石榴葉乙醇水提取物的抑菌殺蟲(chóng)活性研究

第13卷第2期濰坊學(xué)院學(xué)報VoL 13 No. 22013年4月Journal of Weifang UniversityApr.2013石榴葉乙醇水提取物的抑菌殺蟲(chóng)活性研究王東方12,谷鵬2,柏顯首12,王慶忠,2(1.山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室,山東濰坊261061;2.濰坊學(xué)院,山東濰坊261061)摘要:用索氏提取法以乙醇水加熱提取石榴葉的有效成分,并對提取物的抑菌作用和對果蠅與槐蚜觸殺活性進(jìn)行了探究。結果表明,石榴葉提取物對革蘭氏陽(yáng)性菌(白色葡萄球菌)有明顯抑制作用,其有效抑菌濃度值為40mg/mL;對果蠅的藥理作用明顯,數據變化顯著(zhù),有上升趨勢;對槐蚜有明顯的觸殺活性,其LC50為.10.4203mg/mL。因此,石榴葉提取物對革蘭氏陽(yáng)性菌及昆蟲(chóng)有良好的抑菌殺蟲(chóng)效果關(guān)鍵詞:石榴葉;提取物;生物活性;細菌;果蠅中圖分類(lèi)號:S482.1文獻標識碼:A文章編號:1671-4288(2013)02-0044-04石榴葉為石榴科植物石榴( punica granatum L)的葉。石榴葉具有收斂止瀉、解毒殺蟲(chóng)功效,主治泄瀉、痘風(fēng)瘡、癩瘡、跌打損傷,在埃及作為傳統的藥材。以前的研究表明,科學(xué)研究者對石榴葉化學(xué)成分進(jìn)行了許多研究,取得了較大進(jìn)展,石榴葉中含有20多種化合物,包括熊果酸、白果酸、白樺脂酸、甘露醇、菟資單寧、鞣花單寧以及黃酮苷類(lèi)等。石榴葉水浸劑能顯著(zhù)增強大鼠胃蛋白酶活性,促進(jìn)膽汁分泌,并可以加強大鼠小腸蠕動(dòng);能顯著(zhù)抑制大鼠胃液分泌和總酸排出量12。研究還觀(guān)察到石榴葉水浸劑對大鼠試驗性胃潰瘍的作用,能顯著(zhù)降低大鼠胃潰瘍發(fā)生率,并減少胃潰瘍面積和降低胃潰瘍程度。石榴葉水提取物在調節血脂清除氧自由基等方面也有活性,具有調脂作用的活性成分是石榴葉鞣質(zhì),在體外試驗中,石榴葉鞣質(zhì)能明顯抑制還原酶活性,石榴葉鞣質(zhì)的效價(jià)較辛伐他汀強100倍左右,同時(shí)也提示了石榴葉鞣質(zhì)降低膽固醇的作用機制,部分與抑制該酶活性有關(guān)3;鞣質(zhì)能凝固微生物體的原生質(zhì)及多種酶因而對各種細菌和真菌有抑制作用。臨床研究已經(jīng)證實(shí)石榴皮對淋球菌有明顯的抑制作用。但石榴葉提取物的抑菌殺蟲(chóng)活性未見(jiàn)報道。本研究用乙醇水提取石榴葉的有效成分,并對其生物活性進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1材料與儀器石榴葉采集于濰坊學(xué)院校園內;大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)和白色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)菌株取自濰坊學(xué)院生物與農業(yè)工程學(xué)院微生物實(shí)驗室,菌種斜面培養進(jìn)行繁殖;成年雌雄黑腹果蠅取自遺傳實(shí)驗室后在微生物實(shí)驗室內擴代培養了;槐蚜采集于濰坊學(xué)院校內。主要儀器有800A型中藥粉碎機(青州市精誠醫藥裝備制造有限公司)、RE-5299旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-IA循環(huán)水真空泵(上海一凱設備有限公司)、CJ一1680型超凈工作臺,YsQ.SG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋、低溫冰箱、指形管等。主要試劑有乙醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))、二甲基亞砜(DMSO)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)鏈霉素、青霉素;牛肉膏、蛋白胨、瓊脂;蔗糖Nac、甲醇、HCl、NaOH等。