但是這種納米粒子在包裹藥物過(guò)程中往往2試劑與儀器國家繆封數資助項目(50273041)聚乙二醇單甲醚(5000),鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽△通訊作者。E-mail:xcd@cioe.ac.cn三聚光氣均購自 Sigma公司;對甲苯磺酰氯用苯將第4期杜建等。聚乙二醇單甲醚一聚谷氨酸的合成與表征787其溶解,石油醚沉淀純化,干燥;四氫呋喃,苯,1,4-氣(過(guò)量10%),在60C下反應,待反應液變清亮后氧六環(huán),石油醚均先經(jīng)過(guò)預干燥,然后用金屬鈉回冷卻至室溫,加大量石油醚沉淀,然后用四呋喃重流脫水,直至二苯甲酮指示劑變?yōu)樗{色蒸岀;N,N-結晶三次,干燥,得白色疏松狀固體,產(chǎn)率57.4%二甲基甲酰胺,三氯甲烷用五氧化二磷干燥η2h,3.3聚乙二醇單甲醚一聚谷氨酸的合成使用前蒸餾;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。 NICOLET3.3.1聚乙二醇單甲醚-聚芐酯谷氨酸兩嵌段共聚200 SXV FT-IR紅外光譜儀,溴化鉀壓片; Varian物的合成將氨基聚乙二醇單甲醚和y芐基L-谷UNITYINOVA-400Hz核磁共振儀,以氘代氯仿為氨酸N-羧酸酐加入預先用氮氣置換過(guò)的干燥反應溶劑; Waters Associates Model alc/GPC244凝瓶中,然后用注射器加入1,4二氧六環(huán)和氯仿的混膠滲透色譜,聚苯乙烯為標樣,四氫呋喃為溶劑。合溶劑(3:2,v/v),使兩種原料的總濃度為5%3實(shí)驗部分(wt/y),在35C下攪拌反應72h后,加入大量甲醇沉淀得白色固體產(chǎn)物,產(chǎn)率63.2%3.1氨基聚乙二醇單甲醚的制備3.3.2聚乙二醇單甲醚-聚芐酯谷氨酸脫保護將3.1.1聚乙二醇單甲醚一對甲苯磺酸酯的制備8乙二醇單甲醚聚芐酯谷氨酸配成5%(wt/)的氯在干燥的充有氮氣的反應瓶中加入聚乙二醇單甲仿溶液,加入過(guò)量的1molL的氬氧化鈉水溶液,在醚和苯,待聚乙二醇單甲醚溶解后,加入適量的萘鉀室溫下攪拌反應30min,然后用鹽酸將溶液pH值直至綠色0.5h不消失,然后加入過(guò)量的對甲苯磺調至中性,分液,得氯仿層和水層,將水層溶液用氯酰氯,室溫反應24h,抽濾除去氯化鉀,用大量乙醚仿萃取3次,然后把萃取液和氯仿層溶液合并,加大沉淀得到初產(chǎn)物。初產(chǎn)物再用乙醇重結晶,真空干量乙醚沉淀,真空干燥,得淺黃色固體,產(chǎn)率53%。燥,得白色固體,產(chǎn)率92.3%。3.1.2聚乙二醇單甲醚一鄰苯二甲酰亞胺的制備4結果把聚乙二醇單甲醚一對甲苯磺酸酯溶于N,N-二4.1氨基聚乙二醇單甲醚的制備甲基甲酰胺,加入過(guò)量的鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽,4.1.Ⅰ聚乙二醇單甲醚一對甲苯磺酸酯的制備120℃,氮氣保護攪拌反應3h,冷卻到室溫,過(guò)濾掉從其氫核化學(xué)位移上看,δ=4.18ppm為對甲苯磺未反應的鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽,乙醚沉淀,真空干燥酸酯基旁亞甲基的質(zhì)子位移,δ=7.81ppm和δ=得白色固體,產(chǎn)率94.5%8ppm均為對甲苯磺酸酯基苯環(huán)上質(zhì)子的化學(xué)3.1.3氨基聚乙二醇單甲醚的制備將聚乙二醇位移,說(shuō)明羥基已轉化為對甲苯磺酸酯,其羥基轉化單甲醚一鄰苯二甲酰亞胺溶于無(wú)水乙醇,加入過(guò)量率為97.5%。