海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)酵

第27卷第4期南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版Vo.27,No.42003 A Journal of Nanjing Forestry University( Natural Sciences Edition) Jul, 2003海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)酵宋向陽(yáng),徐勇,楊富國,勇強',余世袁(1.南京林業(yè)大學(xué),江蘇南京210037;2.中甯大學(xué),湖南長(cháng)汐410083)攏要:以樹(shù)干畢亦酵母( Pichia stipitis為發(fā)酵茵株,利用海藻酸錳凝膠代替海藻酸鈣,固定化酵母使用壽命明顯増加。采用混合糖60g/L.(50%菊茍糖、50%木糖)為發(fā)酵底物,以250mL三角瓶為反應器,在35℃、150r/min、pH5.0條件下,派蕩發(fā)酵。結果表明,海藻酸錳樹(shù)干畢赤固定化增殖醐母細胞能使戊糖和己糖同步發(fā)酵,海藻酸錳凝膠耐磷酸鹽能力是海藻酸鈣凝膠的3倍,海藻酸錳圊定化樹(shù)干畢赤酵母細胞乙醇發(fā)酵42d,固定化細胞穩定,總糖利用牽為95.8%,乙醇得率為貍論得率的.3%,發(fā)酵穩定時(shí)間明顯長(cháng)于海藻酸鈣固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵的穩定時(shí)間(24d),關(guān)鍵詞:樹(shù)干畢赤酵母;海藻酸錳;固定化細胞;戊糖;乙醇中圖分類(lèi)號:Q53文獻標識碼:A文章編號:1000-2006(2003)04--0001-04Fermentation of Ethanol by Immobilized Cells of Manganese AlginateSONG Xiang-yang, XU Yong, YANG Fu-guo',YONG Qiang, YU Shi-yuan(1. Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Central SouthUniversity, Changsha 410083, ChinaAbstract: The life time of immobilized Pichia stipitis yeast cells was prolonged greatly when the gelwas forned with manganese alginate compared to that with calcium alginate. The ability of enduringphosphate of manganese alginate gel was inereased 3 times than that of calcium alginate gel. Fermentation of glucose-xylose mixture to ethanol was investigated in 250 mL shake-flask at 35C, pH 5.0 and150 r/min. Glucose-xylose mixture could be co-fermented to ethanol by immobilized Pichia stipitiyeast cells of nanganese alginate The results showed that immobilized cells of manganese alginate gewere still definite when fermentation of ethanol lasted 42 d, and utilization ratio of total sugar was95. 8%c, yield of ethanol rcached 92. 3% of theoretical, While fermentation of ethanol by immobilizedPichia stipitis yeast cells of aluminum alginate only lasted 24 d. It provided the basis of theory for producing ethanol with immobilized cells in industry.Key words: Pichia sti pitis Manganese alginate; Immobilized cells; Xylose; Ethanol固定化細胞技術(shù)根據固定化方法大致分為吸附法、包埋法、共價(jià)法和交聯(lián)法,其中以包埋法應用最為普遍。