乙醇氧化酶法測定血清中乙醇含量

208臨床檢驗雜志2002年第20卷第4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Science2002No.20No.4文章編號:1001-764X2002)40208-03中圖分類(lèi)號R446.1文獻標識碼乙醇氧化酶法測定血清中乙醇含量王向陬嵊州市人民醫院檢驗科浙江嵊州312400摘要:目的建立血清中測定乙醇濃度的乙醇氧化酶法。方法基于乙醇氧化酶氧化乙醇產(chǎn)生乙醛和HO偶聯(lián) Trinder反應生成醌亞胺,可在500m波長(cháng)比色測定通過(guò)優(yōu)化反應體系中各主要成分和測定條件建立了本法。結果本法的靈敏度0.5g/L時(shí)Asmn1m>0.08;線(xiàn)性范圍0.125~5.0g/L.批內CV為1.02%,批間CV為2.76%本泫Y盧氣相色譜泫ⅹ沘較;}=1.06Ⅹ+0.12,=0.989。結論本法的靈敏度較高、線(xiàn)性范圍寬、精密度和準確性均較好適合臨床實(shí)驗室急診測定用關(guān)鍵詞乙醇血清氧化酶法醫院急診室遇疑似急性酒精中毒的患者或交通2.5測定方法自動(dòng)分析的主要參數如下反應類(lèi)管理部門(mén)遇疑有酒后駕車(chē)的對象常常需要測定血中型兩點(diǎn)法反應溫度:3℃波長(cháng):500nn(主)600乙醇濃度。血清沖乙醇濃度測定早期用蒸餾氧化mn次)樣本6團加R1240μ孵育3-5min后法和滲透壓法特異性差20世紀50年代開(kāi)始用醇加RⅡ60l加入RⅡ后延遲1min第一點(diǎn)讀數,脫氫酶法測定60年代報告用氣相色譜測定。我們再過(guò)4min第二點(diǎn)讀數。建立了用乙醇氧化酶(ALO)測定血清中乙醇含2.6比較方法氣相色譜法1標本用血清。量的方法其靈敏度、準確度和線(xiàn)性范圍均較好現3實(shí)驗結果報告于下。3.1緩沖液種類(lèi)和pH選擇乙醇氧化酶較適用的原理緩沖系統為磷酸鹽和Tis,我們用它分別配成血清中乙醇經(jīng)ALO催化生成乙醛和H2O2,7.07.58.08.59.0五種不同pH的緩沖液離子強后者經(jīng) Trinder反應生成紅色醌亞胺于500m波度均為100mo/L按應用試劑加入其他成份分別長(cháng)比色對照標準可計算出乙醇含量反應式如下用一份5g/L的標本測定結果磷酸鹽緩沖液在pHALOD7.5和80時(shí)吸光度最高,lis/HC緩沖液在p8.5CH3 CH2OH +0CH3CHO+H202時(shí)吸光度最高。為了照顧到PO的最適pH和pH穩定性我們采用pH7.5的磷酸鹽緩沖液。HO2+4AF+酚0紅色醌亞胺+4o3.2ALOD的活性濃度選擇分別配制ALOD濃度為500U/L4000U/L,1500U/L和2000U/L2材料和方法21試劑乙醇氧化酸 from Candida sp.),本305.0g/L的標本結果說(shuō)明酶濃度越高反應速Asahi Chemical Industry公司產(chǎn)品辣根過(guò)氧化物酶率越快但在1000U/L時(shí),三個(gè)濃度的標本在5Roche公司產(chǎn)品;-氨基安替比林、酚和磷酸鹽均為國產(chǎn)分析純min內吸光度均呈直線(xiàn)性且有較高的吸光度故選擇此濃度2.2儀器 Hitachi7170自動(dòng)生化分析儀Beckman du640分光光度計2.3應用試劑組成RⅠ:苯酚10mmo/L,磷酸0.30鹽緩沖液100mmol/L,pH7.5;RⅡ:ALO5000U/LPOD1000U/LA-AAP2mmo/L。校準物為1g/L無(wú)水乙醇溶液000L2.4校準物用分析天平精確稱(chēng)取無(wú)水乙醇1gλmm)移至1L量瓶中加去離子水到刻度混勻及時(shí)用安瓿1m分裝圖1本法的吸收光譜掃描結果臨床檢驗雜志2002年第20卷第4期 Chinese Journal of Clinical Laboratory Sciene3波長(cháng)選擇一個(gè)1.0g/L的標本,用本法測人(0.07~0.15g/L均否認飲酒。