以上藥品均為AR級。1.2石榴葉提取物的制備石榴葉經(jīng)清洗和晾干;烘箱中65℃烘干后,用中藥粉碎機粉碎15~30s;稱(chēng)取100g粉末置入索氏提取裝置的燒瓶中,加入75%乙醇500ml,在電磁恒溫攪拌器上攪拌煮沸回流萃取2h;真空抽濾后用旋轉蒸發(fā)儀40℃濃縮至干;稱(chēng)重后用10%DMSO配制成配制成濃度為60mg/ml儲存液備用。*收稿日期:2013-01-12基金項目:山東省自然科學(xué)基金(zRc05);濉坊市科技發(fā)展計V中國煤化工學(xué)術(shù)團隊項(2010Z03)CNMHG作者簡(jiǎn)介:王東方(1970-),男,山東昌樂(lè )人,濉坊學(xué)院生物與農業(yè)工程學(xué)院副教授。研究方向:微生物生理生化功能配合物化學(xué)。第2期王東方,谷鵬,柏顯首,王慶忠:石榴葉乙醇水提取物的抑菌殺蟲(chóng)活性研究1.3石榴葉提取物的抑菌活性測定將培養基制成平板,細菌用牛肉膏蛋白胨培養基。用無(wú)菌生理鹽水把各種菌種(大腸桿菌和白色葡萄球菌菌種配制成106~103個(gè)/L孢子懸液吸取0.2mL孢子懸液均勻涂抹到滅菌平板上。用10%DMSO將石榴葉提取物配制成濃度分別為10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L60mg/L的溶液。將直徑約0.4cm濾紙圓片置于各質(zhì)量濃度的溶液中浸泡將浸漬過(guò)提取物溶液的濾紙片風(fēng)干,放到每個(gè)涂有菌液的平板上,等距離放4片,每個(gè)試驗平行3次,文中所列數據為平均值。細菌培養在37℃下24h。測定抑菌圈直徑大小,并用無(wú)菌水作空白對照(以CK表示),以直徑大于1.00cm為有效果來(lái)確定抑菌效果∽。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行用10%DMSO分別配制鏈霉素、青霉素各濃度。鏈霉素:30u/mL、50u/mL、80u/mL、100u/mL、150u/mL、200u/mL;青霉素:10mg/L、1mg/L、10-1mg/L、10-2mg/L、10-3mg/L。作為參照,將直徑約0.4cm濾紙圓片置于各質(zhì)量濃度的溶液中浸泡將浸漬過(guò)提取物溶液的濾紙片風(fēng)干,放到每個(gè)涂有菌液的平板上,等距離放4片,每個(gè)試驗平行3次,文中所列數據為平均值。細菌培養在37℃下24h。測定抑菌圈直徑大小,并用無(wú)菌水作空白對照(以CK表示),以直徑大于1.00cm為有效果來(lái)確定抑菌效果。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行71.4石榴葉提取物對果蠅的毒理活性測定研究石榴葉提取物對果蠅的影響方案常采用棉球飼喂法③(1)配制果蠅培養基,飼養繁殖黑腹果蠅。(2)供試飼養液的制備:用2%的蔗糖水溶液作為對照培養液;在2%的蔗糖水溶液中加入不同量的石榴葉提取物,配制成一定濃度梯度:1、2、3、4、5及10mg/ml。(3)果蠅毒性試驗:供試果蠅為黑腹果蠅成蟲(chóng)用乙醚麻醉后,饑餓5~6h后飼以不同濃度的供試溶液,準備10個(gè)指形管,每指形管中放置一個(gè)0.2g的脫脂棉球,棉球上蘸有大約2.5mL飼養液,各指形管中接入大約25頭果蠅,設置5次重復,用2%的蔗糖水溶液作為對照組,所有的指形管置于溫度25℃、相對濕度為50~60%光照周期為12D/12L的培養箱中,連續飼養4d,每12~13h記錄各處理的死亡果蠅數,4d統計匯總各組果蠅死亡數1.5石榴葉提取物對槐蚜的殺蟲(chóng)活性測定石榴葉提取物的殺蚜活性測定采用室內葉片法。采集蟲(chóng)口密度大的國槐枝葉帶回實(shí)驗室,選擇帶蚜葉片,剔除不合格的蟲(chóng),以大小適中的健康無(wú)翅成蚜為試蟲(chóng),并將帶蟲(chóng)葉片修剪為每片25頭蟲(chóng)左右,置于鋪有濾紙的培養皿中。