載體是固定化細胞技術(shù)的核心部分。包埋法中的載體有多種,如聚丙烯酰胺凝膠、海藻酸鈣、角叉菜聚糖、瓊脂糖、明膠等。目前固定化細胞技術(shù)已成為國際上研究的熱點(diǎn)之一2-,廣泛應用于工業(yè)、醫學(xué)、環(huán)境保護、能源開(kāi)發(fā)及化學(xué)分析等諸多領(lǐng)域海藻酸鈣是迄今應用最為廣泛的一種固定化載體。它具有網(wǎng)格孔隙大、傳質(zhì)阻力小、制備方法簡(jiǎn)單及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。但其強度較差,使用壽命短。這主要是由于培養基中的磷酸鹽逐漸使海藻酸鈣凝收筷日期:2002-04-25修回日期:2003-0103中國煤化工基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(39970597)作者簡(jiǎn)介:宋向陽(yáng)(1965—),男,江蘇無(wú)錫人,南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)CNMHG南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第27卷第4期膠破裂和解休。延長(cháng)海藻酸鈣凝膠使用壽命的處理方法較多。筆者利用Mn3對Ca2-置換法,將低濃度的樹(shù)干畢赤酵母( Pichia sti pitis)細胞固定,通過(guò)增殖培養,能高效地同步發(fā)酵戊糖和已糖,形成的海藻酸錳圊定化酵母細胞耐磷酸鹽能力顯著(zhù)増強,其使用壽命顯著(zhù)增加。為固定化細胞乙醇發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據。材料與方法1.1菌種和培養基菌種為樹(shù)干畢赤酵坶( Pichia stipitis),由南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所保藏,該菌種能夠同步發(fā)酵戊糖和己糖。酵母細胞培養基為木糖20.0g/L,蛋白胨5.0g/l.,酵母汁3.0g/L,培養基pH5.0;固定化增殖培養基為葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,蛋白胨3.0g/L,酵母汁2.5g/L,CaCl2.5g/L,MgS(25g/,KH2PO2.5g/I,培養基pH5.0;發(fā)酵培養基為葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,CaCl22.5g/L,MgSO30.25g/L,KH2PO42.5g/I,培養基pH51.2固定化細胞的制備與增殖將試管斜面菌種接入液體酵母細胞培養基,在30℃、150r/min條件下活化2d,取2mL菌液與3%海藻酸鈉溶液(68mL)于常溫下混合,注人2%CaCl2水溶液中,固化4bh,用無(wú)菌水將固化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2~3mm)洗3次(每次50mL),移入1.2%MnSO4溶液中,放置冰箱(4℃)固化24b。將固定化好的凝膠球〔直經(jīng)約3mm)置于增殖培養基中,在30℃、150r/min條件下增殖培養12h更換一次新鮮培養液,共增殖4次L.3乙醇發(fā)酵將固定化凝膠球川無(wú)菌水洗3次后,移人發(fā)酵培養基中。發(fā)酵容器為250mL三角瓶,發(fā)酵液體積與凝膠球的堆積體積之比為3:2,其中發(fā)酵液體積為50m1,總體積為80mL。將三角瓶置于恒溫振蕩器中,在35℃、150r/min條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。利用固定化細胞重復式發(fā)酵,每一批發(fā)酵結束后,收集發(fā)酵液,接入新鮮發(fā)酵液。1.4分析測定當一批發(fā)酵結束后,傾去發(fā)酵液,稱(chēng)取三角瓶與固定化細胞質(zhì)量,減去空三角瓶質(zhì)量,即為固定化細胞凝膠顆粒濕重。利用髙效液相色譜法測定乙醇含量。釆用3,5-二硝基水楊酸(D丶`S)法測定還原糖2結果與分析2.1固定化凝膠顆粒耐磷酸鹽能力海藻酸鈣是∽種應用較為廣泛的固定化載體,但其強度較差,使用壽命短。在制備海藻酸鈣凝膠顆粒過(guò)程中添加活性炭、Al2O3、SO2、MnCl2等,盡管表1固定化細胞凝膠顆粒耐磷酸鹽能力可不同程度地增加海藻酸鈣的機械強度及穩定性, Table 1 Test of enduring phosphate of gel bends但由于發(fā)酵培養基中的磷酸鹽逐漸使海藻酸鈣凝膠on cells immobilization顆粒破裂和解體,所以海藻酸鈣凝膠使用壽命提高實(shí)驗添加物添加物質(zhì)凝膠顆粒溶凝膠顆粒破量分數%解時(shí)間/min裂時(shí)間/min并不明顯。