另33人均最終定顯色后用 Beckman DU640分光光度計掃描結承認飲過(guò)酒,血清中乙醇濃度在0.55~2.42g/L,果見(jiàn)圖1。吸收峰在500m處次波長(cháng)選用600平均1.59g/Lnmlo5討論34反應動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)選擇1.0g/L3.0g/L和1976年 Hadjiioannou等4用脫氫酶法在自動(dòng)5.0g/L的標本,分別用本法測定,觀(guān)察反應動(dòng)力分析儀上測定全血、血清和尿中乙醇含量。為了提學(xué)結果見(jiàn)圖2,說(shuō)明三個(gè)標本在反應時(shí)間5min)高靈敏度Jung等5在醇脫氫酶的基礎上再偶聯(lián)醛內均呈直線(xiàn)上升脫氬酶這樣1分子的乙醇可產(chǎn)生2分子的NADH。Kapur等6在醇脫氫酶基礎上偶聯(lián)黃遞酶使IT3.0g/L還原成甲在可見(jiàn)光比色以提高靈敏度。我們建立的氧化酶法有較高的靈敏度用兩點(diǎn)法測定濃度為0.5g/L時(shí)A50mm>0.08。精密度較好批間CV為2.76%,且和氣相色譜法有良好相關(guān)適合各種類(lèi)型的自動(dòng)分析儀,臨床實(shí)驗室測定非常方便。0血清中乙醇濃度達到0.5-1.0g/L時(shí)可出現0100200300400500600()酒醉的各種癥狀如臉紅、健談、反應遲鈍、視覺(jué)變差因此歐美將血清中乙醇含量≥0.5g/L作為酒圖2本法的反應動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)后駕車(chē)的標準。3.5線(xiàn)性范圍取混合血清1份加入無(wú)水乙醇至血清中乙醇濃度>3.0g/L時(shí)中樞神精系統嚴5.0g/L然后再用同一混合血清稀釋至4.03重損害可出現昏迷,>4.0g/L時(shí)可導致死亡。本2.01.0.50.25和0.125g/L8個(gè)濃度用本法法的線(xiàn)性范圍為0.125~5.0g/L急診檢測已足測定按 NCCLS EP6P文件作線(xiàn)性評價(jià)2]線(xiàn)性回夠。歸方程為Y=0.9864X+0.0045,n=0.991。稀正常值測定時(shí)有不到半數的標本可測出微量的釋變異0.08 for 0. 5 g/L of ethanol the linearity was 0. 125-5.0 g/L; the precisions were1. 02% for within-run CV and 2. 76% for between-run CV. Correlation between the reasults obtained by this method Y )and gaschromatographic method(X)was Y=1.06X+0 12 /=0.989. Conclusion This method had higher sensitivity wide linearitygood precision and accuracy. It is suitable to use for the emergency test of clinical laboratorieKey word ethanol assay i ethanol oxidase method稿日期200109-19修回日期20020527)本文編輯陳維忠)文章編號:1001-764X2002)40210-01中圖分類(lèi)號:R446.3文獻標識碼3流式細胞術(shù)白血病免疫分型中CD45設門(mén)的重要性鞏文玉(首都醫科大學(xué)附屬北京兒童醫院血液中心北京10005)關(guān)鍵詞流式細胞術(shù)白血病免疫分型免疫分型在急性白血病的診斷中起著(zhù)重要作用它具有在白血病細胞膜上抗原的交叉表達和/或缺失現象很特異性強、客觀(guān)等優(yōu)點(diǎn)從而降低了急性白血病形態(tài)學(xué)的誤常見(jiàn)有些交叉是白血病細胞所特有的成為運用FCM檢測診率。