降纖酶的聚乙二醇修飾及產(chǎn)物的純化研究

中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals2006,37(4)微生物藥物與生物技術(shù)《噬《《《《《《《《《《司降纖酶的聚乙二醇修飾及產(chǎn)物的純化研究武霞,馮軍,趙文杰上海醫藥T業(yè)研究院,上海20004摘要:研究了降纖酶的聚乙二醇修飾及純化方法。采用正交法考察影響修飾的4個(gè)因素,確定了最佳條件。利用分子篩柱色譜得到了較高酶活力保留的修飾產(chǎn)物, SDS-PAGE檢測為單一條帶。關(guān)鍵詞:降纖酶;聚乙二醇:正交實(shí)驗:純化中圖分類(lèi)號:TQ464:8文獻標識碼:A文章編號:1001-8255(2006)04-023404降纖酶( defibrase,Df已在臨床廣泛應用,如分子篩柱色譜分離:色譜柱 Superdex75柱;流去纖、抗凝、降脂、擴張血管和改善微循環(huán)等。但動(dòng)相005 mol/L NazHPO- NaH2PC2緩沖液(pH7.0A作為異源蛋白,Df在使用中不可避免地具有蛋白質(zhì)檢測波長(cháng)215m;流速0.3ml/min。收集0.5m管。類(lèi)藥物的共同缺點(diǎn),如具免疫原性、半衰期短、穩定HPLC測定:色譜柱 Waters Symmetry300c性差等23。聚乙二醇(PEG)修飾技術(shù)4是近年來(lái)發(fā)柱(39mm×150mm,5um);流動(dòng)相A:0.1%三展的用于改進(jìn)蛋白質(zhì)類(lèi)約物體內藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的氟乙酸、B:乙腈-0.1%三氟乙酸(9:1);梯度洗新技術(shù),它將單甲氧基PEG分子(mPEG)鍵合到蛋脫:0~18min,流動(dòng)相B20%~70%,18白質(zhì)分子表面改變蛋白質(zhì)的空間結構,進(jìn)而改變其20min,流動(dòng)相B70%~50%;檢測波長(cháng)215nm;生化性質(zhì)。此法可有效降低蛋白質(zhì)的免疫原性,延長(cháng)柱溫37℃;流速1.0ml/mins半衰期,減少給藥次數56。本研究考察了PEG修SDS-PAGE電泳:參考文獻1。分離膠125%飾Df的條件及目標產(chǎn)物的純化。濃縮膠4%。1儀器與試藥22Df的修飾反應10AKTA explorer蛋白質(zhì)分離純化儀、 SDS-PAGE儀均取1mg/ml的Df溶液2ml與02 mol/L NaH2POAmersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品;高效液相色譜儀 Na2HPO緩沖液(pH6.5)4m混合,加入 mPEG-SPA( Waters公司); AllegraMX22 R Centrifuge冷凍離心機5k固體6mg溶解,混勻,37℃反應60min。反應( Beckman Coulter Th公司):超濾器( Millipore公司)。前后分別取適量混合液以pH74的Tris溶液稀釋,Df(M138k,河南省中泰藥業(yè)有限公司)mPEG-SPA測定酶活力,計算酶活力保持率。加入甘氨酸3g終M5k、30k,丙酸甲氧基聚乙二醇琥垍酰亞胺酯)、mPEG止反應。超濾(截留分子量10000至05m,待分離SBA(酸甲氧基聚乙二醇琥酰亞胺酯)均為美國 Shearwater純化,產(chǎn)物記作mDf5k。公司產(chǎn)品另以 mPEG-SPA30k、 mPEG-SBA分別進(jìn)行D2方法與結果的修飾反應,方法同上。產(chǎn)物分別記作mDf30k和21主要測定方法MmDf-SBA蛋白質(zhì)濃度測定:采用 Lowry法[。23Df的PEG修飾條件選擇Df活性測定:參照衛生部約典委員會(huì )頒布標準將影響修飾結果的4個(gè)影響因素:反應緩沖液(試行)測定。pH(A)、Df與PEG的摩爾比(B)、反應時(shí)間(C)和反應行3水平正交實(shí)驗,其體設計見(jiàn)作者簡(jiǎn)介,武霞(197),女,碩士研究生,專(zhuān)業(yè)方向:微生表1中國煤化工持率和修飾率來(lái)確物與生化藥學(xué)。定最CNMH3)量通過(guò)分子篩柱Tel:021-62479808×426E-mail:wuxia202@@163.com色譜圖中的面積計算。中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese journal of pharmaceuticals2006,37(4)表1L(3)的因素水平表產(chǎn)物為混合物,故未進(jìn)行修飾反應條件的篩選。因素24修飾產(chǎn)物的純化D/℃A5052.41SDS-PAGE電泳驗證修飾產(chǎn)物l:10分別對各修飾反應產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE電泳輸證,見(jiàn)圖1A~C。mPEG-SBA修飾Df的產(chǎn)物電泳試驗結果表明,在pH65、Df與PEG摩爾比圖上出現數條M增大的條帶; mPEG-SPA5k修飾為1:20、反應時(shí)間h、溫度37℃的條件下,產(chǎn)Df的電泳圖上則有一條M1增大的條帶,M,約為物可保持較高酶活力,且修飾率最高。產(chǎn)物mDf43k;mPEG-SPA30k修飾Df的電泳圖上有條Mr5k的酶活力保持率53%、修飾率46.7%。