合成氣發(fā)酵生產(chǎn)乙醇菌株的篩選

網(wǎng)絡(luò )優(yōu)先數字出版時(shí)間:2014-4-01網(wǎng)絡(luò )優(yōu)先數字出版地址http://www.cnkinet/kcms/doi/10.13656/j.cnkigxkx.20140401.002.html廣西科學(xué) Guangxi Sciences2014,21(2):124~128合成氣發(fā)酵生產(chǎn)乙醇菌株的篩選ˇScreening of a Microbial Strain Capable of producingEthanol from Syngas fermentation郭鈴,黃艷燕,潘麗霞,李檢秀,孫菲菲,孫靚,黃日波GUO Ling HUANG Yan-yan, PAN Li-xia, LI Jian-xiu, suN Fei-fei, SUN LiangHUANG Ri-bo(廣西科學(xué)院,非糧生物質(zhì)酶解國家重點(diǎn)實(shí)驗室,國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)硏究中心,廣西生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化工程院,廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗室,廣西南寧530007)(Guangxi Academy of Sciences, State Key Laboratory of Non-Food Biomass and Enzyme Technology, National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery, Guangxi Biomass Industrialization Engineering Institute, Guangxi Key Laboratory of Biorefinery. Nanning, GuangXi, 530007, China)摘要:【目的】從動(dòng)物糞便樣品中分離能利用合成氣生產(chǎn)乙醇的菌株,并對其進(jìn)行鑒定及初步發(fā)酵實(shí)驗,為工業(yè)利用合成氣生產(chǎn)乙醇奠定理論基礎?！痉椒ā坷酶患Z化培養技術(shù),以合成氣為唯一碳源,分離篩選合成氣利用菌,通過(guò)形態(tài)觀(guān)察、生理生化實(shí)驗及16 SrrNA序列分析鑒定菌株,并利用菌株進(jìn)行初步發(fā)酵實(shí)驗?！窘Y果】分離到1株可以發(fā)酵合成氣生產(chǎn)乙醇的菌株,分子鑒定結果表明,該菌株為 Clostridium ljungdahlia。生理生化分析結果顯示:該菌是嚴格厭氧型革蘭氏陽(yáng)性菌,短桿狀,有運動(dòng)性,芽孢很少見(jiàn),生長(cháng)必須因子包括酵母粉和維生素B族;最適碳源為果糖,最適生長(cháng)溫度35~37℃,最適pH值為6.0~7.0。合成氣發(fā)酵實(shí)驗結果顯示:37℃厭氧靜止發(fā)酵30d,乙醇最高產(chǎn)量達到2.58g/L,添加BESA、莫能菌素、丁基橡膠顆?？梢允挂掖籍a(chǎn)量分別提高49%、70%、4.3%,最大產(chǎn)量達到4.31g/L?！窘Y論】從動(dòng)物糞便中分離到1株( lostridium ljungdahlii,該菌能夠利用合成氣生產(chǎn)乙醇,為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)新型生物質(zhì)材料提供了基礎資料。關(guān)鍵詞:合成氣厭氧發(fā)酵梭狀芽孢桿菌乙醇中圖分類(lèi)號:Q939文獻標識碼:A文章編號:1005-9164(2014)02-0124-05Abstract: (ObjectiveITo isolate and identify a microbial strain capable of producing ethanol fromsyngas fermentation from animal waste. I Methods] The enrichment culture using syngas as thesole carbon source was utilized to isolate the strain, which was identified according to the observation of morphology, physiological and biochemical tests, and analysis of 16S rRNa genesequences. The isolated strain was utilized for preliminary fermentation. [Results] A strain capable of fermenting syngas into