蛋白的聚乙二醇修飾及其在生物醫學(xué)領(lǐng)域的應用

78Foreign Medial Sciences Section on Phamacy 2001 Apr; 28(2)evaluation of proguanil: a probe phenotyping drug for thePhamacgenetis, 1998, 8(2):129- 135.mephenytoin hydroxylase polymorphism[J]. Br J Clin[20] lbeanu GC, Goldstein JA, Meyer U, et al. Identf-Pharmacol, 1996, 41(3):175- 179.cation of new human CYP2C19 lle(CYP2C19 * 6 and[16] Reidenberg P, Glue P, Banfeld CR, et al. Fflcts of fel-CYP2C19 * 2B) in a Caucasian poor metabolizer 0bamate on the pamacokineties of phenoberbial[J]. Clinmephenytoin[J]. J Phamacol Exp Ther, 1998, 286(3):Pharmacol Ther, 1995, 58(3):279 - 287.1490- 1495.[17] Xie HG, Huang SL, Xu ZH, et al. Evidence for the efet[21] Ibeanu GC, Blaisdell J, FergusonRJ, et al. A noved tran-of gender on activity of ( S )-mephenytoin 4-hydroxylasesversion in the intron 5 donor splice junction of CYP2C19(CYP2C19)in a Chinese population[J]. Phamacogenetics,and a sequence polymorphism in exon3 contribute to the poor1997, 7(2):115- 119.metabolizer phenotype for the anticonvulsant dug S-[18] de Morais SM，Wilkinson CR, Basell J, e al. Identmephenytoin[J]. J Phamacol Exp Ther, 199 290(2):cation of a new genetic defect responsible for the polymor-635- 640.phism of ()-mephenyoin metabolie in Japnee[J]. Mol [22] Xiao zs, Goldsteien JA, Xie HC, eal. Difrenes in thePharmacol, 1994, 46(4):594 - 598.incidence of the CYP2C19 polymophism afecting the S-[19] Ibeanu GC, Blaisdell J, Chanayem BI, et al. An aditinalmephenytoin phenotype in Chinese Han and Bai populatinsdefective llele, CYP2C19* 5, contributes to the S-meph-and infcation of a new rare CYP2C19 mutant alele[J].enytoin poor metabolizer phenotype in Caucasians[J].J Pharmacol Exp Ther, 1997, 281(1):604- 609.蛋白的聚乙二醇修飾及其在生物醫學(xué)領(lǐng)域的應用付春曉綜述(軍事醫學(xué)科學(xué)院野戰輸血研究所，北京100850)摘要:利用聚乙二醇及其衍生物對蛋白類(lèi)生物大分子進(jìn)行化學(xué)修飾,可以克服它們自身的缺點(diǎn)和不足，并賦予它們一些新的特點(diǎn)和功能,從而擴展其在生物醫學(xué)領(lǐng)域的應用。本文綜述了近年來(lái)在這方面的研究進(jìn)展。.