乙醇生產(chǎn)酵母菌的選育

現代食品科技Modern Food Science and Technology008,vo24,No6乙醇生產(chǎn)酵母菌的選育楊登峰,關(guān)妮,米慧芝,陸崎,肖代俊,黃日波(廣西科學(xué)院工業(yè)微生物技術(shù)研究中心,廣西南寧530003)摘要:巴西然料乙醇取得巨大成功,原油價(jià)格的不斷攀升,以及糖價(jià)的下跌,以甘蔗為原料的燃料乙醇已經(jīng)向世人展現出良好的市場(chǎng)潛力.但目前我國國內還尚未見(jiàn)到甘蔗汁乙醇的研究,作為一項儲備技術(shù),對甘蔗汁乙醇技術(shù)的研究具有十分重要的意義。本文對商業(yè)化和實(shí)驗宣篩選的多株酵母發(fā)酵甘蔗汁能力進(jìn)行了研究.結果表明:s酵母生長(cháng)速度較快,εw酵母產(chǎn)酒率較高,εw酵母死亡率較低。綜上,sy酵母和gw2酵母更適合于甘蔗汁發(fā)酵酒精的生產(chǎn)關(guān)鍵詞:乙醇;酵母;甘藻汁;發(fā)酵中圖分類(lèi)號:TQ926;文獻標識碼:A;文章篇號:16739078(2008)06050603Breeding of a High ethanol-producing Yeast StrainYANG Deng-feng, GUAN Ni, MI Hui-zhL, LU Qi, XIAO Dai-jun, HUANG Ri-boIndustrial Biotechnology Research Center, GuangXi Academy of Sciences, Nanning 530003, China)Abstract: The production of ethanol by sugarcane juice fermentation had great meaning to the development of our economy due to therising oil price and lower sugar price. In this paper, a high ethanol-producing strain was screened from several yeasts. Two yeast(gw2 and sywere found to be suitable for the ethonal production via sugarcane juice fermentation for their higher ethanol-producing capabilities and lowermortality rateKey words: ethanol; yeast; sugarcane juice; fermentation國際油價(jià)飛速上漲,屢創(chuàng )新高,這對以石油為主準正式公布。2003年,我國燃料乙醇年產(chǎn)僅有7萬(wàn)噸,要能源進(jìn)行生產(chǎn)消費的各個(gè)國家無(wú)疑帶來(lái)巨大的影至2006年,已達到年產(chǎn)100多萬(wàn)噸,專(zhuān)家預計2010響。引發(fā)油價(jià)上漲有許多種原因,然而這種情況導致年乙醇產(chǎn)能有望達到700萬(wàn)噸,我國已迅速成為僅次國際社會(huì )對能源問(wèn)題更加關(guān)注、重視,并積極開(kāi)展替于巴西和美國的全球第三大燃料乙醇生產(chǎn)國代能源、可再生能源的研究和開(kāi)發(fā),已經(jīng)是迫在眉睫以糖質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇,一直由于高昂的原料的當務(wù)之急。成本,而被人們所忽視。廣西作為全國最大的蔗糖生燃料乙醇的生產(chǎn)與使用在國際上已有多年,巴西產(chǎn)基地,年產(chǎn)蔗糖占全國總量的60%以上,甘蔗的種是世界上最大的燃料乙醇生產(chǎn)國和消費國之一。到植面積達83.84萬(wàn)公頃,甘蔗產(chǎn)量5925萬(wàn)t。然而,2006年,巴西的燃料乙醇產(chǎn)量已達到170億升,其主在廣西乃至國內尚未見(jiàn)以甘蔗汁為原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料要原料為甘蔗及其副產(chǎn)物,占甘蔗總產(chǎn)量的50%。乙醇的研究報道。甘蔗乙醇作為一項儲備技術(shù),非常美國則是近年來(lái)燃料乙醇發(fā)展速度最快的國家。從有必要進(jìn)行研究。2000年到2006年的7年里,燃料乙醇產(chǎn)量從16億加本實(shí)驗以目前商品化的高溫活性干酵母、市面上侖增加到49億加侖,增加幅度超過(guò)3倍。隨著(zhù)世界能常用的釀酒酵母和本實(shí)驗室自行篩選的高溫酵母為出源危機的日益突出,美、巴、英、日、加、澳、印等發(fā)菌株,以甘蔗汁為原料進(jìn)行單批次的酒精發(fā)酵。在國家都制定發(fā)展本國的燃料乙醇計劃。