mDf30k增幅更明顯的條帶(圖1C),M約為97k的酶活力保持率469%、修飾率38.2%。因 mDE- SBA323497.4k43.0k97.4k43.0k3l.0k31.0k20.lk20.lk4.4k20.lk14.4k二14.4k1—Df:2一標準分子量蛋白1一標準分子量蛋白;2-Df;1-標準分子量蛋白;2-Df3—修飾反應液3修飾反應液;4-mDf5k3-修飾反應液圖1Df與 mPEG-SBA(A)、 mPEG-SPA5k(B)、 mPEG-SPA30k(C)的修飾反應電泳圖242 Superdex75分子篩柱色譜應液經(jīng)分子篩柱色譜分離后,所得色譜圖見(jiàn)圖2。Df的 mPEG-SPA5k和mPEG-SPA30k修飾反MAU 4000A:mPEG-SPA5k修飾反應液,B:mPEG-SPA30k修飾反應液Df: 2--mDf 5k: 3--mDf 30k圖2修飾反應液的分子篩柱色譜圖譜24.3HPLC分析取柱色譜分離后收集的單一峰濃縮,再進(jìn)行分別取Df、柱色譜分離后收集的mDfk、 mDf SDs中國煤化工4.1”項下類(lèi)似:30k純品適量,按照“2.1”項下條件進(jìn)行 HPLC mPlCNMH Gk修飾Df分別得到分析,色譜圖見(jiàn)圖3。M約內4500U、y/UU的廣砌mDf5k、mDf30k。244SDS-PAGE電泳驗證純化產(chǎn)物3討論236中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese Joumal of Pharmaceuticals200,37(4)AU0.2510.058101214|618204681012141618208101214161820A:Df,B:mDf5k收集液,C:mDf30k收集液1--Df: 2-mDf 5k: 3--mDf 30k圖3HPLC色譜圖mPEG-SBA修飾Df所得的mD是多位點(diǎn)、多(2王峰,張華李成建去纖酶的不良反應]圖藥導報,分子量的(如圖1A)。而用SDS-PAGE、分子篩柱2002,21:136.色譜和HPLC3種方法共同驗證得到結論:mPEG-[3]鄭萬(wàn)剛降纖酶不良反應12例分析蛇志,199(3):32SPA修飾Df可以得到純度較高的mDf。 mPEG-SPA[4] Bures P, Huang Y,orlE,etal. Surface modifications and5k修飾產(chǎn)物的M約為4300,符合Df與mPEG-SPAmolecular imprinting of polymers in medical and5k之和; mPEG-SPA30k的修飾產(chǎn)物在電泳圖譜上pharmaceutical applications[J]. J Controlled Release, 200172(1-3):25-33.的M卻遠高于Df與 mPEG-SPA30之和,可能有[5] Zalipsky S Chemistry of polyethylene glycol conjugates兩個(gè)原因:一是由于線(xiàn)狀PEG分子伸展在蛋白表biologically active molecules[J]. Adv Drug Deliv Rev,面,使蛋白泳動(dòng)速率降低;另一原因可能是PEG的16:157-182.水化程度非常高,故在 SDS-PAGE上表現異常。[6] Francis GE, Fisher D, delgado o,ernl. Pegylation of cytokine據文獻報道11,蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的PEG修飾中,and other therapeutic proteins and peptides: the importance經(jīng)常遇到的問(wèn)題是反應產(chǎn)物不均一,包括分子量大of biological optimization of coupling techniques[J]. Int J小不一、修飾位點(diǎn)各異等,且在修飾過(guò)程中酶活力降Hematol,1998,68(1):1-18低較多。Wang等(2在進(jìn)行人重組干擾素α2b的PEG[7]李建武蕭能賡,余瑞元等生物化學(xué)實(shí)驗原理和方法[M]第二版,北京:北京大學(xué)出版杜,1997.168-170修飾時(shí),產(chǎn)物多達13個(gè),修飾后酶活力最高僅為[8] Amersham Pharmacia Biotech. Protein electrophoresis tech37.0%,最大修飾率僅為478%。而本研究在最佳nical manual [M]. USA: Amersham Pharmacia Biotech. 13.修飾條件下得到單一的修飾產(chǎn)物,mDf5k酶活力可保持53%,修飾率為46.7%。mDf30k酶活力保9] Kinstler OB, rems Dv, Lauren sl,etal. Characterization持率為469%,修飾率為38.2%。因PEG分子量and stability of N-terminally PEGylated rhG-CSFUJ].Pharm的增大,進(jìn)一步影響了酶活中心的正常功能,使酶活Res,1996,13(7):9-1002力保持率降低。本研究組將在后期工作中,對修飾產(chǎn)10李偉軍林炳承蘇志國聚乙醇共價(jià)修飾藥用蛋白質(zhì)的分析方法[].