關(guān)鍵詞:聚乙二醇;蛋白質(zhì);化學(xué)修飾中圖分類(lèi)號: Q518.4文獻標識碼: A文章編號: 1001-0971(2001)02-0078-04聚乙二醇(polyethylene gycol, PEC)修飾又稱(chēng)分PEG 修飾的目的主要有以下三個(gè)方面:(1)增加穩定子的PEC化(PEClation),是目前分子變構化學(xué)性,延長(cháng)血漿 半衰期; (2)降低免疫原性和抗原性;(molecule altering structural chemistry, MASC) 最重要(3)降低毒副作用。的技術(shù)之一,是用來(lái)解決或緩解蛋白和多肽在藥用1增加穩定性和延長(cháng)血漿半衰期過(guò)程中存在的諸多問(wèn)題的有效途徑。PEG 是由乙二一些以注射方式使用的藥用蛋白,由于在血液醇單體聚合而成的線(xiàn)性高分子材料,分子組成為中存留的時(shí)間過(guò)短,在很大程度上限制了其正常藥HO-CH2-CH2-(-0CH2-CH2-0)n-CH-CH2-0H; PEC 鏈效的發(fā)揮。通過(guò)PEG修飾,一方面增加了分子量,還可以與馬來(lái)酸酐進(jìn)一步共聚形成梳狀的PEG術(shù)降低了腎臟的排泄速率;另-方面,偶聯(lián)的PEG鏈生物,簡(jiǎn)稱(chēng)PM。PEG分子中存在的大量乙氧基能夠在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應,減弱了血液中與水形成氫鍵,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羥基通過(guò)適當方式活化后可與各類(lèi)蛋白分各種” 中國煤化1，從而有效地延長(cháng)了子相偶聯(lián)。由于PEG無(wú)毒,具有良好生物相容性和蛋白TYHCNM H G°血液相容性,使它成為一種被廣泛使用的生物修飾.1" rev診印十皿燦田口血源短缺和血液污染的問(wèn)題日益嚴重,使血液材料。對于各種具有藥用潛能的蛋白來(lái)說(shuō),采用代用品的研究引起了人們的普遍關(guān)注。從牛紅細胞收稿日期2095-12中獲取的無(wú)基質(zhì)血紅蛋白(stroma-free bovine Hb )是國外醫學(xué)藥學(xué)分冊2001 年4月第28 卷第2期79制備載氧型血液代用品的理想材料:它不僅具有來(lái)蛋白轉化為非免疫原性的藥用蛋白,主要是利用無(wú)源豐富和免疫原性低的優(yōu)點(diǎn),而且與人Hb不同,它免疫原性的PEG分子鏈與蛋白表面的可及性基團不需要2,3-二磷酸甘油酸(2,3~DPG,在血管中不存相偶聯(lián),進(jìn)而在蛋白表面形成一道屏障,將暴露的抗在)的調節,僅憑循環(huán)系統中氯離子的調節作用就可原結合 位點(diǎn)屏蔽起來(lái)。分子構型獨特的梳狀PEC獲得滿(mǎn)意的氧親和力,從而實(shí)現向組織有效供氧的具有更強的屏蔽功能,因而在這方面的應用更為普目的。然而,天然的無(wú)基質(zhì)血紅蛋白主要以二聚體遍。的形式存在,輸入后很快就會(huì )被人體清除,造成很大2.1 PEG 修飾L.天冬酰胺酶的腎毒性。通過(guò)PEG與Hb分子進(jìn)行偶聯(lián)可以增大L-天冬酰胺酶(ASNase)具有抗白血病活性,能Hb的分子量,有效延長(cháng)在血管內停留時(shí)間,顯著(zhù)降夠催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸,將其與其他低腎臟排泄的速率[1-3)]。研究結果表明,采用不同化療藥物相結合是治療白血病的一種有效手段。由的方法對其進(jìn)行PEG修飾后, Hb在人體內的半于它在 血液存留時(shí)間短,長(cháng)期接受治療的白血病病衰期可由(3.0+0.1)h增加至(15.0+2.3),(17.4土人需要經(jīng)常 注射。而ASNase是從大腸桿菌中提純1.6)h,甚至(43.2+1.7)h。除此以外,利用PEG修出來(lái)的,在重復注射的條件下容易引發(fā)危險的免疫飾的方法還能降低牛Hb用于人體可能產(chǎn)生的免疫反應。為了保持ASNase在病人血液中的治療水平反應,提高使用安全性。目前,通過(guò)大鼠兔、犬及豬并降低其免疫原性, PEG修飾是一種有效方法”。