燃料乙醇已成發(fā)酵過(guò)程中,研究了酒精發(fā)酵和酵母生長(cháng)的各種參數,為世界各國發(fā)展再生能源的潮流,其發(fā)展空間巨大。其中包括酵母的生長(cháng)速率、產(chǎn)酒率和死亡率等。通過(guò)我國在2000年啟動(dòng)燃料乙醇計劃。2001年4月2這些參數的綜合比較,優(yōu)選出適合甘蔗汁發(fā)酵的酵母日,《變性燃料乙醇》和《車(chē)用乙醇汽油》兩項國家標為我們今后利用基因工程手段改造酵母提供優(yōu)良的出收稿日期:200801-16發(fā)菌技支撐計劃資助項目(20007805):桂科攻0a0)關(guān)H中國煤化工燃料乙醇提供相CNMHG作者簡(jiǎn)介:(1979-),男助理研究員,碩士,主要研究方向:微生材料和方法現代食品科技Modern Food Science and Technology008. VoL24, No 61.1材料及菌種新鮮甘蔗汁由廣西農墾集團思源酒業(yè)和廣西農業(yè)2結果與分析科學(xué)院甘蔗研究所惠贈。葡萄糖、硫酸、尿素、磷酸、2.1酵母不同時(shí)期的生長(cháng)速度次甲基藍均購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司,分酒精發(fā)酵是一個(gè)群體的結果,酵母數高必然導致析純。 Yeast extract, tryptone購于 Oxoid公司。高的發(fā)酵速度。因此,酵母的生長(cháng)速度快慢直接關(guān)系安琪釀酒髙活性干酵母購于食品添加劑市場(chǎng),到發(fā)酵速度的快慢gw2為本實(shí)驗室保藏,釀酒酵母sy由廣西農墾集團思酵母的生長(cháng)速度分為在酵母種子液中的生長(cháng)速源酒業(yè)惠贈,釀酒酵母As2116和As2189購于中度和在酵母發(fā)酵液中的生長(cháng)速度。酵母的種子液培養國普通微生物菌種保藏中心基為YPD培養基,因而可以用菌體濃度反映酵母生12主要儀器長(cháng)速度,菌體濃度的測定方法見(jiàn)1.5。通過(guò)測定,結果搖床,pH計,氣相色譜,紫外可見(jiàn)光分光光度如圖1所示,在5株酵母中,sy酵母的菌體濃度在各計,顯微鏡個(gè)時(shí)期基本都是最高的,其余4株酵母基本差別不大。13培養基及培養條件在發(fā)酵24h后,5株酵母基本達到同一個(gè)水平的濃度種子培養基:YPD( Yeast extract10%, stone所以,酵母生長(cháng)速度最快的是sy酵母。酵母發(fā)酵培養20%,葡萄糖20%)?；鶠楦收嶂?由于在甘蔗汁中培養酵母,無(wú)法用分光發(fā)酵培養基:新鮮甘蔗汁。光度計法測定菌體濃度。因此,采用直接計數的方法種子液培養條件(一般酵母):28℃,160rmin;一用細胞數來(lái)衡量酵母的生長(cháng)情況。結果表明,在甘發(fā)酵液培養條件(一般酵母):30℃,120rmin,8h蔗汁中的生長(cháng)情況基本和在YPD中相同,sy酵母的后,靜止。生長(cháng)仍是略快于其它酵母,如圖2所示。種子液培養條件(高溫酵母):30℃,160rmin;發(fā)酵液培養條件(高溫酵母):34℃,120rmi,后,靜止。14發(fā)酵實(shí)驗■安琪從平板上挑取單菌落,接入含有3~5 mL YPD的指形瓶中,過(guò)夜培養。再以1%的接種量,轉接到含◆As2.116100mL發(fā)酵培養基的250mL的錐形瓶中,每隔4h●As2.1189取樣1次,發(fā)酵24h后停止取樣15菌體OD值的測定方法時(shí)間h開(kāi)啟 Beckman DU800紫外一可見(jiàn)光分光光度計,圖15株酵母在YPD中不同時(shí)間的0。值以未接種的YPD培養基為空白對照,4h后取樣品測Fig.I The OD value of different time of five yeasts in YPD其oDω值,為確保其準確性,將數值維持在02-0.8之間。以后每隔4h測1次OD6值,并記下讀數。16菌體細胞直接計數的測定方法菌體細胞數用血球計數板直接計數并計算?！霭茬?7酒精含量的測定方法使用 Agilent6890的氣相色譜儀進(jìn)行測定,測定◆As2.116方法為內標法As2.11891.8死亡率的測定方法采用美藍染色法進(jìn)行測定。取0.1%美藍溶液1滴置載玻片中央,再取稀釋后樣液1滴混合,靜止染色圖25株酵母在甘蔗汁中不同時(shí)間的細胞數3-5min,加蓋玻片,在顯微鏡下(400×)觀(guān)察并計數中國煤化工 me of five yeasts in被染色的酵母細胞數和總細胞數,連續觀(guān)察56個(gè)視野進(jìn)行計算CNMHG死亡率=被染色細胞數總細胞數產(chǎn)酒率是是酵母發(fā)酵能力的主要指標之一,酒度現代食品科技Modern Food Science and Technology2008, vol 24, No6高說(shuō)明酵母發(fā)酵能力強,糖的利用能力強。和24h時(shí)。