用10%DMsO水溶液梯度稀釋石榴葉提取物儲存液,并噴灑于各個(gè)試驗皿中,以10%DMSO水溶液作為對照,然后置于溫度為25℃、濕度為80%的培養箱內培養,24h后統計蚜蟲(chóng)死亡率。每濃度3次重復,死亡率以3次重復的平均值計。0死亡率(%)=過(guò)電死數×100校正死亡率%)=處理組死亡率2)元對組死亡率×1002結果2.1石榴葉提取物對魄葡萄球菌有攝制活性通過(guò)對圖1、2和3的分析,可以看出,提取物的成分與青霉素的效果相似,對白色葡萄球菌(即革蘭氏陽(yáng)性菌)有明顯攝制活性,而對大腸杄菌(即革蘭氏陰性菌)無(wú)明顯效果。不同鏈霉素濃度下抑菌圈大小驅1←大腸桿菌白色葡萄球菌中國煤化工0305080100150200鏈霉素濃度CNMHG圖1提取物的抑菌效果濰坊學(xué)院學(xué)報2013年4月不同鏈霉素濃度下抑菌圈大小2長(cháng)遙景大腸桿菌白色葡萄球菌200鏈霉素濃度圖2鏈霉素的抑菌效果不同青霉素濃度下抑菌圈大小21.5大腸桿菌白色葡萄球菌0.5000.0010.010青霉素濃度(mgm)圖3青霉素的抑菌效果2.2石榴葉提取物對果蠅有很強的觸殺活性由圖4可以看出,提取物對果蠅有很好的觸殺作用,濃度越高,死亡數越多。其觸殺作用的毒力回歸方程Y=0.95515x+10.07,相關(guān)系數為R2=0.9635,其LC50=52.36mg/mL。095515x+1007R0963524h累計死亡率(線(xiàn)性②4累計光亡率2010提取物濃度(mgm)圖4不同濃度下的死亡率圖2.3石榴葉提取物對槐蚜的殺蟲(chóng)活性測定結果由表1可以看出,提取物對槐蚜有很好的觸殺作用,20~40mg/mL時(shí),校正死亡率達到89.52%;當濃度為60mg/mL時(shí),校正死亡率達到96.72%。其觸殺作用的毒力回歸方程Y=-21.28x+120.71,相關(guān)系數為R2=0.864,LC為10.4203mg/mL。表1石榴葉提取物對槐蚜的觸殺作用(士SEMn=4提取液濃度/mg·mL124h死亡率/%24h校正死亡率/%96.84±1.26.7295.07±1.9486.3士1.277.4±1.438.9士2.1440.35對照3.6士1.74中國煤化工注:△表示與對照組比較差異顯著(zhù)(P<0.05)CNMHG討論石榴葉提取物對革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑菌效果,對革蘭氏陰性菌效果不明顯;提取物對黑腹果蠅成第2期王東方,谷鵬,柏顯首,王慶忠:石榴葉乙醇水提取物的抑菌殺蟲(chóng)活性研究蟲(chóng)有明顯毒害作用,且毒性效果與濃度呈正相關(guān),可用作除蠅成分。提取物對槐蚜有明顯的防治效果,60mg/m1提取物24h后的防治效果達96.72%與目前使用的化學(xué)農藥吡蟲(chóng)啉的防治效果相比無(wú)顯著(zhù)差異(P<0.05)石榴是我國重點(diǎn)發(fā)展的經(jīng)濟水果之一,在我國各地均有栽培種植面積正大規模發(fā)展。但是在很多地區石榴葉僅作為茶葉飲用,這就造成了嚴重的資源浪費。在今后,社會(huì )應進(jìn)一步加強石榴葉的藥理活性成分研究,為臨床研制出一個(gè)新的有效天然藥物為天然性新藥的開(kāi)發(fā)打下良好基礎12。石榴葉越來(lái)越明確的藥理作用已經(jīng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注,相信隨著(zhù)對天然性藥物研究的深入,必將擁有一個(gè)更加明亮的開(kāi)發(fā)前景參考文獻[1]周建華,胡建平.石榴生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[門(mén).中國釀造,2008,(14):42-44.[2]雷帆,邢東明,向蘭,等,石榴葉提取物中鞣花酸在大鼠體內藥物動(dòng)力學(xué)研究[門(mén)].藥品評價(jià),2005,2(1):38-41[3]鄧文龍,王浴生,中藥藥理與應用[M.2版.北京:人民衛生出版社,1998[4]趙彥君,師寶君,胡兆農.杠柳毒素NW殺蟲(chóng)活性[.昆蟲(chóng)知識,2008,45(6):950-952[5]張羽飛,于春麗,張春枝.