乙醇預處理麥稈的酶解性能研究

第12卷第1期生物加工過(guò)程Chinese Journal of Bioprocess EngineeringJan.2014doi:10.3969/j.isn.l672-3678.2014.01.001乙醇預處理麥稈的酶解性能研究陳紅梅,趙雪冰,劉德華(清華大學(xué)化工系應用化學(xué)研究所,北京100084)摘要:采用H2SO催化和自催化乙醇法對麥稈進(jìn)行預處理,比較預處理后麥稈的主要化學(xué)組成、纖維素酶解性能和半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇特性,并進(jìn)行物料衡算。結果表明:HSO催化和自催化乙醇預處理過(guò)程中纖維素固體收率大于90%。添加非離子表面活性劑吐溫20和吐溫δ0沒(méi)有顯著(zhù)提高HSO催化乙醇預處理后纖維素的酶解茼笥糖得率及半同步糖化發(fā)酵過(guò)程中♂醇的產(chǎn)量,而對自催化乙醇處理后麥稈的酶解和半冏步糖化發(fā)酵過(guò)程有定程度的促進(jìn)作用,相應的酶解葡聚糖轉化率由72.7%提高到85.0%,而半冋步糖化發(fā)酵過(guò)程中乙醇質(zhì)量濃度提高了11.4%。物料衡算結果表明:酸催化和自催化乙醇預處理后萄聚糖回收率分別為9.0%和95.4%;半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的得率分別為10.4和11.6g(按100g原料計)關(guān)鍵詞:有機溶劑預處理;麥稈;酶解;半同步糖化發(fā)酵中圖分類(lèi)號:TQ353文獻標志碼:A文章編號:1672-3678(2014)01-0001-07Enzymatic digestibility of ethanol pretreated wheat strawCheN Hongmei. ZHAO Xuebing. LIU DehuaInstitute of Applied Chemistry, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China)Abstract: Wheat straw was pretreated by sulfuric acid-catalyzed(SAC) and auto-catalyzed(AC) ethanolorganosolv processes. The main chemical compositions, cellulose digestibility and ethanol production byhemi-simultaneous saccharification and fermentation hSSF of pretreated solids were comparedthat SAC and AC pretreatments recovered more than 90% of cellulose as sophase. Addition of non-ionic surfactants Tween 20 and Tween 80 did not significantly improve theenzymatic digestibility and ethanol production of SAC-pretreated wheat straw. However, they showed somepositive effects on AC-pretreated wheat straw, with the corresponding enzymatic glucan conversionincreased from 72. 7%o to 85. 0%0 and ethanol concentration increased by 11. 4%0. Material balanceanalysis showed that glucan recoveries, as a solid phase, were 91.0% and 95. 