如表1所示,gw酵母的死亡率較低,同由圖3可以看到,gw2酵母的酒精產(chǎn)量最高,同樣是高溫酵母的安琪酵母也表現出較低的死亡率,這時(shí),幾株酵母均表現出良好的發(fā)酵蔗糖能力。大約在可能和本實(shí)驗采取了較低的溫度有關(guān)。20-23h的時(shí)候,達到酒精的最大產(chǎn)量;在發(fā)酵到25h表15株酵母不同時(shí)間的死亡率后,酒度開(kāi)始回落,說(shuō)明酵母已經(jīng)利用完蔗糖發(fā)酵酒精。在沒(méi)有碳源的情況下,酵母利用酒精為碳源進(jìn)行m“自身營(yíng)養的供給。死亡率%、20h0500001810522.5012.524h1.6014456033.8228.2110.03結論■安琪綜合以上這些因素,sy酵母和gw2酵母比較適合發(fā)酵甘蔗汁生產(chǎn)酒精?！鬉s2.I16●As2.1189參考文獻0.010[1] Andretta M.G. S, Andretta SR, Steckelberg C, et al. Bioeth時(shí)間hanol-Brazil, 30 years of ProalcooU]. Intern Sugar, 2007, 109圖35株酵母不同時(shí)間的酒度(1299:195-200Fig. 3 The alcohol degree of different time of five yeasts[2]夏蕓徐萍江洪波等巴西生物燃料政策及對我國的啟示23死亡率生命科學(xué)2007,19(5):482485酵母的生長(cháng)過(guò)程中,死亡是不可以避免的。但是,[3沈萍范秀容李廣武微生物學(xué)實(shí)驗M高等教育出版社在正常的生產(chǎn)過(guò)程中,死亡率過(guò)高勢必影響到酵母正1998:9092常的酒精發(fā)酵。因此,對死亡率必須進(jìn)行控制。對5[4]張龍翔生化實(shí)驗方法和技術(shù)M北京民教育出版社株酵母發(fā)酵后期的死亡率進(jìn)行了測定,主要是在20h上接第534頁(yè)通過(guò)對尿苷產(chǎn)生菌Tcl42的5罐分批發(fā)酵數據進(jìn)447449行分析,建立了菌體生長(cháng)、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物形成的動(dòng)[ Lin pei-Y嗎 g, Whang Liang-Ming, Wu Yi-Ru, et al力學(xué)模型。利用 MATLAB軟件對菌體濃度、殘糖量、Biological hydrogen production of the genus Clostridium:產(chǎn)物濃度數據進(jìn)行非線(xiàn)性擬合,求解出動(dòng)力學(xué)模型的參數,通過(guò)對所建立模型進(jìn)行F檢驗,結果顯示擬合效International Journal of Hydrogen Energy, 2007, 32(12):1728-果顯著(zhù),此模型和參數可以較好的反映菌株Tcl42的1735菌體生長(cháng)、底物消耗和產(chǎn)物生成的變化規律。[6] Altiok Duygu Tokatli, Figen Harsa, Sebnem. Kinetic mode參考文獻casei (NRRL B-441)[]. Chemical Technology and Biote[l]姚志湘伍時(shí)華陳寧等L亮氨酸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究[hnology2006817:1901197廣西工學(xué)院學(xué)報2003,143).5-l1[7 Carine Bideaux, Sandrine Alfenore, Xavier Cameleyre, et al.[2]程遠超劉康樂(lè )徐慶陽(yáng)尿苷產(chǎn)生菌的選育[門(mén)現代食品科Minimization of Glycerol Production during the High-Performance Fed-Batch Ethanolic Fermentation Process in3]杜連禪工業(yè)微生物實(shí)驗技術(shù)№天津科技技術(shù)出版社,a Metabolic Model asPrediction Too). Appliednvironmental Microbiology,[4 Pratima Bajpai, Argyrios Margaritis. Kinetics of ethanol"V凵中國煤化工production by immobilized Kluyveromyces marxianus cells at [8]CNMHG法測定牌胃康膠囊concentrations of Jerusalem artichoke juice冰日a厘[四中約態(tài)528(1)3536U]Applied Microbiology and Biotechnology, 1987, 26(5)