ethanol was isolated successfully. The strain was identified asClostridium ljungdahlii, which is a strictanaerobe and gram-positive. The cells are rod收稿日期:2013-11-29shaped and show motility; spores are formed修回日期:2014-01-24frequently; the strain requires a minimum level作者簡(jiǎn)介:郭鈴(1983),男,碩士,主要從事微生物發(fā)酵與酶 I of yeast extract(0.1%)andB- vitamins for程研究growth; substrate optimum is fructose; temper廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費項目(11Y24sW12、 ature opt中國煤化工; pH optimum11YJ24SWo1),廣西自然科學(xué)基金項目(2013 GXNSFBA019089)range Isntation revealshat undCNMH Ghe highest yield,通信作者:黃日波(1958),男,教授,博土生導師,主要從事 of ethanol in serum bottles at37cwas2.58g分子酶工程研究。 Email: ruhuang@gafter 30d i by addition of besa, monensin andbutyl rubber particles yields of ethanol can in-124Guangxi Sciences, Vol 21 No. 2. April 2014crease 49 %. 70% and 4.3%, respectively, with the highest yield of ethanol at 4.31g/L.IConclusion] Clostridium ljungdahlii was capable of producing ethanol from syngas fermentationKey words: syngas, anaerobic fermentation, Clostridium ljungdahlii, ethanol【研究意義】隨著(zhù)化石能源日益枯竭,尋找新的可勻后取1mL培養物接種到含有40mL篩選培養基的再生替代能源就成為全世界最關(guān)注的熱點(diǎn)。乙醇是血清瓶中,以合成氣為唯一碳源,37℃厭氧靜止培養種優(yōu)質(zhì)的液體燃料,單位質(zhì)量的乙醇完全燃燒時(shí)可30d,取有生長(cháng)趨勢的培養物,稀釋1×10°倍后接種釋放約30KJ的熱量,是目前為止最有效的化石能源到新鮮的篩選培養基中,重復培養30d,重復以上步替代品。目前,燃料乙醇的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成驟3次后,取培養物稀釋1×10°倍后涂布于固體與微生物發(fā)酵兩種方式,化學(xué)合成法主要是乙烯直接CLM培養基上,以果糖為唯一碳源,37℃厭氧靜止培水合法;微生物發(fā)酵法主要有以糖質(zhì)原料和淀粉質(zhì)原養3d后,挑取單克隆于液體CLM培養基中,以果糖料為底物直接發(fā)酵和以纖維素原料水解發(fā)酵兩種方為唯一碳源,37℃厭氧靜止培養24~36h,用甘油保式。利用微生物發(fā)酵合成氣生產(chǎn)乙醇是以生物質(zhì)為存菌種。原料生產(chǎn)乙醇的新工藝,即先將生物質(zhì)完全氣化生1.3菌株的鑒定成以CO、CO2、H2、N2等為主要成分的生物合成氣提取菌株基因組DNA,PCR擴增16 SrrnA(引再利用一些特殊的微生物將合成氣轉化為乙醇,該新物27f: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492r工藝發(fā)酵條件簡(jiǎn)單,原料來(lái)源廣泛,且大大降低了廢 TACGGCTACCTTGTTACGACTT),送上海生工液廢渣的排放(2,屬于環(huán)保型新技術(shù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)測序公司測序展】20世紀80年代以來(lái),國外研究人員相繼在雞糞、1.4菌株生理生化分析兔糞等動(dòng)物糞便以及農業(yè)泄湖、沼氣池中發(fā)現了一些菌株生理生化分析的具體方法參見(jiàn)文獻[13]可利用合成氣生產(chǎn)乙醇的菌株,主要研究的微生1.5菌株生長(cháng)曲線(xiàn)的測定物有以下幾種: Clostridium ljungdahlii,分別挑取 Clostridium ljungdahliz單菌落于Clostri -dium autoethanogenum, Moorella thermoRCM培養基和CLM培養基中,37℃厭氧靜止培養philic sp. HUC22-1, Clostridium scatologene24h,次日按1%的接種量接種于10 mL RCM培養基rain SI17, Clostridium carboridivorans p7,這和CLM培養基中,以果糖為唯一碳源,37℃厭氧靜些菌株都是嚴格厭氧菌,可以在高濃度合成氣條件下止培養至OD6≈0.2時(shí),按2%的接種量接種到生長(cháng)并產(chǎn)生乙醇?