但也應注意到所用的試劑質(zhì)量、標本處理及染色方微小殘留病灶的依據2但系統誤差的存在同樣會(huì )產(chǎn)生類(lèi)法等對結果會(huì )產(chǎn)生很大的影響如不進(jìn)行監測有可能導致結似結果假陽(yáng)性或假陰性)此時(shí),只要在成熟淋巴細胞和成果的失真。本文就流式細胞木 flow cytometry FCM)血病熟粒細胞上不存在相同的抗原交叉這種表型結果就是可信免疫分型中CD45設門(mén)的重要性談些體會(huì )的否則就要認真查找原因。值得指出的是正常細胞本身運用FCM檢測白血病細胞免疫表型普遍采用CI45/也存在著(zhù)抗原的交叉如CD10在成熟粒細胞以及CD5在BsC雙對數散點(diǎn)圖( dot plo)對幼稚細胞設門(mén)來(lái)分析其抗原淋巴細胞某一發(fā)育階段上的表達341這種情況并不說(shuō)明試表達情況。白血病標本在CD45/sSC雙對數散點(diǎn)圖上一般劑質(zhì)量或樣本處理方法有問(wèn)題只是這種正常交叉表達的抗可見(jiàn)到三群細跑即成熟淋巴細胞、成熟粒細胞及幼稚細胞,原并不是很多。它們之間相對位置固定不變。對這三群細胞分別設門(mén)可以綜上所述FCM白血病免疫分型結果的室內質(zhì)量評估觀(guān)察其各自抗原的表達情況。成熟淋巴細胞中大部分為T(mén)的關(guān)鍵在于識別岀成熟的淋巴細胞及成熟粒細胞而CD45淋巴細胞B淋巴細胞占一小部分因此此群細胞主要表達設門(mén)技術(shù)為此提供了一個(gè)強有力的手段。在我院檢測的急CD5、CI、CI等T細胞抗原同時(shí)也應有少部分細胞表達性白血病標本中絕大部分標本均能檢測到或多或少的成熟Ⅰ33、CD15、MPO等髓細胞抗原。這兩群成熟細胞為白血100%的標本這說(shuō)明上述方法是確實(shí)可行的?？笴D45單抗病免疫分型結果的室內質(zhì)量評估提供了極有價(jià)值的依據。也因此成為此項工作中必不個(gè)試劑沖情況是成熟淋巴細胞的CD5、CD7、CD19、CID20陽(yáng)性率參考文獻極低或根本無(wú)細胞表達此種情況很可能預示著(zhù)質(zhì)量失控。[1] Lanza f, Latorrace A, Moretti,eal. Comparative analysis ofD3、CD3、MPO也是如此。另一種相反情況是淋巴細胞fferent permeabilization methods for the flow cytometry抗原不僅在淋巴細胞上表達,在成熟粒細胞上也表達measurement of cytoplasmic myeloperoxidase and lysozyme inCD13、CD33、MPO不僅在粒細胞上表達在成績(jì)淋巴細胞上normal and leukemic cell[J]. Cytometry 1997 30(3): 134-144也出現。這兩種情況一般提示免疫分型結果的不可靠需要2 Czuczman Ms, Dodge R K, Stewart Cc,na. value of查明原因重新檢測。前者要注意試劑的效價(jià)、有效期及細胞濃度等因素后者要注意標本處理方法是否得當尤其在eukemia: cancer and Leukemia Group B Study 8364[ J Blood999311)3931-3939檢測胞質(zhì)內抗原時(shí)滲透劑選擇不當或方法不合適非常[3 Joken MR Shal VODattilio K L. et al. Flow cytometric analysis易造成假陰性或假陽(yáng)性結果。 francesco等1)三種不同的of human bone marrow ll Normal B lymphocyte developmen[ J]滲透劑檢測了MPO及溶菌酶這兩種粒細胞顆粒成分在淋巴Bod198775)1316-1324細胞中的表達情況其結果是經(jīng)其中兩種滲透劑處理的正常4] Verstappen L. W, Huang s, Picker I.J,eal. Flow cytometric人淋巴細胞的MPO陽(yáng)性率分別為58.6%、54.0%溶菌酶ssessment of human T-cell differentiation in thymus and bone