分析化學(xué),2001,29(2):228-231物酶的理化性質(zhì)、免疫原性、半衰期等進(jìn)行進(jìn)步試[11] Roberts MI, Bentley MD, Harris JM. Chemistry for peptide驗,考察其能否最終成為Df的改良藥物,達到更好and protein PEGylation [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2002,$4療效(4):459476.[12] Wang YS, Youngster S. Grace M. etal. Structural and biologi參考文獻:中國煤化工 binant interferon al1]張惠,干永茂.降纖酶的臨床應用[J.現代中西醫結合雜CNMHGons[J]. Adv Drug Deliv志,2003,12(12):1323.Rev,2002,54(4):547-570.中國醫藥工業(yè)雜志 Chinese joumal of pharmaceutica0037(4還原型谷胱甘肽的金屬螯合親和色譜純化潘飛,邱雁臨*(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,湖北武漢430068)摘要:制備了以殼聚糖為載體的金屬螯合親和色譜分高純化還原型谷胱肽(GSH)。研究了pH、銨離子濃度等對GH洗脫的影響。根據試驗結果確定洗脫液為pH42、0.0molL磷酸鹽緩沖液(含05 moIL NHC),所得GSH純度可達498%平均提取率為679%關(guān)鍵詞:還原型谷胱甘肽;金屬螯合親和色譜:殼聚糖中圖分類(lèi)號:Q516文獻標識碼:A文章編號:10018255(2006)040237-03谷胱甘肽是由L·谷氨酸、L·半胱氨酸和甘氨得到富含GSH的酵母抽提液。另以殼聚糖為載體、酸縮合而成的含巰基的生物活性三肽化合物,有還Cu2+為配基制得金屬螯合劑,以酵母抽提液上柱分原態(tài)(GSH)和氧化態(tài)(GSSG)兩種lGSH有多種離,考察了洗脫條件對純化結果的影響。生理功能,對維持生物體內適宜的氧化還原環(huán)境尤1儀器與試劑為重要2),臨床用于中毒性和感染性肝炎的治療3LC6A型高效液相色譜儀(日本島津); Nexus傅里葉變有機物及重金屬的解毒、癌癥輻射和化療的保護換紅外光譜儀(美國 Nicolet公司);722型可見(jiàn)分光光度計等46。殼聚糖是天然的氨基多糖,生物相容性與(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。吸附性均較好,可直接或經(jīng)修飾后用作各種色譜和啤酒酵母泥(華潤集團武漢東兩湖啤酒公司);殼聚糖蛋白質(zhì)分離純化的載體門(mén)。金屬離子親和色譜是新(市售,分子量270k,脫乙酰度8722%);亞氨基二乙酸興的色譜技術(shù),利用Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+鈉、5,5·二硫二(2-硝基苯甲酸)(DTNB);GSH對照品等金屬離子與蛋白質(zhì)表面的組氨酸、色氨酸或半胱( Sigma公司,含量98‰);Tris生化試劑( Amresco公司);氨酸配位結合,由于氨基酸種類(lèi)、數量、位置及庚烷磺酸鈉(美國 Regis公司):其余試劑均為分析純?？臻g構象不同,故與金屬離子親和力大小不同,從2方法與結果而選擇性地分離純化81。2.1GSH提取液的制備本研究通過(guò)對啤酒酵母的預處理及細胞破碎啤酒酵母泥經(jīng)預處理(包括過(guò)篩、除雜)得到純凈的啤酒酵母后,按1:2(w/)的比例將0.5%對收稿日期:2005-08-11基金項目:湖北省教育廳重大項目(20032001)羥基苯甲酸丙酯溶液加至菌體中,30℃、pH5作者簡(jiǎn)介:潘飛(1980),男,碩上研究生,專(zhuān)業(yè)方向:多肽攪拌3h9。離心(1000min10min,上清液加入藥物Tel:013277053767絮凝劑殼聚糖使其終濃度為0.1%(w/ν),攪拌E-mail:pf_sky@@163.com通訊聯(lián)系人;邱雁臨(1942),女,教授,博士生導師,從事再10min,離心(1000min)10min后取上清液備用生資源的微生物轉化研究Tel:0278801642122親和色譜劑的制備殼聚糖3g溶于1%乙酸溶液100ml,攪拌2h啗嗡哈嗡吼吼吼嗡吼吼嗡嗡嗡嗡嗡嗡吼吼吼吼嗡吼吣吣Defibrase Modified by Peg and It's PurificationWU Xia FENG Jun, ZHAO Wen-JieShanghai institute of Pharmaceutical IndustABSTRACT: Defibrase modified by polyethylene glycol (PEGdetermined by orthogonal experiments. The PEGlation defibrase witYHs200040中國煤化工ed. Four factors wereCNMHGied by molecular sievelumn chromatography, and showed a single band on SDs-PAGEKey Words: defibrase; polyethylene glycol; orthogonal experiments; purification