等動(dòng)物的失血性休克實(shí)驗和等容換血實(shí)驗證實(shí)驗證明,隨著(zhù)PEG構型及分子量的不同，在去除明,PEG-牛Hb是-種安全有效的載氧型血液代用其免疫原性的過(guò)程中對酶活性的影響也不相同;以品。1000 u的線(xiàn)型PEG為修飾劑,當ASNase的免疫活性1.2 PEG修飾超氧化物歧化酶被完全去除(由修飾前的100%降至0%)時(shí),產(chǎn)物可超氧化物歧化酶(SOD)能夠催化氧自由基的歧保留63%的天然酶活性;若采用PM100(100 ku的梳化反應,是機體清除有害氧自由基的重要的酶。.狀PEG),無(wú)免疫活性的修飾產(chǎn)物可保留93%的天SOD對放射性損傷、氧中毒、再灌性損傷以及各種炎然酶活性。在修飾的程度相同時(shí),采用高分子量的癥,尤其是對類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎均具有良好的治療作用。PM100 將有更多的PEC鏈加入到被修飾的蛋白分然而,天然soD的血漿半衰期較短(在小鼠體內為6子中,因而其降低免疫活性的效果較低分子量的min,人體內25 min) ,限制了它的使用。為了彌補這PM13(13 ku的梳狀PEG)要好。這在一定程度上說(shuō)一缺陷,通常采用加大使用劑量的方法;然而不論是明ASNase免疫原性的降低是由PEG鏈屏蔽了酶表天然的還是從rDNA獲取的SOD在大量使用情況下面的抗體結合位點(diǎn)引起的。都有引發(fā)過(guò)敏反應的危險。研究發(fā)現,利用PEG對2.2 PEG修飾牛血清白蛋白SOD進(jìn)行化學(xué)修飾,以增加分子量,是延長(cháng)其血漿存白蛋白是動(dòng)物血漿中大量存在的一種功能蛋留時(shí)間的有效方法[4-6]。經(jīng)高分子量的PEG(41 ~白,對于維持血漿膠體滲透壓,調節血管內外的液體72 ku)修飾后,在較低的修飾度下產(chǎn)物的分子量增平衡具有重要意義,是臨床上- -種用途廣泛、需求量加到200~ 1000 ku。同天然SOD相比,這種高分子巨大的治療試劑。然而昂貴的價(jià)格在很大程度上制量的PEG-SODs保持了90% ~ 100%的酶活性,血漿.約了它的應用。牛血清白蛋白(BSA)具有與人血清保留時(shí)間延長(cháng)至35h左右并表現出更低的免疫原白蛋白相似的結構和功能，是--種很有開(kāi)發(fā)潛能的性。PEG-SODs能夠保持高的酶反應活性可能有以白蛋白代用品,而如何消除其免疫原性是一個(gè)關(guān)鍵下幾個(gè)原因:(1)同SOD反應的底物均為小分子(各問(wèn)題。 研究表明, BSA的PEG化是解決這個(gè)問(wèn)題的種類(lèi)型的氧自由基), PEG修飾雖可在酶的表面形成有效途徑[8]。研究者分別以PM13和PM100對BSA-.定的空間位阻,但并不影響酶同底物的反應;進(jìn)行修中國煤化工法測定了產(chǎn)物免疫(2)SOD表面的活性位點(diǎn)很小,受修飾反應的影響很活性劑時(shí),當修飾度為小。30%,1.HC NMHG參與修飾反應時(shí)，不再能檢測到產(chǎn)物的免疫反應活性;而以PM100為2降低抗原性和免疫原性修飾劑,當修飾度為20%就可達到同樣效果,說(shuō)明通過(guò)PEG修飾來(lái)消除免疫反應活性,將異原性在這方面后者的性能更為優(yōu)越。80Foreign Meldical Sciences Section on Phamacy 2001 Apr; 28(2)3降低毒副作用時(shí)也在一-定程度上限制了藥物向腫瘤組織的擴散, .通過(guò)基因重組技術(shù)獲得的大規模生產(chǎn)的TNF-天然 TNF-a與PEC-TNF-a在藥效上的差異是上述兩a,II-2和IFN-Y等是一類(lèi)很有前途的抗腫瘤新藥。種因素共同作用的最終結果?？偟膩?lái)說(shuō), TNF-a經(jīng).但由于它們的血漿半衰期短,為達到顯著(zhù)的臨床治PEG化處理之后，減少了使用劑量,降低了毒副作療效果不得不加大使用劑量,這就常常引起嚴重的用,促進(jìn)了它作為抗腫瘤藥物的應用11,12]。毒副作用。近年來(lái)發(fā)現,利用PEG修飾技術(shù)對這些蛋白進(jìn)行處理后，能夠大大增加其血漿穩定性,降低4 PEG 修飾方法的局限性使用劑量;或在大的使用劑量下降低毒副作用(附在過(guò)去的30年中,蛋白的PEG修飾技術(shù)得到表)。