唐古特大黃乙醇提取物的HPLC指紋圖譜研究

第25卷第11期分析試驗室25 No 11006年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory唐古特大黃乙醇提取物的HPLC指紋圖譜研究周劍波2,蔣福全2,文懷秀12,邵赟,師治賢,陶燕鐸*〔Ⅰ.中國科學(xué)院西北高原生物研究所,西寧810008;2.中國科學(xué)院研究生院,北京100049)摘要闈高效液相色譜法建立唐古特大黃乙醇提取物的指紋圖譜分析方法。采用 Phenomenex Kromasil C色譜柱(4.6mm×250mm,5pm);甲醇-0.1%HPO為流動(dòng)相,梯度洗脫,檢測波長(cháng)為270nm,以大黃酸為參照峰。結果共有18個(gè)共有峰。此法為有效地控制唐古特大黃乙醇提取物的質(zhì)量提供了依據.關(guān)鍵詞唐古特大黃;提取物;HPLC;指紋圖譜中圖分類(lèi)號657.7文獻標識碼A文章編號1000-07202006)1-001-05唐古特大黃( Rheum tanguticum Maxim.ex器), agilent化學(xué)工作站,中藥色譜指紋圖譜相似Ba∥f.)為蓼科植物,是大黃藥材的主要來(lái)源,其有度評價(jià)系統(國家藥典委員會(huì ),版本2004A),KQ效成分主要是蔥醌類(lèi)衍生物如大黃酸、大黃素、-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器大黃酚、蘆薈大黃素和大黃素甲醚等,具有瀉熱有限公司),電子分析天平(梅特勒公司通腸,涼血解毒,逐淤通經(jīng)等功能,是中醫臨床1.2試劑常用中藥。有關(guān)大黃中蒽醌類(lèi)衍生物的含量測定甲醇為色譜純(山東禹王化工廠(chǎng)),水為重蒸方法報道24較多,但以此作為質(zhì)量控制,很難全水,其它試劑均為分析純。大黃酸對照品(批號面反映藥材或提取物的內在質(zhì)量。而有關(guān)大黃指0757-9804)大黃素對照品(批號:110756紋圖譜的研究,文獻5也曾有報道,但多限于200110)大黃酚對照品(批號:110796-200309大黃藥材成份的指紋圖譜分析。徐雄良等曾研大黃素甲醚對照品(批號:758-9301),以上對照究了注射用大黃粉針劑的HPLC指紋圖譜,關(guān)于大品購自中國藥品生物制品檢定所。12批唐古特大黃提取物的HPC指紋圖譜還沒(méi)見(jiàn)報道。建立中藥黃乙醇提取物由本實(shí)驗室根據優(yōu)化工藝制得。提取物可行的質(zhì)控方法將更加有助于中藥提取物2方法與結果向更廣闊的國際市場(chǎng)空間發(fā)展。利用色譜指紋圖2.1色譜條件譜可以較為全面地檢測其多種成分在藥材中分布Phenomenex Kromasil C1色譜柱(4.6mm×250的全貌,使藥材的內在質(zhì)量情況可視。本文通m,5pm);流動(dòng)相:A相為甲醇,B相為0.1%的過(guò)優(yōu)選HPLC梯度洗脫程序,建立了大黃乙醇提取H3PO緩沖液,采用梯度洗脫∶流速:1.0mI/r物的指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù),可作為唐古特大黃DAD檢測器,柱溫30℃。線(xiàn)性梯度洗脫程序見(jiàn)乙醇提取物及以其為主成分制劑的指紋圖譜研究表1,運行時(shí)間50min,兩次進(jìn)樣之間用流動(dòng)相初基礎始梯度條件平衡15min。采用二極管陣列檢測器1儀器與試劑對檢測波長(cháng)進(jìn)行了考察,分別記錄波長(cháng)在2301.1儀器254、270、280,300mm的色譜圖。結果在270mmΔ gilet100液相色譜儀〔含在線(xiàn)真空脫氣機,處各色譜峰均有較好的紫外吸收,色譜信息最為低壓四元梯度泵,手動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱,DAD檢測豐富,并且分離度好,可使主要色譜峰達到基線(xiàn)*收稿日期:2006-02-24修訂日期:2006-04-29基金項目:中國科學(xué)院知識創(chuàng )新工程(CXLY-2002-9項目資助第25卷第11期分析試驗室ol.25.No.112006年11月Chinese Joumal of Analysis Laboratory2006-11分離。以大黃酸色譜峰(指紋圖譜中為14號峰)為參照表1線(xiàn)性梯度洗脫程序峰,計算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。Gradient elution program結果表明,各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積梯度流速B/%穩定,RSD<3%,表明樣品溶液在16h內穩定。