4% for SAC and ACpretreatments, respectively. Corresponding ethanol yields were 10. 4 and 11.6 g per 100 g raw materialduring SSF process, respectively.Key words: organosolv pretreatment; wheat straw; enzymatic hydrolysis; hemi-simultaneoussaccharification and fermentation木質(zhì)纖維素是一種產(chǎn)量豐富、來(lái)源廣泛、廉價(jià)的可再生資源。近些年來(lái),由于化石資源短缺和溫收稿日期:2013-11-22基金項目:國家重點(diǎn)基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(20CB707406)作者簡(jiǎn)介:陳紅梅(1988—),女,江西贛州人,博士研究生,研究方向:木質(zhì)纖維素生物煉制;趙雪冰(聯(lián)系人),助理研究員,Eml: zhaoxu@生物加工過(guò)程第12卷室氣體排放量大幅增加,木質(zhì)纖維素轉化生產(chǎn)燃料等試劑均為市售分析純。高效液相色譜(HPLC)用和化學(xué)品受到世界各國的廣泛關(guān)注。但由于木標準品,包括葡萄糖、木糖、纖維二糖、阿拉伯糖、糠質(zhì)纖維素本身結構復雜,特別是半纖維素和木質(zhì)素醛、甲酸、乙酸、乙醇等購自 Sigma- Aldrich上海分公限制了纖維素的酶催化水解性能。因此,木質(zhì)纖維司。纖維素酶為諾維信公司生產(chǎn)的 Ellice Ctec2。素原料往往需要經(jīng)過(guò)預處理以破壞其抗生物降解1.2主要儀器和設備屏障從而提高纖維素酶對纖維素的可及性2。木預處理反應器為天舟海泰(北京)科技有限公質(zhì)纖維素生物轉化的預處理方法有多種,常用的包司的TFCF5-5型5L不銹鋼高壓反應釜。液相色括稀酸預處理、蒸汽爆破(或超臨界CO爆破)、熱譜儀為日本島津公司的HPLC系統,色譜柱為Bio-水預處理、氨纖維素爆破、氨水循環(huán)滲透和石灰預Rad公司的 Aminex hpx-87H(300mmx7.8mm)處理等3-。有機溶劑預處理是采用有機溶劑或其填充柱,檢測器為島津公司RD-10A差示折光檢水溶液在添加或不添加催化劑的條件下對木質(zhì)纖測器。流動(dòng)相為5mmol/L稀H2SO4,流速為0.8維素原料進(jìn)行預處理的方法。在有機溶劑預處理mL/min,柱溫為65℃。紫外分光光度計為上海天過(guò)程中,由于木質(zhì)素和半纖維素的脫除,原料孔隙美科學(xué)儀器有限公司的UI-VS85系列紫外/可見(jiàn)率增加,從而提高了纖維素與纖維素酶的可接觸面分光光度計。積5。有機溶劑預處理一方面可以有效提高纖維1.3實(shí)驗方法素的酶解性能,另一方面在預處理過(guò)程中可水解半1.3.1自催化乙醇處理纖維素、溶解木質(zhì)素,因而是一種分級預處理,有利自催化乙醇是在筆者所在實(shí)驗室之前優(yōu)化后于實(shí)現原料的分級加工利用的條件下進(jìn)行的。150g麥稈置于高壓反應釜中,加乙醇預處理是目前研究較多的有機溶劑預處人1500mL體積分數65%的乙醇水溶液,在300理方法8。乙醇具有低毒、揮發(fā)性大、易回收利用r/min下進(jìn)行預處理。預處理溫度為220℃,保溫20的特點(diǎn)。目前,將乙醇作為溶劑處理木質(zhì)纖維素原min。反應結束后冷卻到40℃以下,離心,收集液料研究較多的是自催化乙醇處理法和酸催化乙醇體,固體用相同濃度的乙醇溶液以10:1(mL/g)液處理法1。自催化乙醇處理法通常是指除乙醇固比洗滌,再離心,收集液體,將固體進(jìn)行減壓蒸外,不添加任何化學(xué)藥品作催化劑,而依賴(lài)于預處發(fā),回收乙醇。所得固體保存在自封袋中,放入4℃理過(guò)程中釋放的有機酸(主要是乙酸)來(lái)提供所需冰箱保存待用。