試驗通過(guò)Mn2對Ca2-置換法,形成的1A2O3(A)藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力明顯增強。2A!O(B試驗過(guò)程為:分別稱(chēng)取1g固定化凝膠顆粒,溶于MnCl4A)50m濃度為0.1mol/l的磷酸鹽中性緩沖液中4 MoCk(B5 Sick(A240于35℃條件下,間歇振蕩,確定固定化凝膠顆粒開(kāi)65)(B)裂及溶解的時(shí)間,以測試凝膠顆粒耐磷酸鹽能力,7活性炭(A結果見(jiàn)表18活性炭(B)9空H從表1可見(jiàn),海藻酸鈣凝膠顆粒中添加劑不同,10中國煤化工其耐磷酸鹽能力也不同。添加活性炭的固定化凝膠顆粒耐磷酸鹽能力沒(méi)有明顯提高,由于活性炭表面YHCNMHG如物在滅后加人203年總第106期末向陽(yáng)等:海藻酸錳固定化細胞的乙醇發(fā)解積比較大且具有多孔性添加到海藻酸鈣凝膠顆粒屮,增加了固定化細胞的通透性,但其耐磷酸鹽能力提高不多,開(kāi)裂時(shí)間為30min,比空白(不添加物的)多10min,溶解時(shí)間均為120min。添加SO2比Al2O)3效果要好,耐磷酸鹽能力提高2倍,這是由于SO2為原子型晶體強度較高,添加至凝膠顆粒中可增加其強度。而采用詈換法形成海藻酸錳、海藻酸鋁的固定化細胞耐磷酸鹽能力增強顯著(zhù),因為Mn3、A}把Cn-從海藻酸鈣凝膠顆粒屮置換出來(lái),磷酸鹽對海藻酸錳、海藻酸鋁的凝膠顆粒破壞性減少,故海藻酸錳、海藻酸鋁的圊定化細胞耐磷酸鹽能力提高3倍。2.2MnSO4溶液濃度對固定化細胞乙醇發(fā)酵的影響配置0.4,0.6%,0.8%,1.0%,1,2%,1.4%,1.6%的MnSO溶液,利用Mn2對Ca2+置換法,分別制備成海藻酸錳固定化酵母細胞。通過(guò)增殖培粟養,使凝膠株表面的樹(shù)干畢赤酵母細胞密集,形成高濃度的固定化酵母細胞,高效地利用戊糖、己糖同步發(fā)酵成乙醇。MnSO4溶液濃度對固定化細胞乙醇0.40.60.81.01.21.41.6發(fā)酵糖利用率的影響見(jiàn)圖1。hs04溶液質(zhì)量分數%由圖1可見(jiàn),MnSO溶液濃度對固定化酵母細圖1MsO溶液質(zhì)量分數對固定化細胞乙醇胞乙醇發(fā)酵的影響較大。當MnSO4溶液質(zhì)量分數為發(fā)酵糖利用率的影響0.4%~1.2%時(shí),隨著(zhù)Mn2濃度的增加,還原糖利Fig.1 Effects of concentration of MpSO, solution用率逐漸升高。如MnSO4溶液質(zhì)量分數為0.4%,lization ratio of sugar of ethanol fermentation0.6%,0.8%,1.0%時(shí),還原糖利用率分別為by cells immobilization91.7%,92.8%,93.6%,94.6%,當MnSO4溶液質(zhì)量分數為1.2%時(shí),還原糖利用率達最大值95.8%。而當MnSO4溶液質(zhì)量分數超過(guò)1.2%時(shí),隨著(zhù)Mn2+濃度的增加,還原糖利用率反而下降。即MnSO4溶液質(zhì)量分數1.2%為轉折點(diǎn)。這是因為Mn2濃度對海藻酸鈣的置換影響較大。當MnSO4溶液質(zhì)量分數為0.4%,由于Mn2+濃度低,海藻酸根螯合及置換出海藻酸鈣中的Ca2-形成的海藻酸錳凝膠的作用較弱凝膠株強度差,穩定性低。顯微鏡下觀(guān)察,醪液中溢出的游離細胞較多,還原糖利用率為91.7%;當MnSO溶液質(zhì)量分數超過(guò)1.2%時(shí),雖然凝膠株的機械強度有所提高,醪液中游離細胞減少,但是凝膠株彈性變小,且凝膠株介質(zhì)表面過(guò)于稠密降低了底物及營(yíng)養鹽通過(guò)酵母細胞的傳質(zhì)能力,故還原糖利用率下降。結果表明,當MnSO溶液質(zhì)量分數為1.2%時(shí),形成的海藻酸錳固定化酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵最佳2.3發(fā)酵液pH對固定化細胞乙醇發(fā)酵的影響將海藻酸錳固定化增殖酵母凝膠顆粒各30mL表2發(fā)酵液pH對海藻酸錳固定化細胞分別放入體積為50m不同pH混合糖(混合糖濃乙醇發(fā)酵24h的影響度為60g/L,木糖和葡萄糖各占50%)的發(fā)酵液中, Table 2 Effects of pH value of the broth on ethanol在35℃、150r/min條件下,發(fā)酵24h,結果見(jiàn)表2。fermentation for lasting 24 h by cells從表2可見(jiàn),發(fā)酵液pH在3.0~6.0范圍內immobilization of manganese alginate發(fā)酵液殘糖還原糖利固定化酵母乙酵得率比發(fā)酵液pH越低,越不利于海藻酸錳固定化酵母細pH濃度/g·1.