t/min(ml/min)甲醇0.1%HPO4緩沖液2.4唐古特大黃提取物指紋圖譜的測定及參數分別準確吸取對照品溶液及12批供試品溶液各10μL按前述色譜條件進(jìn)樣,記錄指紋圖譜(見(jiàn)圖1、圖2),將圖譜數據導入指紋圖譜相似性評價(jià)軟(中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統,2004A2.2樣品與對照品溶液的制備版)分析,通過(guò)設置參照圖譜,自動(dòng)匹配(見(jiàn)圖3),2.2.1提取物的制備根據文獻"報道,經(jīng)過(guò)生成對照圖圖2)確定了18個(gè)共有峰,其中14優(yōu)化確定提取物的最佳提取工藝為唐古特大黃藥材粉碎成粗粉,加8倍量V75%乙醇):V(15%384.9H2SO4)=10:1回流提取2次,每次2h,合并提取液,濃縮,先用乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯層再以50g/ L NaoH溶液萃取,取水層,加入HCl后得沉淀,干燥成浸膏粉,得提取物。2.2.2樣品溶液的制備準確稱(chēng)取干燥至恒量的09.1618.3227.4836.6445.805496提取物粉末10mg,加甲醇超聲溶解,用甲醇定容圖1混合對照品色譜圖至25mL,過(guò)0.45m的微孔濾膜后作為供試品溶Fig. I Chromatogram of mixed reference substances液大黃酸;b-大黃素;c-大黃酚;d-大黃素甲醚2.2.3對照品溶液的制備分別準確稱(chēng)取大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品5mg,加384.91甲醇超聲溶解,用甲醇定容至25mL,制成0.2mg/m的混合對照品溶液,過(guò)0.45{m的微孔濾膜后作為供試品溶液。2.3方法學(xué)考察2.3.1精密度分別準確吸取同一供試品溶液0△10μL,按上述色譜條件連續進(jìn)樣5次,記錄指紋09.1618.3227.4836.6445.8054.96圖譜。以大黃酸色譜峰(指紋圖譜中為14號峰)為圖2對照樣品色譜圖參照峰,計算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰Fig 2 Chromatogram of a representative sample面積。結果表明,各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積穩定,RSD<3%,表明儀器精密度良好。15、16、18號峰分別為大黃酸、大黃素、大黃酚2.32重現性按樣品溶液制備方法處理同一樣大黃素甲醚,選取14號峰大黃酸為參照峰標示品5份,各吸取10L,按上述色譜條件分別測定為S峰)計算各共有峰對保留時(shí)間和相對峰面積記錄指紋圖譜。以大黃酸色譜峰指紋圖譜中為14值分別見(jiàn)表2、表3單峰面積與總峰面積的比號峰)為參照峰,計算各共有峰的相對保留時(shí)間值大于10%的共有峰有1、4、5、14號峰,其相對和相對峰面積。結果表明,各共有峰相對保留時(shí)保留時(shí)間分別為0.104、0.346、0.434、1.000.間和相對峰面積穩定,RSD<3%,表明實(shí)驗方法用夾角余弦法計算相似度,進(jìn)行整體相似度評價(jià),的重復性良好,通過(guò)相似度分析發(fā)現,12批樣品的相似度均在23.3穩定性取同一供試品溶液分別在0、2、95%以上(見(jiàn)表4),平均為97.5,表明樣品相似性L(fǎng)良好,可以作為控制唐古特大黃乙醇提取物的質(zhì)第25卷第11期分析試驗室25 No 11年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory2006-11量依據。384.91大黃酸大黃素大黃酚大黃系甲醚8910121317人凡A水術(shù)法18.3236.64圖312批大黃提取物樣品的匹配色譜圖Fig 3 Matching chromatograms of 12 batches of rhubarb extracts表212批大黃提取物指紋圖譜共有峰相對保留時(shí)間(t/min)Tab 2 Relative retention values of characteristic peaks for 12 batches of rhubarb extracts批號峰號12平均RSD/%10.1030.1020.1040.1050.1030.1010.1040.1050.1020.1040.1030.1060.1041.39720.1270.1260.1250.1240.1270.1240.1270.1250.1260.1250.1240.1250.1250.92930.1850.1830.1840.1860.1850.1860.1830.1840.1850,1860.1840.1820.1840.71140.3480.3460.3450.3470.3450.3430.3450.3470.3490.3460.3440.3470.3460,49350.4340.4320.4350.4330.4360.4310,4340.4360.4320,4340.4330.4350.4340.36960.5410.5430.5380.5370.5390.5420.5430.5400.5390.5440.5420.5410.5410.40370.6780.6750.6730.6760.6740.6790.6770.6760.6750.6740.6740.6760.6760.26480.7450.7430.7470.740.7420.7460.7450.7440.7430.7450.7460.7470.7450.2157850.7830.7860.7870.7820.7850.7880.7860.7870.7820.7840.7830.7850.260100.8210