近年來(lái),PEG修飾已成為提高其抗腫瘤效能、了快速發(fā)展,自 1991 年P(guān)EG修飾的腺苷脫氫酶降低毒副作用的有效手段[9-4。(PED-ADA)首次獲FDA認可以來(lái),迄今已有40多個(gè)PEG修飾的蛋白藥物被用于臨床治療各種疾病。但附表PEG 修飾蛋白及其應用該方法的應用也有其局限性,主要表現為:(1)擴散速度受限。經(jīng)PEG修飾后,蛋白分子量顯著(zhù)增加，被修飾蛋白種類(lèi)修飾目的用途無(wú)基質(zhì)牛血紅蛋白延長(cháng)血漿半衰期,降 血液代用品藥物自血液向目標組織的輸送速度受到限制;(2)生低腎毒性物活性降低。PEG為鏈狀高分子,在與蛋白表面特超氧化物歧化酶延長(cháng)血漿半衰期,降清除氧自由基,定基團進(jìn)行反應時(shí),不可避免地會(huì )在- -定程度上破低免疫原性治療關(guān)節炎壞或遮蔽了蛋白表面的活性位點(diǎn),造成其生物活性L(fǎng).天冬酰胺酶降低免疫原性治療白血病的降低。解決這些問(wèn)題,-方面可以通過(guò)對修飾反牛血清白蛋白血漿擴容劑應條件進(jìn)行優(yōu)化處理,確定最佳修飾度和產(chǎn)物的分白介素2增加水力動(dòng)力學(xué)半徑治療腫瘤子量,以便在延長(cháng)血液廓清時(shí)間和保證適宜的擴散腫瘤壞死因子~a增加抗腫瘤效能,降治療腫瘤低毒副作用速度之間求得平衡;另-方面,設計合成新的具有高抗腫瘤抗體腫瘤定位治療腫瘤選擇性的PEG修飾劑也是非常必要的,以便控制修β葡糖苷酸酶抗體增加穩定性，改善藥治療實(shí)體腫瘤飾反應只發(fā)生在生物大分子的某些特定部位上,避代動(dòng)力學(xué)特性免和減少對生物活性的影響。參考文獻TNF-a是由激活巨嗜細胞產(chǎn)生的一種蛋白,具有重要的生理功能。TNF-a是一種頗有價(jià)值的腫瘤[1] Greenwald RB, Pendri A, Matinez A, et al. PEG thiaoli-治療藥物,它具有協(xié)同的抗腫瘤效能:-方面直接表dine2-thione, a novel reagent for facile protein modifica-現為對腫瘤細胞的細胞毒作用;另-方面可激活宿tian: conjugation of bovine hemoglobin [J]. Bioconjug主的抗腫瘤應答并選擇性地引起腫瘤組織內部的微Chem, 1996, 7(6):638 - 641.循環(huán)障礙。但是, TNF-a在體內的清除速率很快,要[2] Conover CD, Malatesta P, Lejeune L, et al. The efects ofemdilution with polyethylene glycol bovine hemoglobin產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果需要非常大的使用劑量,由(PEG-Hb) in a conscious porcine model[J]. J Inwest Med,此常引發(fā)一- 系列嚴重的毒副作用，包括發(fā)熱組織炎1996, 44(5):238 - 246.癥和組織損傷,甚至是致命的內毒素性休克樣綜合[3] Conover CD, Linberg R, Shum KL, et al. The ability of征。要將其轉化為- -種有效的抗腫瘤藥物必須有效palyethylene glycol conijugated bovine hemogobin (PEG-地降低毒副作用, PEG修飾正是為達到這一目的。Hb) to adequately deliver oxygen in both exchange transfu.-研究表明,利用mPEC5000與TNF-a分子中賴(lài)氨酸sion and toploaded rat models[J]. Arif Cells Blood Substit殘基.上的伯氨基反應對TNF-a 進(jìn)行化學(xué)修飾,通過(guò)Immobil Bictecnol, 1999, 27(2):93- 107.中國煤化工ia A, et al. Comparison of對修飾條件的優(yōu)化處理,不僅能夠有效減少毒副作YHC N MH G to deemine the extent of用,還可提高其抗腫瘤活性。