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,國內尚未見(jiàn)50mL的相應培養基中,37℃厭氧靜止培養50h,每有關(guān)利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)乙醇菌株的相關(guān)報道?！緮M2~4h取樣檢測OD。值。解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從廣西象州家禽養殖場(chǎng)、沼氣池等1.6菌株初步發(fā)酵實(shí)驗地采集到的雞、牛等動(dòng)物糞便中篩選到1株能夠利用挑取 Clostridium ljungdahliz單菌落于CLM合成氣生產(chǎn)乙醇的菌株,對其進(jìn)行生理生化分析及初培養基中,以果糖為唯一碳源,37℃厭氧靜止培養步發(fā)酵實(shí)驗,摸索菌株的生長(cháng)發(fā)酵條件,為工業(yè)化發(fā)24h,按1%的接種量接種于10 mL CLM培養基中,酵合成氣生產(chǎn)乙醇提供理論依據。以果糖為唯一碳源,37℃厭氧靜止培養至OD。材料與方法0.6時(shí),按5%的接種量接種到發(fā)酵培養基中,抽出空氣,充入合成氣,密封血清瓶后,37℃厭氧靜止培養1.1材料30d,每3~7d補氣1次樣品:( ostridium ljungdahlii由本研究篩選1.7乙醇測定獲得。用注射器抽取2.5mL發(fā)酵液,12000r/min離心培養基:本研究所用培養基參考文獻[5~12],略10min,取上清,以0.1%的乙腈為內標,氣相檢測乙有修改醇產(chǎn)量,根據乙醇和乙腈峰面積比計算乙醇含量。合成氣:購自南寧國信氣體有限公司,含73%哼含量(g/L)=(乙醇峰面積/乙腈峰面積)CO,10%CO2,15%H2,2%CH4,或者80%H2,20%1中國煤化工,根據同一條件下測定乙醇CNMHG程求得。1.2菌株的富集與篩選測定乙醇含量采用 Agilent technolog在厭氧條件下稱(chēng)取1.0g新鮮的動(dòng)物糞便,溶于 GC system氣相色譜,檢測器采用FID,柱型號:Agil0mL富集培養基中,37℃厭氧靜止培養24~48h,搖 lent ZB- WAXPLUS Zebron30.0m×250μm廣西科學(xué)2014年4月第21卷第2期1250.3m,載氣為氮氣,載氣流率20mL/min,氫氣流率40mL/min,分流比1:50,色譜進(jìn)樣口和柱子的溫度分別為250℃和100℃。R2結果與分析菌株鑒定結果提取菌株基因組DNA后,PCR擴增16SrRNA,測序結果經(jīng) Genebank比對,比對結果(表1)顯示與 Clostridium ljungdahlii同源性為99%,可圖2革蘭氏染色后鏡檢結果以初步判定該菌株為 Clostridium ljungdahliFig 2 Electron microscopy of the strain after gram staining表1菌株16 S rrNA片段序列比對結果表2不同酵母粉含量對菌株生長(cháng)的影響Table 2 Effect of different yeast powder on strain growthTable 1 Comparison of 16s rRNA sequence of strain by sequencing and blast analysis碳源酵母粉 Yeast extract(%)編號基因文庫編號最相似菌株相似度00.020.040.060.080.10.20.5No. Genbank accessioMost similar strain Maximumdentity (%o)不添加果糖NR_074161.1jungeWithout fructose+:生長(cháng);一:不生長(cháng);w:微弱生長(cháng)。+: Positive growth;-:No(2)維生素B族及氨基酸Clostridiun3Y18178,1autoethanogenum99從表3可以看出, Clostridium ljungdahlii菌株p.10061在添加維生素B族的條件下生長(cháng)良好,在添加氨基2.2菌株生理生化分析酸的條件下生長(cháng)很微弱,因此可以初步判定維生素B族是 Clostridium jun gdahlii生長(cháng)必須因子,氨基2.2.1菌落特征起有光澤。