.8240.8180.8170.8250.8230.8220.8240.8250.8200.8250.8230.8220.333ll0.8400.8420.8370.8420.8430.8410.8440.8410.8430.8450.8460.8440.8420.288120.8800.8770.8810.8820.8780.8850.8830.8780.8790.8830.8810.8770.8800.29630.9490.9470.9450.9530.9510.9480.9530.9470.9520.9460.9490.9470.9490.28914S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000151.2951.2921.2951.2931.2961.2941.2911.2971.2951.2981.2921.2911.2940.179161,4201,4191.4221.4211,4241,4221,4171.4211.4231,4181.4201.4211,4210.142171.4871,4851,4901,4881.4911.4861.4881.4911,4851,4871,4851.4861.4870.150181.5711,5741,5691.5731.5681,5721.5721.5681.5731.5671.5721.5691.5710.149第25卷第11期分析試驗室ol.25.No.112006年11月Chinese Joumal of Analysis Laboratory2006-11表312批大黃提取物指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of characteristic peaks for 12 batches of rhubarb extracts批號峰號12平均RsD/%11.1091.1001.1071.1051.1071.1091.1071,10l121.1071.1091.1051.1070.26520.3310,3370.3400.3340.3320,3300.3280.3290,3340.3380.3300.3360.3331.16030.3750,4010.3800.3780.3850.3730.3710.3760.3810,3810.3730.3790.3792.08641.3921.4031.3891.3971.421.3951,3931.3981.3941.4021.3951.3951.3980.59350.9100.9080.9130.9120.9080.9060.9010.9060.9080.9110.9060.9130.9090.38860.2400.2370.2430.2420.2370.2370.2390.2390.2370.2350.2370.2420.2391.05870.2320.2390.2370.2370.2400.2320.2350.2360.2360.2370.2310.2330.2351.22180.1580.1620.1550.1610.1570.1590.1540.1560.1580.1570.1560.1550.1571.54190.1920.1980.1980.1950.1920.1890.1850.1930.1970.1910.1920.1940.1931.964100.1280.1300.1250.1290.1270.1270.1250.1260.1280.1240.1280.1250.1271.459110.2970.2910.2950.2930.2980.2960.2930.2920.2940.2910.2960.2940.2940.778120.1610.1580.1630.1590.1570.1590.1600.1620.1610.1600.1600.1630.1601.164130.1860.1870.1890.1910.1850.1850.1840.1870.1890.1890.1850.1860.1871.15141.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00050.3340.3340.3330.3360.3340,3330.3310.3340.3340.3350.3330/3300.3330,486160,1020.1020.1010.1030.1040,1040.1010.1020.1050.1020.1040/1060.1031.549170.1350.1400.1390.1420.1410.1330.1360.1380.1410.1420.1330.1410.1382,435180.0410.0400.0400.0410.0420.0400.0420.0410.0400.0410.0410.0400.0411.850表412批大黃提取物的相似度烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相柱,分別對甲Ib4 Similarity analysis results of I2 batches of rhubarb醇-水、甲醇-0.1%H3PO、乙腈-水和乙腈extracts0.1%H3PO等體系進(jìn)行了等度和梯度洗脫試批號相似度批號相似度驗,結果以甲醇-0.1%HPO水體系進(jìn)行梯度洗0.9810.980脫得到的色譜峰形以及分離度較好;比較了1900.9770.975400mm波長(cháng)下的色譜圖,結果270mm波長(cháng)時(shí)色譜0.9520.961峰信息較多,分離情況良好;同時(shí)考察了不同柱0,9860.981溫、不同流速等條件對色譜分離的影響,表明柱0.978110,984溫30℃,流速I(mǎi)mL/min為佳,采用本方法可使主0.9830.964要色譜峰在50min內達到很好的分離,且同時(shí)分析了大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚4個(gè)指討論標成分,這使提取物的指紋圖譜分析效率大大提1.