把原料聚乙二醇單甲醚和產(chǎn)品聚乙二的水合肼,回流反應4h,冷卻至室溫,大量乙醚沉醇單甲醚一對甲苯磺酸酯做凝膠滲透色譜分析,其淀,抽濾得固體產(chǎn)物。然后將產(chǎn)物溶于水,用氯仿萃數均分子量分別為3385和4002,分子量分布為取3次,萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥1d,待氯仿液清1.06和1.05,該結果證實(shí)了在反應過(guò)程中分子主鏈亮后,濾掉硫酸鈉,濾液用大量乙醚沉淀得到產(chǎn)物,基本沒(méi)有發(fā)生變化將其用乙醇重結晶3次,真空干燥,得白色固體產(chǎn)4.1.2聚乙二醇單甲醚一鄰苯二甲酰亞胺的制備物,產(chǎn)率82.5%其核磁共振譜顯示:δ(CH2OTs)=4.18ppm消3.2y芐基-L-谷氨酸-N-羧酸酐的合成失,取而代之的是鄰苯基二甲酰亞胺旁亞甲基的化3.2.1γ-芐基-L.谷氨酸的合成在單頸圓底燒瓶學(xué)位移δ=5.20ppm,另外,苯環(huán)的質(zhì)子位移也由δ中加入L-谷氨酸,苯甲醇(比L-谷氨酸稍過(guò)量)和7.81ppm和δ=7.38ppm轉移至δ=7.92ppm60%的硫酸(與L-谷氨酸等量),在π0℃減壓脫水和δ-7.η1ppm,這說(shuō)眀對甲苯磺酸酯已轉化成為情況下反應5h,然后將反應物慢慢倒入內含碳酸鄰中國煤化工氫鈉的冷水中,不斷攪拌,直到無(wú)氣泡產(chǎn)生為止,在4.CNMHG謎謎的制備在其氫核化低溫下使其結晶,將析出晶體過(guò)濾收集,用水和乙酸學(xué)位移屮:屬」鄰苯晝二中酰亞胺全部都消失了,并乙酯各洗3次,干燥后得白色固體,產(chǎn)率55.9%且在δ=3.18ppm處出現一個(gè)新峰,它歸屬于氨基3.2.2γ芐基-L谷氨酸N-羧酸酐的合成將γ-旁亞甲基的化學(xué)位移。紅外光譜上也可發(fā)現苯環(huán)與芐基1谷氰秀氫呋喃加入到預先用氮氣置換酰膠的特征峰都已消失,證明已經(jīng)生成氨基聚乙過(guò)的干燥瓶中,繼續加氮氣保護,攪拌,加入三聚光醇單甲醚了。羥基的轉化率為93.6%。經(jīng)凝膠滲透788生物醫學(xué)工程學(xué)雜志第23卷色譜分析氨基聚乙二醇單甲醚的數均分子量為ppm,δccH=5.12ppm)均已消失,而肽鏈上氫3360,分子量分布1.08,其結果證實(shí)經(jīng)過(guò)一系列反原子的吸收雖然積分面積略有縮小,但變化不大;而應后,聚合物分子量基本未發(fā)生變化且凝膠滲透色譜上仍然只有一個(gè)單峰,所測得的分4.2聚乙二醇單甲醚聚芐酯谷氨酸兩嵌段共聚物子量與理論上脫保護后的分子量相差不大,這些均的合成表明芐酯保護基已成功被脫除且聚合物主鏈基本保從聚乙二醇單甲醚-聚芐酯谷氨酸的紅外譜圖持穩定。上可看到:1652cm-(u。)和1548cm-1(unNH)處肽鍵的特征峰,1733cm-1的芐酯峰和69cm和746cm-1單取代苯特征吸收峰,以及1111cm(υ。)聚乙二醇單甲醚的特征吸收,這些初步說(shuō)明產(chǎn)物中聚乙二醇單甲醚組分和聚芐酯谷氨酸組分的存在。然后通過(guò)其氫核化學(xué)位移得到證實(shí):聚乙二醇單甲醚重復單元中亞甲基質(zhì)子的特征峰(δ O-CH.CH,o=3.41-3.83ppm),聚谷氨酸鏈段上次甲基氫核的特征峰( (CO-CHR-NH)=4.39ppm),以及芐基苯環(huán)上氫核和亞甲基氫核的化學(xué)位移(δcH7.38pm和6cH2c)=5.12pm),說(shuō)明產(chǎn)物中ppt 8確實(shí)存在聚乙二醇單甲醚和聚芐酯谷氨酸鏈段。