顯微鏡下呈棒狀或短桿狀,有運動(dòng)性,芽的傳“ ridium l1 ngdahlii的生長(cháng)不起到?jīng)Q定性酸對Cl菌落為白色或灰白色,邊緣呈不規則狀,中間凸表3維生素B族及氨基酸對菌株生長(cháng)的影響孢很少見(jiàn),嚴格厭氧菌,革蘭氏染色后顯紫色(圖1和 Table3 Effect of b-Vitamins and amino acid on strain growtl圖2),表明為革蘭氏陽(yáng)性菌,與文獻[5]的報道一致。添加情況維生素B族氨基酸Adding conditionvitamin solution Amino acid solution加 Adding不添加 Without add+:生長(cháng);一:不生長(cháng);w:微弱生長(cháng)。+: Positive growtgrowth: w: Weak growth.(3)可用碳源從表4可以看出, Clostridium ljungdahlii在CLM培養中可以利用合成氣、木糖、果糖、阿拉伯糖丙酮酸鹽及乙醇作為碳源,生長(cháng)良好,果糖生長(cháng)最快,圖1顯微鏡下菌體情況而葡萄糖為唯一碳源時(shí)生長(cháng)非常緩慢。Fig 1 Electron microscopy of the strain2.2.3菌株最適生長(cháng)條件2.2.2菌株生長(cháng)必須因子圖3和圖4表明,菌株的最適生長(cháng)溫度為35(1)酵母粉37℃H值為6.0~7.0從表2可以看出, Clostridium ljungdahlii菌株2.2中國煤化工的生長(cháng)需要酵母粉,當酵母粉含量低于0.06%時(shí),在CNMHO空氣含量為0.1%或含有碳源的條件下,菌株也不生長(cháng);但當酵母粉含量0.2%時(shí),菌株可以生長(cháng);當空氣含量為0.5%時(shí),菌大于等于ω.2%后,即使不另外添加碳源也能微弱生株微弱生長(cháng);當空氣含量為0.75%或1.0%時(shí),菌株長(cháng),所以酵母粉使用量控制在0.1%不生長(cháng)。這表明當空氣含量低于0.2%時(shí),菌株能正126Guangxi Sciences, Vol 21 No. 2. April 2014常生長(cháng);當空氣含量超過(guò)0.75%時(shí),菌株生長(cháng)受到抑長(cháng)狀況有較大差異,在RCM培養基中生長(cháng)迅速,且制,不能正常生長(cháng)菌體密度大,在CLM培養基中生長(cháng)相對緩慢,且菌表4 Clostridium Ijungdahlit在單一碳源下的生長(cháng)狀況體密度低,其原因是由于RCM培養基是完全培養Table↓ Growth of Clostridium ljungdahlii on substrates as基,營(yíng)養豐富更適合菌株的生長(cháng)復蘇the sole carbon碳源生長(cháng)狀況‖碳源生長(cháng)狀況CarbonGrowthsourcesituatsituation成氣 SyngeCO2/H2木糖 Xylose+‖果糖 Fructose阿拉伯糖 Arabi葡萄糖 Glucose蔗糖 Sucrose甘油 GlycerolL-乳酸鹽 L-lactate丙酮酸鹽 Pyruvate檸檬酸鹽 Citrate麥芽糖 Maltose時(shí)間 Time( h)甲醇 Metha乙醇 Ethanol圖5 Clostridium Ljungdahlii生長(cháng)曲線(xiàn)淀粉 Starch山梨醇 Sorbitolig. 5 Growth curve of Clostridium ljungdahli乳糖 Lactose●:RCM,:CLM生長(cháng);一:不生長(cháng);w:微弱生長(cháng)。十: Positive growth;-:No2.4合成氣發(fā)酵乙醇的初步實(shí)驗rowth: w: Weak growth氣相色譜檢測結果(圖6)顯示,發(fā)酵液中有乙醇生成,乙醇產(chǎn)量在0.68~2.58g/L之間,其中20mL0.75血清瓶中幾乎沒(méi)有乙醇生成,250mL血清瓶中普遍較高,推測血清瓶體積越大,所能容納的合成氣越多,乙醇產(chǎn)量越高。0.15H值 pH val圖3 Clostridium ljungdahlii最適pH值Fig 3 Optimum pH of Clostridium ljungdahliiy0.5清瓶體積 volume of serum bottle ml.)