橡實(shí)制備燃料乙醇菌種篩選及工藝考察

安徽農業(yè)科學(xué), Joumal of Anhui agri.Sci.2012,40(34):16722-16724賚任編輯宋平責任校對況玲玲橡實(shí)制備燃料乙醇菌種篩選及工藝考察趙曉鋒!,張全2,姚秀清},王鐘熠!,佟明友2(1.遼寧石油化工大學(xué),遼寧撫順11301;2撫順石油化工研究院,遼寧撫順113001)摘要〔目的]篩選適宜的橡實(shí)制備燃料乙醇的箇種,并優(yōu)化該發(fā)酵冮芑。[方法]以樟實(shí)粉為原料,篩選適宜的燃料乙醇發(fā)酵菌株,并對該工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。[結果]釀酒酵母FE-B是一株高效的耐受單寧中溫菌株。以橡實(shí)粉制備燃料乙醇,當液化溫度為95℃,乳液濃度為32%,液化pH為5.8,液化酶用量0.·6%,糖化酶用量0.05%,發(fā)酵溫度為36℃時(shí),可獲得較高產(chǎn)率的燃料乙醇。[結論]在纖維乙醇生產(chǎn)技術(shù)尚不成熱的前提條件下,為了發(fā)展非糧燃料乙醇,利用野生淀粉資源橡實(shí)發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇是一種很好的選擇。關(guān)鍵詞橡實(shí);燃料乙醇;釀酒酵母;工藝中圖分類(lèi)號S216文獻標識碼A文章編號0517-6611(2012)34-16722-03Screening of the Strain for Acorn Producing Fuel Ethanol and Fermentation Process OptimizationZHAO Xiao-feng et al University of Liaoning Petroleum and Chemical Technology, Fushun, Liaoning 113001)Abstract [Objective] The research aimed to screen suitable strain for acorn producing fuel ethanol and optimize the fermentation processMethod] Acorn powder as material, suitable strain for producing fuel ethanol was screened, and the process condition was optimized. Re-sult] Saccharomyces cerevisiae FE-B was an efficient mid-temperature strain with tannin tolerance. Acom powder as material to produce fuelethanol, when liquefaction temperature was 95 C, emulsion concentration was 32%, liquefaction pH was 5.8, liquifying enzyme amount was0. 06%, glucoamylase amount was 0. 05%, fermentation temperature was 36C, we could obtain high-yield fuel ethanol. Conclusion]Un-der the premise that cellulosic ethanol production technology was not mature, to develop non-grain fuel ethanol, it was a good selection for u-sing acorn to produce fuel ethanolKey words Acom; Fuel ethanol; S. cerevisiae; Process燃料乙醇指作為燃料添加到汽油中的乙醇,可部分替121℃滅菌20mn,冷卻至60℃左右時(shí),加入0.05g/L的代石油,緩解石油資源短缺。