酸度的乙醇處理法,反應溫度通常為180~210℃。1.3.2酸催化乙醇處理酸催化乙醇處理法是向體系中添加外源有機酸或H2SO催化的乙醇預處理過(guò)程與自催化過(guò)程類(lèi)無(wú)機酸作為催化劑,從而促進(jìn)脫木素作用和半纖維似,不同的是乙醇質(zhì)量分數60%,且在預處理過(guò)程中素水解,加入酸性催化劑可降低反應溫度和添加30mml/LH2SO作為催化劑,并在190℃下保壓力12溫1h5。其他過(guò)程與自催化乙醇預處理相同。為分析和比較乙醇預處理后麥稈的纖維素酶1.3.3酶解實(shí)驗解特性,筆者分別在最優(yōu)條件下對麥稈進(jìn)行H2SO預處理后固體的酶解在50mL三角瓶、pH4.8催化和自催化乙醇處理,比較這2種乙醇法處理后的醋酸緩沖溶液、50℃和150r/min條件下進(jìn)行麥稈的主要化學(xué)組成、纖維素酶解性能和半同步糖固體含量為10%或15%(10%和15%分別指100化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇特性,并進(jìn)一步獲得物料衡算數據。mL液體中所含絕干固體質(zhì)量為10g和15g)。纖維素酶用量為20FPU(按1g固體計)。間歇取樣1材料與方法測定液相中纖維二糖、葡萄糖和木糖的濃度。預處1.1主要原料和試劑理后的纖維素酶解性能以液相中單糖濃度以及酶實(shí)驗所用的小麥秸稈產(chǎn)自山東省,風(fēng)干后待解聚糖轉化率來(lái)描述。用。將其破碎成<2cm的片段。采用美國國家可酶解葡聚糖轉化率的定義為酶解過(guò)程中轉化再生能源實(shí)驗室的方法測定其主要化學(xué)組成:葡為葡萄糖和纖維二糖的聚糖百分率聚糖33.1%,木聚糖2.8%,酸溶木素2.21%,酸不Pg tPc溶木素22.1%。乙醇、H2SO4、CaCO3、醋酸鈉、吐溫葡聚糖轉化率×100%(1)第1期陳紅梅等:乙醇預處理麥稈的酶解性能研究式中:P2、P。分別為葡萄糖、纖維二糖質(zhì)量濃度,酶用量為20FPU),進(jìn)行預水解24h(水解條件為g/L;x。表示預處理后試樣中葡聚糖含量;1.1是葡50℃、130r/min),隨后按10%的接種量接入釀酒聚糖轉化為葡萄糖的轉化系數;為初始固體質(zhì)量酵母( Saccharomices cerevisiae cicc31014)種子液濃度,g/L。進(jìn)行乙醇發(fā)酵。發(fā)酵溫度為37℃,搖床轉速為1501.3.4半同步糖化發(fā)酵實(shí)驗r/mn。預處理后固體的半同步糖化發(fā)酵(hSSF)在50m三角瓶中進(jìn)行。將預處理后的纖維素固體(固2結果與討論體含量為10%)置于發(fā)酵培養基中,121℃下滅菌2.1預處理后固體主要化學(xué)組成20min,再用濃度為1mo/L的NaOH溶液將液相H2SO4催化和自催化乙醇處理后的麥稈的主要pH調至5.0~5.5,加入纖維素酶液(lg固體纖維素化學(xué)組成如表1所示。表IH2SO催化和自催化乙醇預處理固體主要化學(xué)組成比較Table 1 Main chemical compositions of wheat straw pretreated by sulfuric acid-catalyzed (SAC)andauto-catalyzed(AC) ethanol organosolv processes處理方式固體回收率w(葡聚糖)(木聚糖)(酸溶木素)(酸不溶木素)v(總木素)不經(jīng)處理的原料33.122.822.124.3H2SO4催化乙醇預處理42.15.29.5410.5自催化乙醇預處理17.30.7312.8由表1可知:自催化乙醇處理的固體回收率為50.5%,而酸催化乙醇法處理的固體回收率相對較低,為42.1%。與自催化乙醇處理相比,酸催化處50理的試樣葡聚糖含量更高,而木聚糖和木素含量都蘭出40更低,特別是木聚糖含量顯著(zhù)減少,木聚糖水解率超過(guò)90%。自催化乙醇預處理過(guò)程中木聚糖水解率僅為61.2%。