乙醇室溫浸提法提取黃芩總黃酮的工藝條件[]大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2004,23(3):190-193[6]周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗手冊[M].上海:上?？萍汲霭嫔?1987[7付良臣,孟昭禮.柳樹(shù)中用抑菌活性物的初步研究[.當代生態(tài)農業(yè),200521(21):113-114[8]王菊鳳,李鵠鳴.蛹蟲(chóng)草多糖對果蠅壽命影響的研究[].中國野生植物資源,2008,27(3):38-4[9]楊冬梅,陳玲,龍燦,等.北冬蟲(chóng)夏草提取液對果蠅繁殖力及壽命的影響[].湖南農業(yè)科學(xué),2012,(6):87-89[10]王慶忠,王東方,王漢海,等.番茄莖葉乙醇水提取物對槐蚜的生物活性研究[J].北方園藝,2012,(24):147-148[11]劉月,霍清,張盛字,等.爽椿葉提取液對蚜蟲(chóng)防治效果的研究[].北方園藝,2009,(9):94-95[12]衛天星,郭小俠,甘賴(lài)麗.西安市行道樹(shù)主要害蟲(chóng)發(fā)生規律及防治研究[J.陜西師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,增刊93-95The Study of the Ethanol Antimicrobial, Insecticidal BiologicalActivity of the ethanol and water Extract of Pomegranate leafWANG Dong-fang 1.2], GU Peng 1. 2, BAI Xian -shou L1.2), WANG Qing-zhong 1.23(l. Key Laboratory of biochemistry and molecular biology in university of Shandong province,Weifang 261061, China; Weifang University, Weifang 261061, China)Abstract: In present study, the active ingredient was extracted from pomegranate leaf by Soxhlet extraction method with ethanol and water solution accompanied by heating, and the activity of extract against bacteria, Drosophila melanogaster andAleurocanthusspiniferus were studied. The results showed that the pomegranate leaf extract have significantly suppress ofGram-positive bacteria(Staphylococcus albus), the effective inhibitory concentration value ia 40 mg/ml; and it has obvious-ly pharmacological effect on Drosophila with data changes, and rising: With pharmacological effects Cassia aphids value, itsLC50 is 10. 4203 mg/mL Therefore, the pomegranate leaf extract is good antibacterial insecticidal effect on gram-positiveKeywords: pomegranate leaf, extract, biological activity, Bacterial, drosophilas(責任編輯:劉乃生)中國煤化工CNMHG