燃料乙醇既是一種清潔能源,TrC,備用。中溫(40℃)酵母菌篩選平板(HRS):雙層培又是一種良好的汽油增氧劑和辛烷值調和組分,用以代替四養基平板底層為YPD固體培養基,上層為T(mén)C培養基乙基鉛和甲基叔丁基醚(MIBE)或乙基叔丁基醚(ETBE)21。1.2儀器設備高效液相色譜、H-601超級恒溫水浴、從生物質(zhì)光合作用、生物質(zhì)制燃料乙醇到乙醇燃燒的過(guò)程,D25W電動(dòng)攪拌器、雙層玻璃反應器(1、2L)、SBA生物傳在自然界形成了CO2的閉合循環(huán),可緩解地球的溫室效應,感器。燃料乙醇還可降低汽車(chē)尾氣污染,因而燃料乙醇具有重要的1.3橡實(shí)燃料乙醇制備工藝橡實(shí)仁→粉碎→單寧提取生態(tài)、環(huán)保意義。汽油中乙醇的體積分數低于10%-15%→調配乳液→液化→糖化→發(fā)酵→蒸餾→燃料乙醇。時(shí),不僅不需對現有汽車(chē)發(fā)動(dòng)機進(jìn)行改進(jìn),且汽油還具有辛1.4分析方法烷值高和抗爆性好的優(yōu)點(diǎn)3,因而燃料乙醇已在世界許多1.4.1葡萄糖濃度和乙醇濃度的測定。采用液相色譜法國家廣泛應用推廣力度不斷加大。發(fā)展燃料乙醇的關(guān)鍵是色譜條件:采用糖柱,超純水為流動(dòng)相流速0.5m/mn,柱實(shí)現非糧酒精的規?；?降低生產(chǎn)成本溫65℃,檢測器溫度40℃。橡實(shí)是殼斗科( Fagaceae)植物種仁的總稱(chēng)。我國橡1.42基因測序。委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公實(shí)資源豐富,品種繁多,年產(chǎn)橡實(shí)大約為6×10~7×10kg,司( Sangon)。且橡實(shí)中含有大量的淀粉。橡實(shí)雖然營(yíng)養豐富,但可食用1,4.3菌株種屬檢測。委托中國微生物菌種保藏管理委員性差是重要的潛在淀粉。利用橡實(shí)為原料制備燃料乙醇則會(huì )普通微生物中心( CGMCC)是一條很好的途徑,對維護國家糧食安全有重大的意義1.5菌種篩選方法樣品采集→富集培養→耐受中溫馴1材料與方法1,1試驗材料橡實(shí)粉來(lái)自撫順金宇食品有限公司收購的化→梯度稀釋、涂布平板、培養→挑選單菌落、斜面純種培養→搖瓶發(fā)酵篩選→獲得中溫釀酒酵母→耐受單寧馴化→梯橡實(shí)仁,磨漿,沉淀,洗滌,干燥,最后得到橡實(shí)淀粉;菌種是釀度稀釋、平板分離培養→挑選單菌落斜面純種培養→搖瓶酒酵母 Saccharomyces cerevisiae FE-B;液化酶為耐高溫a-淀粉酶 Liquozyme Supra2.2x;糖化酶為β-淀粉酶 Suhong gA475。發(fā)酵篩選→獲得耐受單寧的高效中溫釀酒酵母。YPD培養基:蛋白胨2%,酵母膏1%,葡萄糖2%,pH1.5.1平板分離初篩。稀釋40℃條件下多次馴化的米酒6.0(固體培養基加瓊脂1.5%~2.0%),121℃滅菌20min酒曲培養物,YPD固體平板上涂布,40℃靜置培養48h后,備用。T℃C培養基:葡萄糖0.5g,瓊脂1.5g,水100ml將TTC上層平板培養基(冷卻到45℃)傾倒于YPD固體培養基表面厚度幼然后皆干40℃保溫,比較菌落顏色深淺,將所作者商介土結(3=),男,古林白山△,項士研究生,研究方向:復篩中國煤化工培養基中進(jìn)行CNMHG收稿日期201209-11L.5.2搖瓶發(fā)酵復篩。將初篩平板上挑選的菌落共50個(gè)40卷34期趙曉鋒等橡實(shí)制備燃料乙醇菌種篩選及工藝考察16723分別轉接到葡萄糖發(fā)酵培養基搖瓶中,40℃兼氣發(fā)酵培養。FE-B酵母菌,發(fā)酵48h。測試料液不同濃度對橡實(shí)淀粉發(fā)測定發(fā)酵液中的殘糖和乙醇濃度,篩選乙醇濃度高,殘糖少酵乙醇的影響結果見(jiàn)圖2。從圖2可知,發(fā)酵48h后,發(fā)酵的菌株轉接斜面,4℃冰箱保存備用。。