這是因為H2SO4催化乙醇預處理過(guò)程中,添加外源無(wú)機酸促進(jìn)了半纖維素水解。從木50g/吐溫2素含量來(lái)看,H2SO4催化的乙醇預處理后,總木素含上50量下降至10.5%,相應的木素脫除率為81.8%;自催化乙醇預處理后總木素含量為13.5%,相應的木20素脫除率為71.9%。添加無(wú)機酸有利于木素的脫除,這是由于酸濃度較高的情況下更容易使半纖維素和木素之間以及木素分子內的連接鍵斷裂,形成更多的木素碎片01115圖1H2SO催化乙醇預處理麥稈的酶解2.2纖維素的酶解性能Fig. 1 Enzymatic hydrolysis of wheat strawH2SO4催化和自催化乙醇預處理麥稈在10%和pretreated by sulfuric acid-catalyzed15%固體含量及添加不同濃度表面活性劑條件下的(SAC) ethanol organosolv process酶解時(shí)間曲線(xiàn)如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可以看岀,24h之后葡聚糖酶解轉化率無(wú)明顯増加。聚糖轉化率最高可達80%,相應葡萄糖質(zhì)量濃度分H2SO催化乙醇處理麥稈在2種固體含量下葡聚糖別為50.2和79.2g/L的最終轉化率均為70%左右,而葡萄糖質(zhì)量濃度分添加表面活性劑吐溫20和吐溫80對于2種預別為55和η8g/L。對自催化乙醇預處理的麥稈葡處理后固體的酶解性能具有不同的影響。對于生物加工過(guò)程第12卷別是,當固體含量較低時(shí),未與木素結合的表面活性劑更多,對酶活的抑制作用更強烈,導致葡聚糖如轉化率明顯降低。同種表面活性劑中,高濃度的表蘭蓋40面活性劑比低濃度條件下的葡聚糖轉化率稍低也三20驗證了這一點(diǎn)。而自催化預處理后固體的木素含10量較高,因此,表面活性劑對酶解表現為促進(jìn)作用。905g/葉溫20此外,表面活性劑的作用還可能與木素結構有關(guān)5.0g/吐溫20H2SO催化預處理過(guò)程中由于酸濃度較高,更容易這出發(fā)生木素的縮聚反應,因而會(huì )降低木素分子中酚羥基的含量。而文獻報道,酚羥基是木素無(wú)效吸附纖維素酶的一個(gè)主要官能團1.。因此,木素官能團結構的變化可能是表面活性劑對H2SO4催化和自催化預處理后固體具有不同影響的主要原因之一。具體的機制還需進(jìn)一步研究。圖2自催化乙醇處理麥稈的酶解H2SO4催化和自催化乙醇預處理麥稈亦有文獻Fig 2 Enzymatic hydrolysis of wheat straw報道。 Wildschut等在相同條件下對麥稈進(jìn)行pretreated by auto- catalyzed (AC)H2SO4催化乙醇預處理,酶解聚糖轉化率可達ethanol organosolv process89.4%,但其酶解實(shí)驗的固體含量為3%,最終葡萄糖與纖維二糖總質(zhì)量濃度為22.1gL。而本文中H1SO催化乙醇預處理的固體,添加表面活性劑不預處理后酶解葡萄糖最高質(zhì)量濃度可達80.3gL但未能促進(jìn)纖維素的酶解,反而一定程度上抑制了(15%固體含量,未添加表面活性劑)。對于自催化酶解過(guò)程。特別是在10%固體含量的條件下,這種乙醇預處理, Huijgen等在60%乙醇、200℃、保抑制作用更為明顯。而對于自催化乙醇預處理,吐溫60min、固液比1:10(g/mL)的條件下對麥稈進(jìn)溫20和吐溫80對于纖維素的酶解具有明顯的促進(jìn)行預處理,所得纖維素固體的酶解葡聚糖(酶解固作用。例如,當添加0.5g/L吐溫20時(shí),在10%和體含量為3%,其余條件和本文的相同)轉化率僅為15%固體含量下,酶解24h時(shí),葡聚糖轉化率可分52%左右。而本文中,麥稈通過(guò)自催化乙醇預處理別由未添加時(shí)的74.3%提高至81.0%及62.2%提后,最高葡聚糖轉化率高于80%(10%、15%固體含高至75.0%。表面活性劑對于H2SO4催化和自催化量)?？