當賴(lài)氨酸殘基被修飾moification of methoxy polyethylene glycol 5000-modifed的程度分別為29%和56%時(shí),其抗腫瘤活性分別增borine cupri- zinc superoxide dismuase[J]. Anal Biochem,加了4倍和100倍。與天然TNF-a相比,修飾產(chǎn)物1997, 254(2):254 - 262.的分子量明顯增大，延長(cháng)了藥物的有效作用時(shí)間,同5] Sonack R, Saifer MC, Wlliams ID. Preparation of long-國外醫學(xué)藥學(xué)分冊2001 年4月第28卷第2期81●acting superoxide discutase using high molecular weightnamt interleukin2 at its glycosylation site[J]. Biotehnologypalyethylene gyco[J]. Free Radic Res Commun, 1991,(NY), 1990, 8(4):343 - 346.12/13(Pt 2):553 - 562.[11] Tsutsuni Y, Kihira T, Tsunoda s, et al . Molecular design[6] Nuci ML, Olejarczyk L, Abuchowski A. Immungenicityof hybrid tumor necrosis factor alpha with polyethyene gycolof plyethylene gyol -modifed superoxide dismutase andincreaes its antis tumour potency[J]. Br J Cancer, 1995, .ctlse[J]. 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Site directed pegylation of recombi-305 -315.心血管疾病的基因組學(xué)鐘大光',李盟軍2編譯朱明偉' 審校(1.解放軍總醫院臨床醫學(xué)基礎研究所,北京100853; 2.軍事醫學(xué)科學(xué)院科技部，北京100850)摘要:心血管疾病是遺傳易感因子和環(huán)境因子相互作用的結果。在過(guò)去幾年里,對一些遺傳性非動(dòng)脈硬化病如肥大性心肌病、擴張性心肌病、長(cháng)_QT綜合征和原發(fā)性高血壓的分子基礎的認識有了很大進(jìn)展。本文概述了有關(guān)這些疾病的基因多態(tài)性研究的最新進(jìn)展,討論了這些發(fā)現如何更新了疾病的診斷觀(guān)念,提出了一些防止和減輕這些疾病進(jìn)展的預防性措施,最后討論針對基因改變引起特定細胞或分子功能改變的新藥開(kāi)發(fā)情況。,關(guān)鍵詞:基因;心血管疾病;藥物中圖分類(lèi)號: RS4, Q78文獻標識碼: A文章編號: 1001-0971(2001 )02-0081-04心血管疾病是發(fā)達國家的主要死亡原因。近-疾病也不能排除遺傳因素的作用。本文討論以肥大個(gè)世紀以來(lái),心血管病的發(fā)病率急劇增加,不僅導致性心肌病擴張性心肌病、長(cháng)-QT綜合征和原發(fā)性高患者早亡，而且昂貴的醫療服務(wù)費用也對社會(huì )造成血壓為代表的非動(dòng)脈硬化性心臟病。了巨大的經(jīng)濟負擔。在過(guò)去幾年里,這些疾病的分子基礎研究取得心血管病分為兩大類(lèi):動(dòng)脈硬化綜合征和非動(dòng)了很大進(jìn)展,已經(jīng)發(fā)現了一些相關(guān)基因和危險因素。脈硬化綜合征。動(dòng)脈硬化、原發(fā)性高血壓、心肌梗這些發(fā)現有助于早期診斷心血管疾病。有助于采取死、充血性心力衰竭和心律失常等疾病通常是兩種預防性中國煤化工些疾病的進(jìn)展。同因素共同作用的結果,其一是有形成心臟病的遺傳時(shí)對新!YHCNMHG易感性,其二是環(huán)境因子。心臟炎癥性疾病如風(fēng)濕1心血管病基因組學(xué)的研究方 法熱、病毒性心肌炎可能構成第三類(lèi)病。然而這一-類(lèi)對于復雜的多基因或多因子疾病,最常采用的確定易患基因或致病基因的方法是確定候選基因,收稿日期3朔數搪