用率%細胞濕重/R理論得率胞的生長(cháng)和繁殖。當發(fā)酵液pH3.5時(shí),殘糖濃度3028.5452.442.3高達16.72g/L,乙醇得率為理論得率的32.1%。3.516.727218.5顯微鏡下觀(guān)察酵母細胞,部分形態(tài)已不圓滑,單細胞03.9393.50.8960.918較多,芽孢少,即酵母細胞長(cháng)時(shí)間在pH3.5以下發(fā).52.5395,80.923生變形,其生物功能降低或喪失,糖代謝能力下降,6.0己醇得率顯著(zhù)降低。當發(fā)酵液pH為4.0時(shí),酵母細胞形態(tài)圓滑,糖利用率高,殘糖僅3.93g/L,乙醇得率為理論得率的896%。發(fā)酵液pH5.5時(shí),乙醇得率為理論得率的92.3%。發(fā)酵液pH大于5.5時(shí)乙脾得率雖有提高,但工業(yè)生產(chǎn)時(shí)高pH發(fā)酵液易染菌。H中國煤化工*藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵較適宜,此結果與海藻酸鈣固定化酵母乙醇發(fā)CNMHG南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第27卷第4期2.4海藻酸鈣、海藻酸鋁及海藻酸錳的乙醇發(fā)酵利用海藻酸鈣、海藻酸鋁和海藻酸錳的固定化7增殖樹(shù)干畢赤酵母細胞,在35℃、150r/min條件下對濃度為60g/1混合糖(50%葡萄糖、50%木糖)分別進(jìn)行發(fā)酵試驗(圖2)。結果表明,3種固定化增殖墼4樹(shù)干畢赤酵母細胞前24d乙醇發(fā)酵均較穩定,但蛋卷立24d以后差異明顯發(fā)酵至36d,海藻酸鈣固定化細胞乙醇發(fā)酵中,122428364248殘糖濃度由2.87g/I(24d)上升至3.53g/L-,其固醇周期/d定化細胞重量由59.4g下降至53.6g、減少5.8g;圖2海藻酸鈣、海藻酸鋁、海藻酸錳而海藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵穩定,固定化酵母固定化細胞的乙醇發(fā)牌細胞流失少,僅減少2.6g。即海藻酸鈣、海藻酸鋁和i.2F: thanol fermentation of inmumolilizcd cells of calcium海藻酸錳的固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵可分別穩定發(fā)lginate, aluminum alginate and manganese alginate酵24、36及42d。這是因為發(fā)酵培養基中磷酸鹽逐■海藥酸鈣固定化細胞乙醇發(fā)酵殘糖濃度:◇漸使海藻酸鈣凝膠破裂,而海藻酸鋁、海藻酸錳的圊酸錳定化細胞乙醇發(fā)酵殘糖濃度:·海藻酸鋁同定化細胞耐磷酸鹽能力明顯強于海藻酸鈣固定化細化細胞乙牌發(fā)酵殘糖濃度;“▲-海灤酸鈣固定化胞凝膠顆粒重:-×一海藻酸鋁固定化細胞膠顆莉重胞。海藻酸錳圊定化酵母細胞乙醇發(fā)酵穩定性長(cháng)于-?！Ｂ渌嵴`因定化組胞凝膠顆粒重海藻酸鋁的固定化酵母細胞,因為海藻酸錳凝膠顆粒強度雖然略差于海藻酸鋁固定化細胞,但海藻酸錳凝膠顆粒富有彈性,細胞固定得牢固·凝膠顆粒不容易破碎。海藻酸鋁固定化細胞凝膠顆粒強度較大但凝膠顆秈比海藻酸錳固定化細胞凝膠顆粒脆性大,容易產(chǎn)生裂痕,最終導致細胞流失及凝膠顆粒自溶。所以,海藻酸錳固定化細胞乙醇發(fā)酵要比海濚酸鋁固定化細胞乙醇發(fā)酵穩定時(shí)間長(cháng)6d3結論(1)Mn3-對Ca置換形成的海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力明顯增強,而MnS(.溶液濃度對固定化酵母細胞乙醇發(fā)酵糖利用率的影響較大。以不同質(zhì)量分數MnSO4溶液分別制成的海藻酸錳固定化細胞進(jìn)行乙醇發(fā)酵,當MnSO.溶液質(zhì)量分數為1.2%時(shí),海藻酸錳圊定化酵母乙醇發(fā)酵的糖利用率最高,達95.8%(2)耐磷酸鹽能力試驗表明海藻酸鈉溶液中添加SiO效果較好,形成的海藻酸鈣固定化細胞耐磷酸鹽能力是不添加的2倍。而以置換法形成的定化酵母細胞要比以添加法形成的好,形成的海藻酸錳固定化酵母細胞耐磷酸鹽能力是不添加SiO2的3倍?！?)采用置換法形成海藻酸錳固定化細胞,其發(fā)酵穩定性由24d延長(cháng)至42d,乙醇得率為理論得率的92.3%。[1張樹(shù)政酶制劑工業(yè):上[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,998:350.[2j Lata A, Garria L. 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