梢?jiàn),筆者所采用的自催化乙醇預處理可以乙醇預處理后的固體酶解性能具有不同影響作用有效提高麥稈纖維素的酶解性能。的現象可能與H2SO4催化和自催化預處理后固體的2.3半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇木素含量及結構有關(guān)。已有的研究表明,表面活性H2SO4催化乙醇處理麥稈半同步糖化發(fā)酵劑提高預處理后纖維素酶解性能主要是通過(guò)降低(hSF)過(guò)程中乙醇濃度和葡萄糖濃度的變化如圖3木素對纖維素酶的無(wú)效吸附來(lái)實(shí)現的121.6m。所示。從圖3中可以看出,表面活性劑的添加對最底物中木素表面有一定數量的位點(diǎn),既可與表面活終乙醇濃度并無(wú)顯著(zhù)影響。在預水解過(guò)程中(前24性劑結合,又可與纖維素酶結合。當表面活性劑用h),葡萄糖濃度迅速增加,接種培養8h后葡萄糖很量達到一定程度時(shí),這些位點(diǎn)全部吸附表面活性快被消耗,相應的乙醇濃度迅速增加。接種培養12劑,從而阻止木素對纖維素酶的無(wú)效吸附,使纖維h后乙醇濃度達到最大,此后乙醇濃度開(kāi)始下降。素酶水解速度和得率提高。進(jìn)一步提高表面活性這種現象可能是因為葡萄糖的產(chǎn)生速率不及其消劑用量反而抑制酶活,降低酶解性能。H2SO4耗速率,酵母菌在饑餓狀態(tài)下開(kāi)始反耗產(chǎn)生的乙催化乙醇處理過(guò)后的固體中木素含量較低,能與表醇,也可能是由于隨著(zhù)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行,乙醇逐步揮面活性劑結合的位點(diǎn)數量有限,因此即使添加少量發(fā)造成的。從圖3中可知,發(fā)酵過(guò)程中乙醇質(zhì)量濃的表面活性劑(例如0.5gL),亦能使木素的結合度最高達到25g/L左右,相當于62.2%的理論位點(diǎn)飽和,且表現出對酶催化過(guò)程的抑制作用。特得率第1期陳紅梅等:乙醇預處理麥稈的酶解性能研究5050100000000■對照●0.5g/60對照●0.5g吐溫205.0g/葉4020608010圖3H2SO催化乙醇預處理麥稈化發(fā)酵圖4自催化乙醇預處理麥稈半同步糖化發(fā)酵過(guò)程中過(guò)程中乙醇和葡萄糖質(zhì)量濃度的變化乙醇和葡萄糖質(zhì)量濃度的變化Fig 3 Ethanol and glucose concentration changes duringFig 4 Ethanol and glucoseration changes duringhssF of wheat straw pretreated by sulfuric acidhSsf of wheat straw pretreated by autocatalyzed(SAC) ethanol organosolv processcatalyzed( AC)ethanol organosolv process自催化乙醇處理麥稈hSSF過(guò)程中乙醇濃度和木聚糖被水解,81.8%的木素被脫除;而自催化預處葡萄糖濃度的變化如圖4所示。從圖4中可以看理過(guò)程中,木聚糖水解率為61.2%,木素脫除率為出,表面活性劑的添加對乙醇的產(chǎn)生有較好的促進(jìn)71.9%。從液相中的糖濃度來(lái)看,2種預處理過(guò)程作用,不僅提高了最終乙醇濃度,而且減小了酵母中木糖濃度均很低,這可能是由于預處理在較為劇菌對乙醇的反耗。在接種培養8h之內,表面活性烈的條件下進(jìn)行,木糖發(fā)生了顯著(zhù)降解。從圖5和劑對乙醇產(chǎn)生的作用不明顯,因為預水解過(guò)程產(chǎn)生圖6還可知:100g麥稈原料通過(guò)酸催化乙醇預處了大量葡萄糖,使得該時(shí)間段內葡萄糖濃度較高,理,最終能得到10.4g乙醇,乙醇得率為理論得率足夠供酵母消耗產(chǎn)生乙醇。接種培養8h后,乙醇的56%;而通過(guò)自催化乙醇預處理,最終能得到濃度增長(cháng)速度緩慢,接種培養24h后乙醇濃度達到1.6g乙醇,乙醇得率為理論得率的62.5%。