本實(shí)驗依據國家藥典委員會(huì )關(guān)于《中藥注。射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》,以HPLC通過(guò)本方法分析12批唐古特大黃的乙醇梯度洗脫法對唐古特大黃的乙醇提取物進(jìn)行了指提取物,經(jīng)指紋圖譜相似度軟件分析,相似度均紋圖譜研究,實(shí)驗證明,該方法可操作性強、重復在95%以上。所建立的方法精密度、穩定性和重性好,可作為唐古特大黃乙醇提取物及以其為主現性符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求,為唐古特大成分制劑的指紋圖譜研究基礎。黃乙醇提取物及其制劑的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依第25卷第11期分析試驗室25 No 11006年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory參考文獻2004,354):559[1]國家藥典委員會(huì 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Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences Xining 810008; 2. Graduate School of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049), Fenxi Shiyanshi, 2006, 25( 11): 1-5Abstract: Fingerprint chromatograms of alcohol extract from Rheum tanguticum by HPLC were established. A Phe-nomenex Kromasil CI8( 4. 6 mm x 250 mm, 5 um)column was used methanol-01% phosphate acid was used asthe mobile phase and gradient elution program was used, UV detection wavelength was 270 nm, and rhein was usedas a reference peak. The results indicated that 18 peaks were obtained in fingerprint chromatograms. The method issimple and accurate with a good reproducibility and it can be used as a quality control method for alcohol extractseum tKeywords: Rheum tanguticum Extract Fingerprint chromatogram i HPLC全國試劑與應用技術(shù)交流會(huì )會(huì )議通知(第二輪)為總結、交流化學(xué)試劑包括小噸位精細化學(xué)品)與應用技術(shù)、分析測試技術(shù)的進(jìn)展交流最新成果搭建產(chǎn)、學(xué)、研、銷(xiāo)用平臺促進(jìn)化學(xué)試劑和分析測試技術(shù)的發(fā)展中國分析測試協(xié)會(huì )、全國化學(xué)試劑信息站將于2006年11月12-17日在海南省?？谑泻Ｍ饩频暾匍_(kāi)″全國試劑與應用技術(shù)交流會(huì )”具體由《化學(xué)試劑》編輯部承辦。會(huì )議期間除發(fā)表論文外還有科技部條財司領(lǐng)導、中國科學(xué)院院土、著(zhù)名專(zhuān)家、學(xué)者的專(zhuān)題報告。會(huì )議時(shí)間:2006年11月13日至17日報到時(shí)間:2006年11月12日全天會(huì )議地點(diǎn):?？谑泻Ｍ饩频陥竺椒?欲參加會(huì )議者請填寫(xiě)回執寄回或傳真給全國化學(xué)試劑信息站或《化學(xué)試劑》編輯部。為了安排食宿方便請務(wù)必于9月25日前寄回或傳真回執聯(lián)系電話(huà):010-65283411、65281741;傳真:65281741《化學(xué)試劑》編輯部010-68512289中國分析測試協(xié)會(huì )謝小E-mail:webmaster@chinareagent.com.cn通訊地址:100010北京市東城區東四南大街160號《化學(xué)試劑》編輯部中國分析測試協(xié)全國化學(xué)試劑信息站年7月20日