液中的殘糖濃度分別為0.2%、0.2%和0.3%,乙醇濃度分別2結果與分析為6.0%75%和9.0%?？梢?jiàn),經(jīng)過(guò)48h發(fā)酵后,體系中的21菌種分離篩選及鑒定取搖瓶篩選的中溫釀酒酵母葡萄糖基本上消耗完畢,產(chǎn)生的乙醇濃度隨著(zhù)橡實(shí)粉乳液濃接入到含有0.125g/L橡實(shí)栲膠的YPD培養基中,40℃培度的增大而增大。但乙醇單耗隨橡實(shí)粉乳液濃度的增加呈養24h,再取該培養液Iml轉接到新鮮的含0.250g/L橡實(shí)上升趨勢,橡實(shí)粉乳液濃度為24%、32%和40%的條件下,單栲膠的YPD培養基中,40℃培養24h。逐步提高YPD中橡耗分別為3.683.%和4.16t橡實(shí)粉/t乙醇。從橡實(shí)淀粉的實(shí)栲膠的濃度到1.000g/L,每24小時(shí)接種傳代一次,40℃利用率考慮,24%橡實(shí)粉乳液濃度單耗最低,但是再考慮到培養,馴化中溫釀酒酵母耐受單寧的能力。經(jīng)過(guò)若千代馴化發(fā)酵液中最終乙醇的濃度越低,后續分離提濃乙醇所需要的后,選擇生長(cháng)旺盛、產(chǎn)氣豐富的酵母菌培養物進(jìn)行梯度稀釋,能耗越高,因此從乙醇單耗和發(fā)酵液乙醇濃度綜合考慮,橡涂布分離平板進(jìn)行分離純化,挑取在平板上生長(cháng)快速的單菌實(shí)粉乳液的濃度為32%比較合適。落,利用搖瓶進(jìn)行復篩,最后篩選獲得一株高效的耐受單寧中溫釀酒酵母F-B。通過(guò)對FE-B菌株的生理生化分析以及26 S rDNA D/D2基因測序,與 Genbank上的相關(guān)基因進(jìn)行比對分析,確定FE-B的種屬名為釀酒酵母。2.2橡實(shí)粉粘度特性考察考察了橡實(shí)粉的乳液的粘度隨溫度的變化曲線(xiàn)。取10g橡實(shí)粉(≤100目),加入100ml自來(lái)水,配制成橡實(shí)粉乳液,緩慢加熱,隨時(shí)記錄乳液的粘度值,如圖1所示。從圖1可知,溫度在80℃以下,橡實(shí)粉乳液的粘度值變化不大,基本保持在比較恒定的值(4-10橡實(shí)乳液度%mPa·s);80℃開(kāi)始,粘度值開(kāi)始急劇上升,峰值溫度范圍在圖2不同橡實(shí)粉乳液濃度體系精化液發(fā)酵乙醇和殘糖含量80.0-91.5℃,最大值為40mPa·s,隨后開(kāi)始下降。這一現25液化pH對橡實(shí)淀粉發(fā)酵乙醇的影響利用100ml三象與趙文恩等報道的橡實(shí)淀粉乳液粘度峰值溫度范圍約為角瓶作為反應器配制32%的橡實(shí)粉乳液(橡實(shí)粉初始含水85~90℃近似”。同時(shí),考慮到液化酶的酶解溫度范圍,因量10.1%)液化酶用量0.06%,液化時(shí)間2h,液化溫度95此在橡實(shí)淀粉制備燃料乙醇工藝中,其液化溫度為95℃?！?糖化pH4.5,糖化酶用量0.05%,糖化時(shí)間64h,糖化溫度58℃,1~4號試驗液化pH分別為525.5、5.8和6.0。糖化液經(jīng)過(guò)EE-B發(fā)酵48h。測試不同液化pH對橡實(shí)淀粉發(fā)酵乙醇的影響,結果見(jiàn)圖3。從圖3可知,32%的橡實(shí)粉乳液在pH分別為5.25558和6.0條件下進(jìn)行液化,然后糖化糖化液經(jīng)過(guò)FE-B發(fā)酵48h,生成的乙醇濃度分別為7.5%7.0%75%和75%。除了pH為55產(chǎn)生的乙醇濃度稍低,其余3個(gè)pH條件產(chǎn)生的乙醇濃度相同?？梢?jiàn),液化pH對最終乙醇發(fā)酵的產(chǎn)率影響不大,不過(guò)為了發(fā)揮液化溫度℃酶的最大效率液化pH保持在58比較合適。圖1橡實(shí)粉的粘度特性2.3單寧對FE-B發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響以過(guò)夜培養的FEB培養物為種子,接種到5個(gè)裝有100ml葡萄糖發(fā)酵培養基的250ml三角瓶中,接種量為1%。