圖6乙醇產(chǎn)量分析2.5乙醇產(chǎn)量?jì)?yōu)化實(shí)驗從表5可以看出,添加BESA、莫能菌素及丁基3942濕度 Tcmpcraturc(℃")橡膠顆粒后,乙醇平均產(chǎn)量均有所提高,分別提高了圖lostridium ljungdahlii最適生長(cháng)溫度49%、70%、4.3%,其中莫能菌素提高最多,BESA次Fig 4 Optimum temperature of Clostridium ljungdahlii之,丁基橡膠顆粒最低,這是由于莫能菌素和BESA2.3 Clostridium Ljungdahlii生長(cháng)曲線(xiàn)都可以抑制甲烷的生成,促進(jìn)乙醇和乙酸的生成,而按照1.7方法測定 Clostridium lun gdahlit在丁基橡膠顆粒的主要作用是吸附氣體,提高氣體在培不同培養基中的生長(cháng)曲線(xiàn),結果(圖5)表明,在RCM養基中的溶解度,從而提高乙醇的產(chǎn)量,但是由于發(fā)培養基中,菌株幾乎沒(méi)有延滯期,2h后菌株ODs達酵過(guò)程是靜止的,丁基橡膠顆粒大多沉到底部,導致到0.2,然后迅速進(jìn)入對數期,28h后生長(cháng)速度開(kāi)始減吸附氣體量減少,對乙醇產(chǎn)量提高所起的作用不大。緩進(jìn)入穩定期,OD。。最大值達到1.93左右;而Clostridium ljungdahlia在CLM培養基中,前28h菌株幾乎不生長(cháng),20h左右,OD6達到0.2,24TYH中國煤化工CNMHG中篩選到1株可以發(fā)38h內為菌株生長(cháng)的對數期,4h后菌株生長(cháng)趨于穩酵合成氣生產(chǎn)乙醇的菌株,經(jīng)菌株生理生化分析以及定,OD6最大值達到0.89。從結果中可以看出,16 SrrNA鑒定為 Clostridium ljungdahlii,我們利Clostridium ljungdahlii在兩種不同培養基中的生用 Clostridium ljungdahlii進(jìn)行了合成氣發(fā)酵乙醇廣西科學(xué)2014年4月第21卷第2期表5添加BESA、莫能菌素和丁基橡膠顆粒對乙醇產(chǎn)量的影forward for biofuels and biomaterials[J]. Science, 2006響(g/L311(27):484-489Table 5 Effect of adding BESA, monensin and butyl rubber[3] Vega J L, Prieto S, Elmore BB, et al. The biological prarticles on yield of ethanol (g/L)duction of ethanol from synthesis gas[J]. Appl BiochemBiotech,1989,20-21(1):781-797添加情況BESA素橡膠顆粒Adding condition[4 Hurst K M, Lewis R S Carbon monoxide partial pres-particles'e effects on the metabolic process of syngas fermen-添加 Addingtation[J. Biochem Eng J, 2010, 48(2): 159-165不添加 Without adding2.54[5 Gaddy J L, Clausen E C. Clostridium ljungdahlii,ananaerobic ethanol and acetate producing microorganism的初步實(shí)驗,實(shí)驗結果顯示該菌株能夠在以合成氣為US,5173429[P].1992-12-22唯一碳源的培養基中生長(cháng)并產(chǎn)生乙醇,經(jīng)30d血清瓶[61Skis, Nakashimada y. Yoshimoto. Ethanol producion from H2 and CO2 by a newly isolated thermophilic發(fā)酵,乙醇產(chǎn)量達到2.58g/L,添加BESA、莫能菌bacterium, Moorella sp. HUC22-1 [J]. Biotechnology素、丁基橡膠顆?？梢苑謩e使乙醇產(chǎn)量提高49%Letters,2004,26:1607-1612.70%、4.3%,最高產(chǎn)量達到4.31g/L。[7 Kusel K, Dorsch T, Acker G, et al. Clostridium scate在實(shí)驗過(guò)程中,研究發(fā)現不同組分含量的合成氣logenes strain SLI isolated as anacetogenic bacteriumfrom acidic sediments [J. Int J Syst Evol Microbiol會(huì )導致乙醇產(chǎn)量的不同14,同時(shí)合成氣中除了CO2000,50:537-54CO2、H2等主要成分外,還含有硫化氫、焦油、NO等[8] Gaddy j1L,ArkF. Biological production of ethanol from不可利用的有毒有害氣體,也會(huì )在發(fā)酵過(guò)程中影響菌waste gases with Clostridium ljungdahlii: US, 6136577株的生長(cháng)和代謝。