最后我們對聚乙二醇單甲醚-聚芐酯谷氨酸進(jìn)行了凝2聚乙二醇單甲醚-聚谷氨酸的氬核化學(xué)位移Fig 2 ' HNMR spectral data of MPEG-PGA膠滲透色譜檢測,結果發(fā)現譜圖上只有一個(gè)對稱(chēng)流出體積峰(基本沒(méi)有低分子量級份出現),且分布較5討論窄,最終證實(shí)了嵌段共聚物生成的事實(shí)。4.3聚乙二醇單甲醚-聚谷氨酸的合成在第一步反應氨基聚乙二醇單甲醚的制備中在紅外譜圖中,酰胺在1652cm-和1549cm我們考慮到羥基的反應活性較低,處在大分子聚乙的特征吸收依然存在,而1733cm-的芐酯峰和690二醇單甲醚鏈端時(shí),其活性不足以引發(fā)N羧酸酐開(kāi)cm-1與746cm-的單取代苯的特征峰都基本消失環(huán)聚合,需要將其轉化為較為活潑的氨基對甲苯磺了,說(shuō)明脫保護成功(見(jiàn)圖1)。酸酯基是一個(gè)很好的離去基團,因而我們把聚乙醇單甲醚一對甲苯磺酸酯用作聚乙二醇單甲醚衍生物的中間體。將聚乙二醇單甲醚轉化為氨基聚乙100醇單甲醚,首先是把其轉化成聚乙二醇單甲醚一對甲苯磺酸酯,這步反應的轉化程度也決定了最終產(chǎn)80物的氨基化程度,因此制備氨基聚乙二醇單甲醚的重點(diǎn)和難點(diǎn)就在于制備定量轉化的聚乙二醇單甲醚對甲苯磺酸酯。聚乙二醇單甲醚一對甲苯磺酸酯一般是在堿的催化下,用聚乙二醇單甲醚和對甲苯磺酰氯反應而得,主要有以下幾種方法。(1)以干燥的聚乙二醇單04000333326662000166613331000甲中國煤化工1在二氯甲烷中,用吡啶做CNMH這種方法,羥基的轉化圖1聚乙二醇單甲醚-聚谷氨酸紅外譜圖率只有80%,且反厘遼中易發(fā)生聚合物鏈的斷Fig 1 IR spectral of MPEG-PGA裂,反應時(shí)間也較長(cháng),產(chǎn)物不易純化。(2)用丁基鋰作為堿催化劑來(lái)制備聚乙二醇單甲醚一對甲苯磺酸聚乙方劈轟醚聚谷氮酸的氫核化學(xué)位移(見(jiàn)酯此法雖然羥基轉化率較高但其成本較高且后圖2)可以看到屬于芐酯氫核的吸收(cH=7.38處理復雜。(3)用氫化鈉做催化劑,雖然聚合物鏈不第4期杜建等。聚乙二醇單甲醚一聚谷氨酸的合成與表征789會(huì )斷裂,但羥基轉化率又不高。copolymer interactions for micelle formation: physicochemica本研究的創(chuàng )新之處在于用有顏色的萘鉀,可根characterization. Journal of Controlled Release, 2001: 75: 249據顏色來(lái)判斷聚乙二醇單甲醚的轉化程度,當逐步Riley T, Stolnik S, Heald CR, et al. Physicochemicaevaluation of nanoparticles assembled from poly (lactic acid加入萘鉀時(shí),若溶液維持30min不變色則證明萘鉀poly (ethylene glycol)(PLA-PEG) block copolymers as drug過(guò)量,在這種情況下,聚乙二醇單甲醚的末端羥基基delivery vehicles. Langmuir, 2001: 17: 3168本完全轉化,這點(diǎn)可從其氫核化學(xué)位移上得到證實(shí)。3 Riley I, Stolnik s, Garnett M,ea. Use of viscoelastic而且本方法反應時(shí)間短,成本低,產(chǎn)率高,操作簡(jiǎn)便measurements for investigating interparticle interactions in接下來(lái)我們進(jìn)行γ芐基--谷氨酸-N-羧酸酐dispersions of micellar- like poly (lactic acid )-poly ( ethylene的合成。