由此最大。未添加表面活性劑的對照組乙醇質(zhì)量濃度可見(jiàn),二者具有類(lèi)似的乙醇得率。但H2SO催化過(guò)最高為20.1g/L(接種培養24h后),相當于572%程添加了外源無(wú)機酸,會(huì )一定程度上增加設備腐蝕的理論得率;而添加表面活性劑的實(shí)驗組乙醇質(zhì)量性,且H2SO需要中和處理。而自催化預處理需要濃度最高可達2.4g/L(添加5g/L吐溫80,培養更高的溫度,因而要求設備具有更高的耐壓性。因24h),相當于65.4%的理論得率,比對照組提高了此需要進(jìn)一步結合后續產(chǎn)品分離以及設備投資等1.4%。與H2SO催化的預處理相比,自催化預處分析,來(lái)比較二者的經(jīng)濟性。理可獲得類(lèi)似的乙醇濃度和得率。3結論2.4物料衡算進(jìn)一步分析H2SO催化和自催化乙醇處理麥稈通過(guò)比較H2SO4催化、自催化乙醇處理后麥稈的物料衡算,結果如圖5、圖6所示。從圖5和圖6固體的主要化學(xué)組成、酶解性能、半同步糖化發(fā)酵可知:大部分葡聚糖以固體形式回收,并在后續酶生產(chǎn)乙醇特性和物料衡算結果,可以得到以下結解過(guò)程中轉化為葡萄糖。H3SO催化乙醇處理葡聚論:①乙醇預處理能夠以固體形式回收大部分葡聚糖回收率為91.0%,自催化乙醇處理葡聚糖回收率糖,H2SO4催化處理的葡聚糖回收率為91.0%左右為95.4%。H2SO,催化的預處理過(guò)程中,90.3%的自催化乙醇處理的葡聚糖回收率為95.4%。生物加工過(guò)程第12卷100g麥稈原料331g葡聚糖80g木聚糖243g木素酸催化乙醇預處理(L質(zhì)量分數60%的乙醇溶液),離心液體1(539mL)0.09g葡萄糖固體1271g木糖0.71g阿拉伯糖同濃度乙醇溶液(0.5D洗滌,離心0.71g糠醛固體g葡萄糖095g木糖021阿拉伯糖回收乙醇42.13g絕干固體45g糠30.1g葡聚糖2.19g木聚糖443g木素半同步糖化發(fā)酵10.38g乙醇226g木糖圖5H2SO4催化乙醇處理麥稈過(guò)程中的物料衡算Fig 5 Mass balance analysis of sulfuric acid-catalyzed( SAC) ethanol organosolv processe100g麥稈原料33.1g葡聚糖2280g木聚糖24.3g木素自催化乙醇預處理(1L體積分數65%的乙醇溶液).離心液體1(520mL)0g葡萄糖固體10.13g木糖0g阿拉伯糖同濃度乙醇溶液0.5L洗滌,離心0.25g糠醛固體20g葡萄糖0g阿拉伯糖糠醛回收乙醇(271mL31.6g葡聚糖8.73g木聚糖683g木素半同步糖化發(fā)酵1.59g乙醇9g木糖圖6自催化乙醇預處理處理麥稈過(guò)程中的物料衡算Fig 6 Mass balance analysis of auto- catalyzed (AC)ethanol organosolv processe②2H2SO4催化乙醇預處理可更多地水解半纖維素和同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇無(wú)明顯促進(jìn)作用。而對于脫除木素。③添加非離子表面活性劑吐溫20和吐自催化乙醇處理后的麥稈的酶解和半同步糖化發(fā)溫80,對于H2SO催化乙醇處理后麥稈的酶解和半酵具有顯著(zhù)的促進(jìn)作用,最高酶解葡聚糖轉化率可第1期陳紅梅等:乙醇預處理麥稈的酶解性能研究從72.7%提高到85.0%;最高乙醇濃度比未添加表enzymatic cellulose hydrolysis[JJ.J Chem Technol Biot, 2011, 86面活性劑時(shí)提高了11.4%。④物料衡算結果表明,(11):1428-1438H2SO4催化的乙醇預處理和自催化乙醇預處理的麥[9] Xu F, Sun J X, Sun R, et al. 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