另外,發(fā)酵產(chǎn)物檢測結果顯示,菌[P].2000-10-24株發(fā)酵合成氣最主要的產(chǎn)物是乙酸和乙醇,當pH值9 Najafpour G, Younesi H. Ethanol and acetate synthesisfrom waste gas using batch culture of Clostridium為4~5時(shí),發(fā)酵主產(chǎn)物是乙醇,當pH值為6~7時(shí)Ljungdahlii [J]. Enzyme and Microbial Technology發(fā)酵主產(chǎn)物是乙酸,然而( lostridium ljungdahli2006,38:223-228最適pH值是6~7,pH值過(guò)低會(huì )影響菌株的生長(cháng),[10 ounesi H, Najafpour G, Mohamed r. Ethanol and實(shí)驗結果也表明在pH值為4~5范圍內,單位菌體acetate production from synthesis gas via fermentationprocesses using anaerobic bacterium, Clostridium密度的乙醇產(chǎn)量更高,但是由于菌株生長(cháng)受到抑制,Ljungdahlii [J]. Biochemical Engineering Journal導致乙醇總產(chǎn)量較低。因此,提高菌株的耐酸性也是2005,27后續研究過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。此外,合成氣的通11 CotterS. Chinn m s. Grunden a m. Ethanol and ac入方式也是制約乙醇產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵因素,本研究主etate production by Clostridium ljungdahlii andClostridium autoethanogen um using resting cells[J]要采用間隙補氣,無(wú)法保證穩定的氣壓和氣液接觸Bioprocess biosyst Eng, 2009,32: 369-380影響了菌株的轉化效率,致使乙醇產(chǎn)量保持在一個(gè)較[12] McInerney M J, Bryant M F, Pfennig n. Anaerobic bac.低的水平。 Vel berzin等1采用高壓連續通氣法,乙terium that degrades fatty acids in syntrophic associa醇產(chǎn)量最高達到27.2g/L,這也為我們的后續發(fā)酵實(shí)tion with Methanogens[J]. Arch Microbiol, 1979, 122129-135驗提供了新的思路13]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊[M].北京:科本研究結果表明,利用( clostridium ljungdahlii學(xué)出版社,2001發(fā)酵合成氣生產(chǎn)乙醇的工藝是可行的,但由于受到菌ong x Z, Cai M Y Scientific identification manual of株生長(cháng)條件、合成氣組分以及發(fā)酵設備等條件的限comom acteria[M]. Beijing: Science Press, 2001前乙醇產(chǎn)量還很低。在接下來(lái)的工作中,將主[141LiK, Atiyeh K, Tanner R s, et al. Fermentativeduction of ethanol from syngas using novel moder要著(zhù)力于改進(jìn)發(fā)酵設備以及利用分子手段改造菌株ately alkaliphilic strains of Alkalibaculum bacchi [J兩方面,以期獲得一種高效、快速、環(huán)保的乙醇生物發(fā)Bioresour technol. 2012.104: 336-341酵新工藝[15 Berzin V, Kiriukhin M. Tyurin M. Elimination of ace-參考文獻:中國煤化工H501 Appl Biochem[1 Klasson K T Ackerson M D Bioconversion of synthesisCN MH G8-34'gas into liquid or gaseous fuels[J]. Enzyme microbiolgy Technology, 1992, 14: 602-608(責任編輯:陳小玲)[2 Ragauskas A J. Williams C K, Davison B H. The path128Guangxi Sciences, Vol 21 No. 2. April 2014