5個(gè)三角瓶中分別加7.3入橡實(shí)栲膠(含單寧50%以上)0、0.125、0.2500.500和1.000g/L,36℃培養產(chǎn)乙醇。48h后,采用SBA生物傳感器7.1測定發(fā)酵液中的乙醇濃度。結果表明,0.125-1.000g/L的橡實(shí)栲膠對F-B發(fā)酵生產(chǎn)乙醇沒(méi)有影響,經(jīng)過(guò)48h發(fā)酵發(fā)酵液中的乙醇濃度與對照體系(不加橡實(shí)栲膠)相同,都為圖3橡實(shí)粉乳液不同pH條件下液化對最終發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響7%(w/)。2.6橡實(shí)淀粉化_田是的定利用100ml2.4料液濃度對橡實(shí)淀粉發(fā)酵乙醇的影響利用100三角瓶作為反中國煤化(橡實(shí)粉初始含三角瓶作為反應器,分別配制24%、32%和40%的橡實(shí)粉乳水量10.1%),CNMH化溫度95℃,糖液(橡實(shí)粉初始含水量10.1%),經(jīng)雙酶法液化糖化后,接入化條件和“2.5”中的相同,1-3號試驗液化酶的加入量分別16724安徽農業(yè)科學(xué)2012年為0.04%0.06%和0.08%。糖化液中分別接入FE-B酵28不同溫度對FE-B生產(chǎn)乙醇的影響以過(guò)夜培養的母菌,置于30℃條件靜置發(fā)酵48h,測定發(fā)酵液中的乙醇濃FE-B培養物為種子,接種到4個(gè)裝有3L葡萄糖發(fā)酵培養度,見(jiàn)圖4。從圖4可知,發(fā)酵48h后,生成的乙醇濃度分別基的5L發(fā)酵罐中,接種量為1%。分別于28、3642和48℃為7.0%、7.5%和7.5‰%。體系的最終乙醇產(chǎn)生量隨液化酶培養產(chǎn)乙醇,定期采用液相色譜法測定培養液中的殘糖、乙的加入量呈上升趨勢,酶加入量增加到0.06%時(shí),乙醇產(chǎn)生醇和乙酸,如圖6所示。從圖6可知,FE-B在28、36和42量趨于穩定;液化酶加入量為0.06%和0.08%時(shí),發(fā)酵液中℃發(fā)酵24h,發(fā)酵液中的乙醇濃度分別為8.0%、8.1%和的乙醇濃度都為7.5%。為了降低液化酶的使用成本,在橡3.3%;48℃條件下不能發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。因此,發(fā)酵溫度為實(shí)粉乳液中加人0.06%的液化酶比較合適。36℃比較合適。8.7.56求=惻如爾0.0n35化酶加入量∥%溫度H℃圖4橡實(shí)粉乳液中加入不同液化酶量對最終發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響圖6F-B在不同溫度培養24h后葡萄糖、乙醇和乙酸濃度27糖化酶用量對橡實(shí)酒精發(fā)酵的影響取已經(jīng)液化的3結論液化乳液330g,分裝到5個(gè)250ml三角瓶中,糖化酶用量分通過(guò)對F-B菌株的生理生化分析,確定FE-B是一別為0.03%、0.05%、0.08%、0.10%、0.12%,糖化pH4.5,株高效的耐受單寧中溫釀酒酵母。以橡實(shí)粉制備燃料酒精,糖化時(shí)間64h,糖化溫度58℃。糖化64h后,分析糖化液中當液化溫度為95℃,乳液濃度為32%,液化pH為5.8,液化葡萄糖濃度,見(jiàn)圖5。葡萄糖濃度越高,乙醇產(chǎn)率也隨之升酶用量0.06%,糖化酶用量0.05%,發(fā)酵溫度為36℃時(shí),獲高。從圖5可知,酶加入量為0.05%時(shí),糖化液的葡萄糖濃得的燃料乙醇產(chǎn)率較高。在纖維乙醇生產(chǎn)技術(shù)尚不成熟的度達到最高,為15%,因此,在橡實(shí)乳液中加入0.05%的糖化前提條件下,為了發(fā)展非糧燃料乙醇,利用野生淀粉資源橡酶比較合適。實(shí)發(fā)酵生成燃料乙醇是一種很好的選擇。參考文獻[1] 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