谷氨酸是一種含有兩個(gè)羧基的氨基酸,反應4 Nishiyama N, Yokoyama M, Aoyagi T, et al. Preparation and前需先用苯甲醇保護其中一個(gè)羧基,生成γ芐基Lcharacterization of self-assembled polymer-metal complex谷氨酸,然后再與三聚光氣反應制得γ芐基-L-谷氨micelle from cis-dichlorodiammineplatinum II) and poly酸-N-羧酸酐(ethylene glycol )-poly (-aspartic acid) block copolymer in an隨后我們用氨基聚乙二醇單甲醚作為大分子引queous medium. Langmuir, 1999: 1發(fā)劑引發(fā)γ芐基L-谷氨酸N-羧酸酐開(kāi)環(huán)聚合。引Harada A, Kataoka K. Novel polyion complex micellesentrapping enzyme molecules in the core: preparation of發(fā)劑中端氨基的N上有未共用電子對,因此具有親lysozyme and poly (ethylene核性,可通過(guò)親核加成引發(fā)鏈增長(cháng)生成嵌段共聚物。glycol )-poly(aspartic acid block copolymer in aqueous mediu最后脫去聚乙二醇單甲醚-聚芐酯谷氨酸的芐Macromolecules, 1998: 31:288酯保護基,即得到側鏈含有羧基的聚乙二醇單甲醚6 Zhou SB, Deng XM. In vitro degradation characteristics ofere聚谷氨酸。一般的芐酯脫除常使用鈀碳催化氫化的human serum albumin. Reactive and Functional Polyme方法,但我們在實(shí)驗中發(fā)現:由于鈀碳會(huì )對聚合物產(chǎn)生較強烈的吸附作用,會(huì )導致分離困難,產(chǎn)率低?？? Kataoka K, Ishihara A, Harada a,eta. Effect of the慮到聚氨基酸鏈節中酰胺的穩定性較芐酯強的secondary structure of poly L-lysine segments on th多,我們采取了堿性條件下室溫短時(shí)間處理共聚micellization in aqueous milieu of poly (ethylene glycol)-poly (L物的方法hydrocinnamyl group at the N-position. Macromolecules至此我們成功地合成了水溶性的聚乙二醇單甲醚一聚谷氨酸嵌段共聚物。當這種聚合物的水溶液8 Yuan MI,ⅹ Kiong CD, Deng XM. New sythesis of PEG-OTs與溶于水的藥物相混合時(shí),由于有羧基存在,能通過(guò)N98124012.7,1998袁明龍,熊成東,鄧先模.聚醚對甲苯磺靜電吸附、氫鍵等弱的作用力與藥物結合,從而提高酸酯的合成新方法CN9812載藥量。因此該嵌段共聚物在藥物控制釋放研究中(收稿:2004-03-25修回:2004-06-16)具有重要的應用價(jià)值。參考文獻1 Go vender T, Stolnik S, Xiong CD, et al. Drug-polyionic block中國煤化工CNMHG